響應(yīng)面法優(yōu)化棗渣總?cè)铺崛」に嚰捌淇寡趸⒖乖鲋郴钚?/h1>
2022-06-14 08:21:26陳楠吳瀟霞白冰瑤陳計(jì)巒
食品研究與開(kāi)發(fā) 2022年10期
陳楠，吳瀟霞，白冰瑤，陳計(jì)巒*
（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）
紅棗原產(chǎn)于中國(guó)，距今已有4 000多年的歷史[1]。我國(guó)紅棗種植面積較廣，產(chǎn)量居世界第一[2]，主要分布于新疆、河北和陜西等地。新疆由于降雨量少，日照充足，有利于紅棗中糖分的積累[3-4]。紅棗具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[5]，其不僅有較強(qiáng)的抗氧化能力[2]，還具有抗癌、保肝護(hù)肝、美容養(yǎng)顏等功效[6]。許多研究表明，紅棗具有多種功效的原因是棗肉和棗皮中含有多種化學(xué)成分，包括三萜類化合物、多酚、礦物質(zhì)、氨基酸和多糖等[7]。
目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)紅棗的研究主要集中于多糖等功能成分的提取分析，對(duì)紅棗中總?cè)频奶崛〖翱寡趸涂乖鲋郴钚詧?bào)道較少。三萜類化合物具有良好的抗腫瘤作用[8]，可應(yīng)用于食品或制藥行業(yè)中[9]，提高紅棗產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益[10]。
棗渣是三萜類化合物的良好來(lái)源[11]，但在紅棗加工過(guò)程中常被當(dāng)作廢棄物直接丟棄或掩埋，這種處理方式不僅會(huì)造成三萜類化合物的浪費(fèi)，還會(huì)造成環(huán)境污染[12-13]。因此，為了提高棗渣的利用率，充分挖掘其潛在價(jià)值，本試驗(yàn)將超聲輔助技術(shù)應(yīng)用于棗渣總?cè)频奶崛。⑼ㄟ^(guò)響應(yīng)面法對(duì)棗渣中總?cè)频奶崛l件進(jìn)行優(yōu)化并研究其抗氧化和抗增殖活性，為棗渣的深度利用提供參考依據(jù)，提高廢物資源利用率。
1 材料與方法
1.1 材料、試劑與設(shè)備
1.1.1 棗渣的制備
棗（Ziziphus jujuba Mill.cv.Junzao）：市售。棗用去離子水清洗后，去核，搗碎，分離棗渣并凍干，-18℃保存，以備進(jìn)一步試驗(yàn)。
1.1.2 試劑
2，2'-偶氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6）磺酸（2'-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）、2，2-二苯基-1 苦基肼 （1，1-diphenyl-2-picryl Hydrazyl，DPPH）、抗壞血酸：北京索萊寶有限公司；齊墩果酸、熊果酸、白樺脂酸、麥珠子酸、山楂酸：上海安普實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基：美國(guó)GIBCO公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美國(guó) Sigma-Aldrich公司。
1.1.3 儀器與設(shè)備
XS-O4多功能粉碎機(jī)：上海兆中科技有限公司；DZKW-D2恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；BGZ-246電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；超聲清洗槽（SK5200GT）：上?？频纼x器有限公司;TDL-4A低速多管大容量離心機(jī)：上海非恰爾分析儀器有限公司；搖床（SHZ-A）：常州諾佳儀器有限公司；JO-060S超聲波清洗機(jī)：深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；LE-203E電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；J6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；Synergy H1多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)博騰儀器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 超聲輔助提取（ultrasonic-assisted extraction，UAE）
精密稱取一定量紅棗渣凍干粉，置于錐形瓶中，分別設(shè)置不同提取溫度、提取時(shí)間、液固比和乙醇濃度對(duì)棗渣樣品（2.5 g）中的三萜進(jìn)行超聲輔助提取，收集濾液，并用相同體積的溶劑重復(fù)萃?。?個(gè)循環(huán)），合并濾液，濃縮并冷凍干燥。
1.2.2 常規(guī)振動(dòng)提取（conventional vibrate extraction，CVE）
將樣品（2.5 g）與 85 mL乙醇（64%，體積分?jǐn)?shù)）混合并放置在錐形瓶中，然后使用搖床進(jìn)行輔助提取。提取溫度60℃，轉(zhuǎn)速260 r/min，持續(xù)72 min，離心收集上清液，濃縮并凍干。
1.2.3 單因素試驗(yàn)
分別稱取棗渣粉末 2.5 g，設(shè)置液固比 35∶1（mL/g），乙醇濃度60%（體積分?jǐn)?shù)），超聲溫度50℃，考察超聲時(shí)間分別為 20、30、40、50、60 min 時(shí)對(duì)總?cè)坪浚╰otal triterpene content，TTC）的影響；設(shè)置超聲時(shí)間40 min，溫度 50 ℃，液固比 35∶1（mL/g），考察乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%時(shí)對(duì)總?cè)坪康挠绊懀辉O(shè)置液固比 35∶1（mL/g），超聲時(shí)間 40 min，乙醇濃度 60%，考察超聲溫度分別為 40、50、60、70、80℃時(shí)對(duì)總?cè)频挠绊懀辉O(shè)置乙醇濃度60%，超聲溫度50℃，超聲時(shí)間 40 min，考察液固比分別為 25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1（mL/g）時(shí)對(duì)總?cè)坪康挠绊憽?/p>
