不同載體固定化醋酸菌發(fā)酵甘蔗醋的對(duì)比分析

黃志，方曉純，林波，鄭鳳錦，3*，陳趕林，3*

（1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣西 南寧 530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西 南寧 530007；3.廣西果蔬貯藏與加工新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007）

甘蔗是分布在熱帶和亞熱帶的禾本科甘蔗屬植物，原產(chǎn)于中國(guó)及印度。廣西位于我國(guó)的西南地區(qū)，具有甘蔗生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)條件，廣西的原料蔗產(chǎn)量和產(chǎn)糖量連續(xù)29年全國(guó)排名第一，超過(guò)全國(guó)總量的60%[1]。甘蔗富含極易被人體吸收利用的蔗糖、果糖、葡萄糖等糖分，且含人體必需的微量元素，如鐵、鈣、磷、錳、鋅等，其中鐵的含量為9 mg/kg，居水果之首[2-3]；此外，甘蔗還含有谷氨酸、天門冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸等多種氨基酸及檸檬酸、蘋果酸等有機(jī)酸[4]。

甘蔗醋是以新鮮糖料甘蔗為原料，經(jīng)壓榨、滅菌、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵、陳釀等工藝加工而成的一類果醋飲料[5-6]。甘蔗汁經(jīng)過(guò)生物發(fā)酵加工制備成果醋飲料，不僅擴(kuò)大了甘蔗產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域，增加了果醋飲料的品種，更重要的是果醋飲料是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、附加值高的風(fēng)味飲品，賦予了甘蔗汁更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，符合現(xiàn)代人們的大健康理念[7]。

固定化細(xì)胞技術(shù)是采用物理或化學(xué)手段將具有一定生理功能的生物細(xì)胞（動(dòng)、植物細(xì)胞或微生物細(xì)胞等）控制在一定的空間區(qū)域[8]，利用微生物的生物轉(zhuǎn)化作用來(lái)提高生產(chǎn)速度、穩(wěn)定性和效率，使底物原料變成所需產(chǎn)品。固定化細(xì)胞技術(shù)的關(guān)鍵是固定化載體，其與產(chǎn)品的產(chǎn)量、質(zhì)量有直接關(guān)系。直徑只有0.4 μm～2.0 μm的醋酸菌屬于細(xì)菌，比酵母更微小，因此對(duì)載體要求更嚴(yán)格。無(wú)機(jī)物、天然高分子、有機(jī)合成高分子是固定化醋酸菌常用的載體材料，海藻酸鈉、玉米芯和稻殼均為天然高分子材料，玉米芯表面疏松、組織結(jié)構(gòu)均勻、硬度適宜、韌性和耐磨性好，不易破碎，適合醋酸菌活細(xì)胞著床生長(zhǎng)繁殖；海藻酸鹽凝膠價(jià)格低廉，制備簡(jiǎn)單快速，不易被微生物降解，對(duì)生物的毒性較小，反應(yīng)條件溫和，應(yīng)用較為廣泛[9]。稻殼為價(jià)格低廉的農(nóng)產(chǎn)品廢棄物，來(lái)源豐富，我國(guó)的產(chǎn)量居世界首位。其結(jié)構(gòu)中含有14%～16%的硅是以網(wǎng)絡(luò)狀分布的，纖維素和木質(zhì)素填充在其中，這一特殊結(jié)構(gòu)非常有利于制備成吸附劑[10-12]，因此稻殼可被用作固定化細(xì)胞載體。利用固定化微生物制備果醋國(guó)內(nèi)外學(xué)者早有研究，韋璐等[13]將玉米芯固定化發(fā)酵生產(chǎn)香蕉醋，縮短了發(fā)酵時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了菌種重復(fù)利用和香蕉醋連續(xù)化生產(chǎn)；何炯靈[14]以玉米芯、花生殼、甘蔗渣、秸稈、米糠作為固定化載體，與海藻酸鈉包埋醋酸菌的固定化方法進(jìn)行對(duì)比，研究得出玉米芯作為醋酸菌固定化載體進(jìn)行獼猴桃醋發(fā)酵，產(chǎn)酸量較高且穩(wěn)定性好，感官品質(zhì)佳；Dias等[15]將醋酸菌和葡萄糖酸桿菌固定化后發(fā)酵樹葡萄，研究表明在此方法下進(jìn)行醋酸發(fā)酵酒精轉(zhuǎn)化率達(dá)74.4%，且檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸等有機(jī)酸產(chǎn)量較髙。