1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)[14]。對(duì)4個(gè)影響因素進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)，以總?cè)坪孔鳛轫憫?yīng)值，探究棗渣總?cè)频淖罴烟崛」に嚄l件。利用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行分析，建立數(shù)學(xué)回歸模型，以得到最佳提取工藝，響應(yīng)面因素與水平見(jiàn)表1。
表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology
1.2.5 總?cè)坪康臏y(cè)定
1.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
參照文獻(xiàn)[15]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性回歸方程為y=25.296x-0.011，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3。
1.2.5.2 樣品總?cè)坪康臏y(cè)定
準(zhǔn)確稱量50.0 mg齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，用60%乙醇溶液溶解，定容至50 mL，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞試管中，100℃水浴揮干，依次加入5%香草醛-冰乙酸0.4 mL，高氯酸 1.6 mL[16]。65℃水浴加熱 45 min，冷卻至室溫，用冰乙酸定容至10.0 mL，搖勻后靜置15 min。以0管為對(duì)照溶液，在548 nm處測(cè)其吸光值，按照式（1）計(jì)算總?cè)坪俊?/p>
式中：W為提取率，mg/g；c為計(jì)算的總?cè)茲舛?，mg/mL；n為稀釋倍數(shù)；v為樣品溶液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g
1.2.6 棗渣總?cè)铺崛∥锏目寡趸u(píng)價(jià)
1.2.6.1 DPPH自由基清除能力
參考文獻(xiàn)[17]的方法，分別準(zhǔn)確吸取不同濃度待測(cè)樣品2 mL，再吸取2 mL DPPH標(biāo)準(zhǔn)乙醇溶液加入到10 mL的試管中搖勻，室溫（25℃）避光30 min后在517 nm處測(cè)定吸光值。重復(fù)3次，取平均值。DPPH自由基清除能力按公式（2）計(jì)算。
式中：A0為DPPH溶液的吸光度；A1為被測(cè)樣品存在時(shí)的吸光度。
1.2.6.2 ABTS+自由基清除能力
參考文獻(xiàn)[18]略有改動(dòng)，配制ABTS工作液，分別取工作液0.5 mL于試管中，依次加入不同濃度的樣品溶液（濃度由低到高）0.5 mL，充分混合后反應(yīng)6 min，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光值。按公式（3）計(jì)算ABTS+自由基的清除能力。
式中：A1為樣品吸光度；A0為空白樣品吸光度。
1.2.6.3 羥基自由基清除能力
羥基自由基的清除能力按照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行測(cè)定。樣品配制濃度分別為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，然后各取1.0 mL分別與2 mL 9 mmol/L硫酸亞鐵溶液和2 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液混合?；旌暇鶆蚝?，加入1 mL 9 mmol/L過(guò)氧化氫溶液，37℃靜置30 min，在510 nm處測(cè)定吸光值。羥基自由基清除能力按公式（4）計(jì)算。
式中：A2為樣品吸光度；A0為空白樣品吸光度；A1為超純水代替雙氧水的吸光度。
1.2.7 抗增殖活性
采用cell counting kit-8（CCK-8）試驗(yàn)評(píng)價(jià)棗渣總?cè)瓶乖鲋承Ч549細(xì)胞于RPMI 1640培養(yǎng)基中，溫度37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞（2×104Cells/mL）在96孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，用20 μL樣品（濃度為 0、0.1、0.5、1.0 mg/mL）在溶劑（0.1% DMSO）中處理48 h[20]。每個(gè)濃度試驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率按公式（5）計(jì)算。
式中：A0為對(duì)照品的吸光度；A1為樣品的吸光度。
1.2.8 掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）分析
對(duì)干燥后的樣品表面進(jìn)行真空噴金濺射，用掃描電子顯微鏡在15 kV加速電壓下測(cè)定凍干棗渣樣品的微觀結(jié)構(gòu)。
1.3 數(shù)據(jù)處理
運(yùn)用Design-Expert V8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化處理，采用Origin2019b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并繪圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果
2.1.1 超聲溫度對(duì)總?cè)坪康挠绊?/p>
超聲溫度對(duì)總?cè)坪康挠绊懸?jiàn)圖1。
圖1 超聲溫度對(duì)總?cè)坪康挠绊慒ig.1 Effect of ultrasonic temperature on total triterpenoid content
由圖1可以得出，總?cè)频寐孰S著超聲溫度的增大而不斷增大，50℃時(shí)得率最高，為15.7 mg/g，繼續(xù)升高溫度至80℃過(guò)程中，總?cè)坪恐饾u下降。在一定范圍內(nèi)，提高超聲波溫度有利于三萜類化合物的浸出，但過(guò)高的溫度會(huì)降低三萜類化合物的穩(wěn)定性，加速破壞三萜類化合物[21]。還有一方面原因是溫度較高，溶劑揮發(fā)嚴(yán)重，其它物質(zhì)也會(huì)隨之溶出[22]。故選取超聲溫度為50℃最合適。
2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)總?cè)坪康挠绊?/p>
超聲時(shí)間對(duì)總?cè)坪康挠绊懸?jiàn)圖2。
圖2 超聲時(shí)間對(duì)總?cè)坪康挠绊慒ig.2 Effect of ultrasonic time on total triterpenoid content
由圖2可知，在超聲時(shí)間從20 min增加至40 min的過(guò)程中，總?cè)坪坎粩嘣龃螅赡艿脑蚴请S著時(shí)間的增加使得溶質(zhì)和乙醇充分接觸，三萜的提取率升高[23]；當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)，總?cè)铺崛÷首畲?，?5 mg/g；之后，隨著超聲時(shí)間逐漸增加至60 min，提取率緩慢下降，原因是細(xì)胞內(nèi)外濃度達(dá)到平衡[24]，待析出物質(zhì)減少，提取速率降低[23]。
2.1.3 液固比對(duì)總?cè)坪康挠绊?/p>
液固比對(duì)總?cè)坪康挠绊懸?jiàn)圖3。
圖3 液固比對(duì)總?cè)坪康挠绊慒ig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on total triterpenoid content
如圖 3 所示，當(dāng)液固比在 25∶1（mL/g）～35∶1（mL/g）時(shí)，總?cè)坪侩S著液固比的增大而增大，原因是一定范圍內(nèi)溶劑量的增大使得三萜類物質(zhì)能更好地釋放[25]，但當(dāng)液固比大于 35∶1（mL/g）時(shí)，總?cè)坪块_(kāi)始降低，可能的原因是溶劑用量增大，超聲波與棗渣粉之間作用減弱，導(dǎo)致總?cè)频寐氏陆礫26]?？紤]提取率及經(jīng)濟(jì)效益，選取最佳液固比為 35∶1（mL/g）。
2.1.4 乙醇濃度對(duì)總?cè)坪康挠绊?/p>
乙醇濃度對(duì)總?cè)频挠绊懸?jiàn)圖4。
圖4 乙醇濃度對(duì)總?cè)坪康挠绊慒ig.4 Effect of ethanol concentration on total triterpenoid content
由圖4可知，乙酸濃度為40%～60%時(shí)，隨著乙醇濃度的增大，總?cè)坪坎粩嘣龃?；?dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，總?cè)频寐首畲?，?4 mg/g；乙醇濃度繼續(xù)增大時(shí)，總?cè)坪块_(kāi)始下降，可能的原因是色素及親脂性強(qiáng)的成分溶出，從而導(dǎo)致棗渣總?cè)频暮拷档蚚27]。其次，總?cè)仆ǔＲ攒栈蜍赵嬖?，苷易溶于水，苷元易溶于醇，乙醇濃度過(guò)高或過(guò)低都不利于二者的充分提取[28]。
2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析
2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果
響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)軌蚩疾於嘁蜃又g的影響，得到的三維立體圖形在反映因變量變化程度的同時(shí)，通過(guò)自變量的相互影響確定因變量的最佳條件。本試驗(yàn)中，利用響應(yīng)面軟件Design-Expert V8.0.6設(shè)計(jì)四因素三水平的試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見(jiàn)表2，回歸模型方差分析見(jiàn)表3。
表2 棗渣中TTC提取的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Response surface design and results of extraction of total triterpenoids from jujube residue
表3 棗渣TTC的二次模型方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for quadratic models on total triterpenoids of jujube residue
如表2所示，棗渣提取物的TTC為8.400 mg/g～15.580mg/g，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合得到TTC含量的二階多項(xiàng)式方程：Y=12.65-1.31X1-0.11X2-0.053X3-0.30X4-0.81X1X2-0.30X1X3-0.81X1X4-0.30X2X3-0.90X2X4+0.66X3X4+0.88X12-1.67X22-1.27X32-1.11X42。
采用方差分析和決定系數(shù)（R2）來(lái)檢驗(yàn)TTC的響應(yīng)面法模型的充分性。表3顯著性結(jié)果表明，總?cè)坪康幕貧w模型差異為極顯著（P＜0.000 1），總?cè)坪颗cX1（溫度）、X3（液固比）2個(gè)因素之間的線性關(guān)系極顯著，回歸模型的失擬項(xiàng)為0.160 9，不顯著（P＞0.05）。模型的校正決定系數(shù)為0.956 6，說(shuō)明有4.34%的情況不能以此模型進(jìn)行解釋，相關(guān)系數(shù)為0.978 3，綜上，該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合程度較高，可以較為合理地表述響應(yīng)值和4個(gè)因素之間存在的線性關(guān)系。因此，該回歸方程適用于此模型。在此試驗(yàn)中，還可以通過(guò)各因素F值來(lái)推斷該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的重要性，因素的F值越大，則對(duì)該模型結(jié)果影響也越大。由表3可知，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響大小依次為X1＞X4＞X2＞X3，即超聲溫度＞乙醇濃度＞超聲時(shí)間＞液固比。
2.2.2 響應(yīng)面的分析及優(yōu)化