目前，國(guó)內(nèi)果醋釀造方法主要有固態(tài)發(fā)酵法[16]、液態(tài)發(fā)酵法[17]以及固定化細(xì)胞發(fā)酵法[18]等，鄭鳳錦等[5]和鄭平等[19]利用液態(tài)深層發(fā)酵法釀造甘蔗醋，但關(guān)于甘蔗醋固定化細(xì)胞發(fā)酵的方法少有報(bào)道。本研究選用海藻酸鈉、玉米芯和稻殼3種載體固定化醋酸菌，均為改善甘蔗醋產(chǎn)品風(fēng)味的同時(shí)保證其發(fā)酵速率，試驗(yàn)重復(fù)3個(gè)批次加料，對(duì)比3種固定化載體發(fā)酵甘蔗醋的總酸含量及產(chǎn)酸速率等，以期為甘蔗醋的工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

低度甘蔗酒：由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所按照DB45/T 1946—2019《低度甘蔗酒生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》進(jìn)行制備，酒精度為12%vol；玉米芯：廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所；稻殼：廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所；LB醋酸菌：陜西鼎力生物科技有限公司；海藻酸鈉（食品級(jí)）：河南糖柜食品有限公司；氯化鈣（食品級(jí)）：河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

高溫滅菌鍋（FY-65L）：上海申安醫(yī)療器械廠；人工氣候箱（BIC-300）：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；恒溫?fù)u床（TS-2101C）：常州國(guó)宇儀器制造有限公司；糖度計(jì)（PAL-1）：日本 ATAGO（愛拓）公司；電子天平（JA2003型）：上海良平儀器儀表有限公司；酸度計(jì)（pHS-3C）：上海雷磁儀器廠；測(cè)色儀（CM-3600A）：柯尼卡美能達(dá)（中國(guó)）投資有限公司；酒精計(jì)（MC 0-40度）：河北省武強(qiáng)縣同輝儀表廠。

1.3 方法

1.3.1 微生物細(xì)胞的固定

1.3.1.1 前處理

（1）海藻酸鈉：稱取4.0 g海藻酸鈉溶于100 g無(wú)菌水（水溫35℃）中，加入5.0 g LB醋酸菌攪拌混合均勻，滴入4%氯化鈣水溶液500 mL，制得海藻酸鈣包埋的固定化醋酸菌凝膠粒子，于4℃冰箱里平衡24 h后備用[20]。

（2）玉米芯：取無(wú)霉變的干燥玉米芯中間部分為試驗(yàn)對(duì)象，稱取100 g用清水浸泡24 h，進(jìn)行脫色、去味處理，反復(fù)換水蒸煮，待煮出的水變無(wú)色后，121℃高溫滅菌20 min，冷卻待用。

（3）稻殼：稱取100 g無(wú)霉變的干稻殼顆粒，清水浸泡12 h后，進(jìn)行脫色處理，反復(fù)換水蒸煮，待煮出的水變無(wú)色后，121℃高溫滅菌20 min，冷卻待用。

1.3.1.2 固定化處理

將備用的海藻酸鈣凝膠粒子過(guò)濾，固體轉(zhuǎn)入無(wú)菌容器中，并添加100 mL低度甘蔗酒，用透氣封口膜封口，置于32℃恒溫?fù)u床發(fā)酵培養(yǎng)40 h。

將待用的玉米芯、稻殼分別轉(zhuǎn)入無(wú)菌三角瓶中，并添加5.0 g醋酸菌和100 mL甘蔗酒，用透氣封口膜封口，放在32℃恒溫?fù)u床發(fā)酵培養(yǎng)40 h。

1.3.2 工藝流程

1.3.3 固定化醋酸菌與游離醋酸菌發(fā)酵甘蔗醋對(duì)比試驗(yàn)

取5.0 g LB醋酸菌置于無(wú)菌容器中作為游離醋酸菌來(lái)對(duì)比參照，同時(shí)向海藻酸鈉、玉米芯和稻殼固定化醋酸菌載體的容器中分別加入同批次初始酒精度為6%vol的低度甘蔗酒1 000 mL，于30℃的條件下靜態(tài)發(fā)酵22 d，每組載體平行試驗(yàn)3組，定時(shí)取樣檢測(cè)發(fā)酵醪液中總酸含量變化，考察不同載體固定化醋酸菌發(fā)酵與游離醋酸菌對(duì)甘蔗酒醋酸發(fā)酵的影響，并對(duì)發(fā)酵完全的樣品進(jìn)行感官品質(zhì)評(píng)價(jià)。

1.3.4 不同載體固定化醋酸菌發(fā)酵甘蔗醋對(duì)發(fā)酵效率的影響

（1）第1次發(fā)酵：將不同載體固定化醋酸菌發(fā)酵與游離醋酸菌發(fā)酵的甘蔗醋醪液于30℃的條件下靜態(tài)發(fā)酵22 d，為第1次發(fā)酵。定時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵液的總酸，考察不同載體對(duì)甘蔗酒醋酸發(fā)酵的影響。