圖5表示各因素交互作用對(duì)總?cè)坪康挠绊?，隨著各變量的增加，總?cè)坪砍尸F(xiàn)先增大后逐漸減小的變化趨勢(shì)，說(shuō)明這些變量的交互作用對(duì)總?cè)坪康挠绊懸脖容^大，有相關(guān)研究表明，液固比和乙醇濃度是影響響應(yīng)面法提取三萜類化合物最佳工藝條件的重要因素[29]。除此之外，等高線的圖形均為橢圓形，說(shuō)明各變量的交互作用顯著[30]。
圖5 超聲時(shí)間、液固比和乙醇濃度對(duì)TTC影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Surface plot and contour plot of the effects of ultrasonic time，liquid-to-solid ratio，and ethanol concentration on total triterpenoid content
2.2.3 模型驗(yàn)證
響應(yīng)面模型優(yōu)化的最佳工藝為超聲溫度60℃，超聲時(shí)間 42.04 min，液固比 34.34∶1（mL/g），乙醇濃度63.35%，為了便于工業(yè)操作，確定的最終工藝為超聲溫度 60 ℃，超聲時(shí)間 42 min，液固比 34∶1（mL/g），乙醇濃度64%，此條件下總?cè)频寐蕿?5.854 mg/g，與模型預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差（15.799 mg/g）為0.35%。因此，該優(yōu)化提取條件是可行的，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
2.3 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果
棗渣總?cè)铺崛∥锟寡趸囼?yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。
圖6 棗渣總?cè)铺崛∥矬w外抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of total triterpenoid extract from jujube residue in vitro
由圖6可知，通過(guò)DPPH、ABTS+和羥基自由基清除活性測(cè)試，UAE提取物的IC50值分別為0.702、0.203、0.596 mg/mL，CVE 提取 物的 IC50值分別為1.000、0.665、1.043 mg/mL。在本研究中，UAE 提取物的抗氧化能力明顯高于CVE提取物，這可能是紅棗渣中富含三萜類化合物，由于超聲波的作用使其更大程度地釋放，具有更好的自由基清除活性[31-32]。此外，有報(bào)道表明酚酸中的沒(méi)食子酸也具有較強(qiáng)的抗氧化性能[33]。
2.4 抗A549細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果
CVE和UAE提取物對(duì)A549癌細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 棗渣中三萜類對(duì)A549癌細(xì)胞增殖的影響Table 4 Effect of jujube residue extract on proliferation of A549 cancer cells
如表4所示，不同濃度提取物對(duì)A549細(xì)胞的增殖率均有不同程度的抑制作用，且抑制率隨提取物濃度的增加而增加。當(dāng)濃度為1 mg/mL時(shí)，CVE和UAE的抑制率分別為27.18%和37.62%，UAE提取物的抑制率僅次于VC。相關(guān)研究表明，含有乙酰基的三萜類化合物能夠有效抑制A549癌細(xì)胞的增殖[20]。
2.5 SEM分析
原樣及兩種方式提取三萜類化合物后棗渣掃描電鏡圖見(jiàn)圖7。
圖7 棗渣掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron microscope photos of jujube residue
由圖7發(fā)現(xiàn)，不同處理方法下棗渣的微觀結(jié)構(gòu)有顯著差異。未處理的樣品表面光滑且密度大（圖7a）。CVE處理的（圖7b）棗渣微觀結(jié)構(gòu)相對(duì)均勻，細(xì)胞壁受損較少；超聲波預(yù)處理則導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生大量的缺口，細(xì)胞壁破壞嚴(yán)重（圖7c）。據(jù)報(bào)道，超聲處理會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁塌陷，其原理是在超聲波作用下，空化產(chǎn)生大量小氣泡，氣泡破裂擴(kuò)大孔徑并形成微觀通道，從而在更大程度上損害細(xì)胞[16]，使活性成分得到更多地釋放。
3 結(jié)論
在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助提取棗渣中總?cè)频脑囼?yàn)參數(shù)并建立其提取工藝二次多項(xiàng)式理論模型，模型擬合度良好。得到最佳提取條件：超聲溫度60℃，超聲時(shí)間42 min，液固比34∶1（mL/g），乙醇濃度 64%，此條件下得到的總?cè)坪孔罡撸瑸?5.854 mg/g，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果接近，說(shuō)明此優(yōu)化工藝參數(shù)可靠。與振蕩提取法對(duì)比，超聲輔助處理的樣品總?cè)坪枯^高，通過(guò)掃描電鏡分析，UAE處理的細(xì)胞壁被嚴(yán)重破壞，而CVE處理的細(xì)胞表面相對(duì)較為平滑。對(duì)兩種提取物進(jìn)行抗氧化評(píng)價(jià)，得出超聲輔助提取物清除DPPH、ABTS+和羥基自由基的IC50值分別為 0.702、0.203、0.596 mg/mL，CVE 提取物的 IC50值分別為1.000、0.665、1.043 mg/mL。當(dāng)提取物濃度為1 mg/mL時(shí)，兩者對(duì)A549癌細(xì)胞的抑制率分別為37.62%和27.18%，UAE提取物的抗氧化能力和抗增殖能力明顯高于CVE提取物。棗渣中總?cè)坪枯^為豐富，這些低成本的可再生資源若能得到較好的開(kāi)發(fā)，并應(yīng)用于醫(yī)療和食品行業(yè)，提高其利用價(jià)值的同時(shí)將對(duì)經(jīng)濟(jì)和環(huán)境產(chǎn)生積極的影響。
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陳楠，吳瀟霞，白冰瑤，陳計(jì)巒*
（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）
紅棗原產(chǎn)于中國(guó)，距今已有4 000多年的歷史[1]。我國(guó)紅棗種植面積較廣，產(chǎn)量居世界第一[2]，主要分布于新疆、河北和陜西等地。新疆由于降雨量少，日照充足，有利于紅棗中糖分的積累[3-4]。紅棗具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[5]，其不僅有較強(qiáng)的抗氧化能力[2]，還具有抗癌、保肝護(hù)肝、美容養(yǎng)顏等功效[6]。許多研究表明，紅棗具有多種功效的原因是棗肉和棗皮中含有多種化學(xué)成分，包括三萜類化合物、多酚、礦物質(zhì)、氨基酸和多糖等[7]。
目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)紅棗的研究主要集中于多糖等功能成分的提取分析，對(duì)紅棗中總?cè)频奶崛〖翱寡趸涂乖鲋郴钚詧?bào)道較少。三萜類化合物具有良好的抗腫瘤作用[8]，可應(yīng)用于食品或制藥行業(yè)中[9]，提高紅棗產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益[10]。
棗渣是三萜類化合物的良好來(lái)源[11]，但在紅棗加工過(guò)程中常被當(dāng)作廢棄物直接丟棄或掩埋，這種處理方式不僅會(huì)造成三萜類化合物的浪費(fèi)，還會(huì)造成環(huán)境污染[12-13]。因此，為了提高棗渣的利用率，充分挖掘其潛在價(jià)值，本試驗(yàn)將超聲輔助技術(shù)應(yīng)用于棗渣總?cè)频奶崛。⑼ㄟ^(guò)響應(yīng)面法對(duì)棗渣中總?cè)频奶崛l件進(jìn)行優(yōu)化并研究其抗氧化和抗增殖活性，為棗渣的深度利用提供參考依據(jù)，提高廢物資源利用率。
1 材料與方法
1.1 材料、試劑與設(shè)備
1.1.1 棗渣的制備
棗（Ziziphus jujuba Mill.cv.Junzao）：市售。棗用去離子水清洗后，去核，搗碎，分離棗渣并凍干，-18℃保存，以備進(jìn)一步試驗(yàn)。
1.1.2 試劑
2，2'-偶氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6）磺酸（2'-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）、2，2-二苯基-1 苦基肼 （1，1-diphenyl-2-picryl Hydrazyl，DPPH）、抗壞血酸：北京索萊寶有限公司；齊墩果酸、熊果酸、白樺脂酸、麥珠子酸、山楂酸：上海安普實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基：美國(guó)GIBCO公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美國(guó) Sigma-Aldrich公司。
1.1.3 儀器與設(shè)備
XS-O4多功能粉碎機(jī)：上海兆中科技有限公司；DZKW-D2恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；BGZ-246電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；超聲清洗槽（SK5200GT）：上?？频纼x器有限公司;TDL-4A低速多管大容量離心機(jī)：上海非恰爾分析儀器有限公司；搖床（SHZ-A）：常州諾佳儀器有限公司；JO-060S超聲波清洗機(jī)：深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；LE-203E電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；J6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；Synergy H1多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)博騰儀器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 超聲輔助提取（ultrasonic-assisted extraction，UAE）
精密稱取一定量紅棗渣凍干粉，置于錐形瓶中，分別設(shè)置不同提取溫度、提取時(shí)間、液固比和乙醇濃度對(duì)棗渣樣品（2.5 g）中的三萜進(jìn)行超聲輔助提取，收集濾液，并用相同體積的溶劑重復(fù)萃?。?個(gè)循環(huán)），合并濾液，濃縮并冷凍干燥。
1.2.2 常規(guī)振動(dòng)提取（conventional vibrate extraction，CVE）
將樣品（2.5 g）與 85 mL乙醇（64%，體積分?jǐn)?shù)）混合并放置在錐形瓶中，然后使用搖床進(jìn)行輔助提取。提取溫度60℃，轉(zhuǎn)速260 r/min，持續(xù)72 min，離心收集上清液，濃縮并凍干。
1.2.3 單因素試驗(yàn)
分別稱取棗渣粉末 2.5 g，設(shè)置液固比 35∶1（mL/g），乙醇濃度60%（體積分?jǐn)?shù)），超聲溫度50℃，考察超聲時(shí)間分別為 20、30、40、50、60 min 時(shí)對(duì)總?cè)坪浚╰otal triterpene content，TTC）的影響；設(shè)置超聲時(shí)間40 min，溫度 50 ℃，液固比 35∶1（mL/g），考察乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%時(shí)對(duì)總?cè)坪康挠绊懀辉O(shè)置液固比 35∶1（mL/g），超聲時(shí)間 40 min，乙醇濃度 60%，考察超聲溫度分別為 40、50、60、70、80℃時(shí)對(duì)總?cè)频挠绊懀辉O(shè)置乙醇濃度60%，超聲溫度50℃，超聲時(shí)間 40 min，考察液固比分別為 25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1（mL/g）時(shí)對(duì)總?cè)坪康挠绊憽?/p>
1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)[14]。對(duì)4個(gè)影響因素進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)，以總?cè)坪孔鳛轫憫?yīng)值，探究棗渣總?cè)频淖罴烟崛」に嚄l件。利用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行分析，建立數(shù)學(xué)回歸模型，以得到最佳提取工藝，響應(yīng)面因素與水平見(jiàn)表1。
表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology
1.2.5 總?cè)坪康臏y(cè)定
1.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
參照文獻(xiàn)[15]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性回歸方程為y=25.296x-0.011，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3。
1.2.5.2 樣品總?cè)坪康臏y(cè)定
準(zhǔn)確稱量50.0 mg齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，用60%乙醇溶液溶解，定容至50 mL，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞試管中，100℃水浴揮干，依次加入5%香草醛-冰乙酸0.4 mL，高氯酸 1.6 mL[16]。65℃水浴加熱 45 min，冷卻至室溫，用冰乙酸定容至10.0 mL，搖勻后靜置15 min。以0管為對(duì)照溶液，在548 nm處測(cè)其吸光值，按照式（1）計(jì)算總?cè)坪俊?/p>
式中：W為提取率，mg/g；c為計(jì)算的總?cè)茲舛?，mg/mL；n為稀釋倍數(shù)；v為樣品溶液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g
1.2.6 棗渣總?cè)铺崛∥锏目寡趸u(píng)價(jià)
1.2.6.1 DPPH自由基清除能力
參考文獻(xiàn)[17]的方法，分別準(zhǔn)確吸取不同濃度待測(cè)樣品2 mL，再吸取2 mL DPPH標(biāo)準(zhǔn)乙醇溶液加入到10 mL的試管中搖勻，室溫（25℃）避光30 min后在517 nm處測(cè)定吸光值。重復(fù)3次，取平均值。DPPH自由基清除能力按公式（2）計(jì)算。
式中：A0為DPPH溶液的吸光度；A1為被測(cè)樣品存在時(shí)的吸光度。
1.2.6.2 ABTS+自由基清除能力
參考文獻(xiàn)[18]略有改動(dòng)，配制ABTS工作液，分別取工作液0.5 mL于試管中，依次加入不同濃度的樣品溶液（濃度由低到高）0.5 mL，充分混合后反應(yīng)6 min，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光值。按公式（3）計(jì)算ABTS+自由基的清除能力。
式中：A1為樣品吸光度；A0為空白樣品吸光度。
1.2.6.3 羥基自由基清除能力
羥基自由基的清除能力按照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行測(cè)定。樣品配制濃度分別為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，然后各取1.0 mL分別與2 mL 9 mmol/L硫酸亞鐵溶液和2 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液混合?；旌暇鶆蚝?，加入1 mL 9 mmol/L過(guò)氧化氫溶液，37℃靜置30 min，在510 nm處測(cè)定吸光值。羥基自由基清除能力按公式（4）計(jì)算。
式中：A2為樣品吸光度；A0為空白樣品吸光度；A1為超純水代替雙氧水的吸光度。
1.2.7 抗增殖活性
采用cell counting kit-8（CCK-8）試驗(yàn)評(píng)價(jià)棗渣總?cè)瓶乖鲋承Ч549細(xì)胞于RPMI 1640培養(yǎng)基中，溫度37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞（2×104Cells/mL）在96孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，用20 μL樣品（濃度為 0、0.1、0.5、1.0 mg/mL）在溶劑（0.1% DMSO）中處理48 h[20]。每個(gè)濃度試驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率按公式（5）計(jì)算。
式中：A0為對(duì)照品的吸光度；A1為樣品的吸光度。
1.2.8 掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）分析
對(duì)干燥后的樣品表面進(jìn)行真空噴金濺射，用掃描電子顯微鏡在15 kV加速電壓下測(cè)定凍干棗渣樣品的微觀結(jié)構(gòu)。
1.3 數(shù)據(jù)處理
運(yùn)用Design-Expert V8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化處理，采用Origin2019b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并繪圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果
2.1.1 超聲溫度對(duì)總?cè)坪康挠绊?/p>
超聲溫度對(duì)總?cè)坪康挠绊懸?jiàn)圖1。
圖1 超聲溫度對(duì)總?cè)坪康挠绊慒ig.1 Effect of ultrasonic temperature on total triterpenoid content
由圖1可以得出，總?cè)频寐孰S著超聲溫度的增大而不斷增大，50℃時(shí)得率最高，為15.7 mg/g，繼續(xù)升高溫度至80℃過(guò)程中，總?cè)坪恐饾u下降。在一定范圍內(nèi)，提高超聲波溫度有利于三萜類化合物的浸出，但過(guò)高的溫度會(huì)降低三萜類化合物的穩(wěn)定性，加速破壞三萜類化合物[21]。還有一方面原因是溫度較高，溶劑揮發(fā)嚴(yán)重，其它物質(zhì)也會(huì)隨之溶出[22]。故選取超聲溫度為50℃最合適。
2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)總?cè)坪康挠绊?/p>
超聲時(shí)間對(duì)總?cè)坪康挠绊懸?jiàn)圖2。
圖2 超聲時(shí)間對(duì)總?cè)坪康挠绊慒ig.2 Effect of ultrasonic time on total triterpenoid content
由圖2可知，在超聲時(shí)間從20 min增加至40 min的過(guò)程中，總?cè)坪坎粩嘣龃螅赡艿脑蚴请S著時(shí)間的增加使得溶質(zhì)和乙醇充分接觸，三萜的提取率升高[23]；當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)，總?cè)铺崛÷首畲?，?5 mg/g；之后，隨著超聲時(shí)間逐漸增加至60 min，提取率緩慢下降，原因是細(xì)胞內(nèi)外濃度達(dá)到平衡[24]，待析出物質(zhì)減少，提取速率降低[23]。
2.1.3 液固比對(duì)總?cè)坪康挠绊?/p>
液固比對(duì)總?cè)坪康挠绊懸?jiàn)圖3。
圖3 液固比對(duì)總?cè)坪康挠绊慒ig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on total triterpenoid content
如圖 3 所示，當(dāng)液固比在 25∶1（mL/g）～35∶1（mL/g）時(shí)，總?cè)坪侩S著液固比的增大而增大，原因是一定范圍內(nèi)溶劑量的增大使得三萜類物質(zhì)能更好地釋放[25]，但當(dāng)液固比大于 35∶1（mL/g）時(shí)，總?cè)坪块_(kāi)始降低，可能的原因是溶劑用量增大，超聲波與棗渣粉之間作用減弱，導(dǎo)致總?cè)频寐氏陆礫26]?？紤]提取率及經(jīng)濟(jì)效益，選取最佳液固比為 35∶1（mL/g）。
2.1.4 乙醇濃度對(duì)總?cè)坪康挠绊?/p>
乙醇濃度對(duì)總?cè)频挠绊懸?jiàn)圖4。
圖4 乙醇濃度對(duì)總?cè)坪康挠绊慒ig.4 Effect of ethanol concentration on total triterpenoid content
由圖4可知，乙酸濃度為40%～60%時(shí)，隨著乙醇濃度的增大，總?cè)坪坎粩嘣龃?；?dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，總?cè)频寐首畲?，?4 mg/g；乙醇濃度繼續(xù)增大時(shí)，總?cè)坪块_(kāi)始下降，可能的原因是色素及親脂性強(qiáng)的成分溶出，從而導(dǎo)致棗渣總?cè)频暮拷档蚚27]。其次，總?cè)仆ǔＲ攒栈蜍赵嬖?，苷易溶于水，苷元易溶于醇，乙醇濃度過(guò)高或過(guò)低都不利于二者的充分提取[28]。
2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析
2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果
響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)軌蚩疾於嘁蜃又g的影響，得到的三維立體圖形在反映因變量變化程度的同時(shí)，通過(guò)自變量的相互影響確定因變量的最佳條件。本試驗(yàn)中，利用響應(yīng)面軟件Design-Expert V8.0.6設(shè)計(jì)四因素三水平的試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見(jiàn)表2，回歸模型方差分析見(jiàn)表3。
表2 棗渣中TTC提取的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Response surface design and results of extraction of total triterpenoids from jujube residue
表3 棗渣TTC的二次模型方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for quadratic models on total triterpenoids of jujube residue
如表2所示，棗渣提取物的TTC為8.400 mg/g～15.580mg/g，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合得到TTC含量的二階多項(xiàng)式方程：Y=12.65-1.31X1-0.11X2-0.053X3-0.30X4-0.81X1X2-0.30X1X3-0.81X1X4-0.30X2X3-0.90X2X4+0.66X3X4+0.88X12-1.67X22-1.27X32-1.11X42。
采用方差分析和決定系數(shù)（R2）來(lái)檢驗(yàn)TTC的響應(yīng)面法模型的充分性。表3顯著性結(jié)果表明，總?cè)坪康幕貧w模型差異為極顯著（P＜0.000 1），總?cè)坪颗cX1（溫度）、X3（液固比）2個(gè)因素之間的線性關(guān)系極顯著，回歸模型的失擬項(xiàng)為0.160 9，不顯著（P＞0.05）。模型的校正決定系數(shù)為0.956 6，說(shuō)明有4.34%的情況不能以此模型進(jìn)行解釋，相關(guān)系數(shù)為0.978 3，綜上，該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合程度較高，可以較為合理地表述響應(yīng)值和4個(gè)因素之間存在的線性關(guān)系。因此，該回歸方程適用于此模型。在此試驗(yàn)中，還可以通過(guò)各因素F值來(lái)推斷該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的重要性，因素的F值越大，則對(duì)該模型結(jié)果影響也越大。由表3可知，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響大小依次為X1＞X4＞X2＞X3，即超聲溫度＞乙醇濃度＞超聲時(shí)間＞液固比。
2.2.2 響應(yīng)面的分析及優(yōu)化
圖5表示各因素交互作用對(duì)總?cè)坪康挠绊?，隨著各變量的增加，總?cè)坪砍尸F(xiàn)先增大后逐漸減小的變化趨勢(shì)，說(shuō)明這些變量的交互作用對(duì)總?cè)坪康挠绊懸脖容^大，有相關(guān)研究表明，液固比和乙醇濃度是影響響應(yīng)面法提取三萜類化合物最佳工藝條件的重要因素[29]。除此之外，等高線的圖形均為橢圓形，說(shuō)明各變量的交互作用顯著[30]。
圖5 超聲時(shí)間、液固比和乙醇濃度對(duì)TTC影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Surface plot and contour plot of the effects of ultrasonic time，liquid-to-solid ratio，and ethanol concentration on total triterpenoid content
2.2.3 模型驗(yàn)證
響應(yīng)面模型優(yōu)化的最佳工藝為超聲溫度60℃，超聲時(shí)間 42.04 min，液固比 34.34∶1（mL/g），乙醇濃度63.35%，為了便于工業(yè)操作，確定的最終工藝為超聲溫度 60 ℃，超聲時(shí)間 42 min，液固比 34∶1（mL/g），乙醇濃度64%，此條件下總?cè)频寐蕿?5.854 mg/g，與模型預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差（15.799 mg/g）為0.35%。因此，該優(yōu)化提取條件是可行的，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
2.3 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果
棗渣總?cè)铺崛∥锟寡趸囼?yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。
圖6 棗渣總?cè)铺崛∥矬w外抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of total triterpenoid extract from jujube residue in vitro
由圖6可知，通過(guò)DPPH、ABTS+和羥基自由基清除活性測(cè)試，UAE提取物的IC50值分別為0.702、0.203、0.596 mg/mL，CVE 提取 物的 IC50值分別為1.000、0.665、1.043 mg/mL。在本研究中，UAE 提取物的抗氧化能力明顯高于CVE提取物，這可能是紅棗渣中富含三萜類化合物，由于超聲波的作用使其更大程度地釋放，具有更好的自由基清除活性[31-32]。此外，有報(bào)道表明酚酸中的沒(méi)食子酸也具有較強(qiáng)的抗氧化性能[33]。
2.4 抗A549細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果
CVE和UAE提取物對(duì)A549癌細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 棗渣中三萜類對(duì)A549癌細(xì)胞增殖的影響Table 4 Effect of jujube residue extract on proliferation of A549 cancer cells
如表4所示，不同濃度提取物對(duì)A549細(xì)胞的增殖率均有不同程度的抑制作用，且抑制率隨提取物濃度的增加而增加。當(dāng)濃度為1 mg/mL時(shí)，CVE和UAE的抑制率分別為27.18%和37.62%，UAE提取物的抑制率僅次于VC。相關(guān)研究表明，含有乙酰基的三萜類化合物能夠有效抑制A549癌細(xì)胞的增殖[20]。
2.5 SEM分析
原樣及兩種方式提取三萜類化合物后棗渣掃描電鏡圖見(jiàn)圖7。
圖7 棗渣掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron microscope photos of jujube residue
由圖7發(fā)現(xiàn)，不同處理方法下棗渣的微觀結(jié)構(gòu)有顯著差異。未處理的樣品表面光滑且密度大（圖7a）。CVE處理的（圖7b）棗渣微觀結(jié)構(gòu)相對(duì)均勻，細(xì)胞壁受損較少；超聲波預(yù)處理則導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生大量的缺口，細(xì)胞壁破壞嚴(yán)重（圖7c）。據(jù)報(bào)道，超聲處理會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁塌陷，其原理是在超聲波作用下，空化產(chǎn)生大量小氣泡，氣泡破裂擴(kuò)大孔徑并形成微觀通道，從而在更大程度上損害細(xì)胞[16]，使活性成分得到更多地釋放。
3 結(jié)論
在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助提取棗渣中總?cè)频脑囼?yàn)參數(shù)并建立其提取工藝二次多項(xiàng)式理論模型，模型擬合度良好。得到最佳提取條件：超聲溫度60℃，超聲時(shí)間42 min，液固比34∶1（mL/g），乙醇濃度 64%，此條件下得到的總?cè)坪孔罡撸瑸?5.854 mg/g，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果接近，說(shuō)明此優(yōu)化工藝參數(shù)可靠。與振蕩提取法對(duì)比，超聲輔助處理的樣品總?cè)坪枯^高，通過(guò)掃描電鏡分析，UAE處理的細(xì)胞壁被嚴(yán)重破壞，而CVE處理的細(xì)胞表面相對(duì)較為平滑。對(duì)兩種提取物進(jìn)行抗氧化評(píng)價(jià)，得出超聲輔助提取物清除DPPH、ABTS+和羥基自由基的IC50值分別為 0.702、0.203、0.596 mg/mL，CVE 提取物的 IC50值分別為1.000、0.665、1.043 mg/mL。當(dāng)提取物濃度為1 mg/mL時(shí)，兩者對(duì)A549癌細(xì)胞的抑制率分別為37.62%和27.18%，UAE提取物的抗氧化能力和抗增殖能力明顯高于CVE提取物。棗渣中總?cè)坪枯^為豐富，這些低成本的可再生資源若能得到較好的開(kāi)發(fā)，并應(yīng)用于醫(yī)療和食品行業(yè)，提高其利用價(jià)值的同時(shí)將對(duì)經(jīng)濟(jì)和環(huán)境產(chǎn)生積極的影響。
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