（2）第2次發(fā)酵：待第1次發(fā)酵后將發(fā)酵液全部倒出（出料），保留固定化載體，重新補(bǔ)料加入1 000 mL同批次的低度甘蔗酒，于30℃的條件下靜態(tài)發(fā)酵7 d，即為第2次發(fā)酵。定時(shí)取樣考察不同載體對(duì)甘蔗酒醋酸發(fā)酵的影響。

（3）第3次發(fā)酵：待第2次發(fā)酵后將發(fā)酵液全部倒出（出料），繼續(xù)保留固定化載體，再次補(bǔ)料加入1000mL同批次的低度甘蔗酒，于30℃的條件下靜態(tài)發(fā)酵7 d，即為第3次發(fā)酵。定時(shí)取樣考察不同載體對(duì)甘蔗酒醋酸發(fā)酵的影響，并比較各固定化材料的組織完好程度。

1.3.5 分析測(cè)定方法

酒精：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定；含糖量：采用手持糖度計(jì)測(cè)定；總酸：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定；pH值：采用pH計(jì)直接測(cè)定；色差：過(guò)濾后取上清液用臺(tái)式分光測(cè)色儀測(cè)定；感官評(píng)分：按照DBS45/065—2020《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)甘蔗醋飲料》的感官要求進(jìn)行品評(píng)，滿分100分，其中色澤30分，香氣30分，滋味40分。稻殼、玉米芯和海藻酸鈉完好程度的判定方法：將固定化載體發(fā)酵后與發(fā)酵前對(duì)比，外觀、質(zhì)地完好為完好；外觀、質(zhì)地部分溶解為部分溶解；外觀、質(zhì)地完全溶解為完全溶解。

發(fā)酵產(chǎn)酸速率[g/（L·h）]計(jì)算公式如下[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；數(shù)據(jù)處理及作圖采用Excel 2019；試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同載體固定化醋酸菌與游離醋酸菌發(fā)酵甘蔗醋的比較

2.1.1 不同載體固定化醋酸菌與游離醋酸菌發(fā)酵對(duì)總酸的影響

固定化醋酸菌與游離醋酸菌發(fā)酵甘蔗醋總酸含量對(duì)比見圖1。

圖1 固定化醋酸菌與游離醋酸菌發(fā)酵甘蔗醋總酸含量對(duì)比Fig.1 Comparison of total acid content of sugarcane vinegar fermented by immobilized acetobacteria and free acetobacteria

由圖1可知，在醋酸發(fā)酵過(guò)程中，固定化載體的吸附性和結(jié)構(gòu)不同，其發(fā)酵產(chǎn)酸也是有差異的。采用不同載體的固定化醋酸菌，其發(fā)酵醪液的總酸含量都明顯高于游離醋酸菌發(fā)酵醪液的總酸含量，發(fā)酵22 d，不同方法和載體進(jìn)行醋酸發(fā)酵的醪液中總酸含量依次為稻殼（51.2 g/L）＞海藻酸鈉（32.0 g/L）＞玉米芯（25.1 g/L）＞游離醋酸菌發(fā)酵（19.1 g/L），這可能與固定化發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)胞濃度有關(guān)，由于固定化載體的作用表面積大，分散系數(shù)高，吸附性強(qiáng)，醋酸菌被吸附固定后容易著床生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致固定化發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞濃度明顯高于游離發(fā)酵系統(tǒng)，從而加快了產(chǎn)酸速率，快速將乙醇轉(zhuǎn)化成醋酸[22]。

2.1.2 不同載體固定化醋酸菌與游離醋酸菌發(fā)酵對(duì)甘蔗醋品質(zhì)的影響

不同載體固定化醋酸菌與游離醋酸菌發(fā)酵對(duì)甘蔗醋品質(zhì)的影響見表1～表2。

表1 不同固定化載體對(duì)發(fā)酵甘蔗醋的色差影響Table 1 Effects of different immobilized carriers on color difference of fermented sugarcane vinegar

表2 不同固定化載體對(duì)發(fā)酵甘蔗醋品質(zhì)的影響Table 2 Effects of different immobilized carriers on the quality of fermented sugarcane vinegar

對(duì)不同載體固定化醋酸菌的發(fā)酵醋液進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，與游離醋酸菌發(fā)酵醪液對(duì)比，從色澤上來(lái)看ΔL*值較大表示透明度較高；Δa*值為正時(shí)顏色偏向于紅色色澤方向；Δb*值為正，偏向于黃色色澤方向。由表1、表2可知，以海藻酸鈉、玉米芯和稻殼為載體的固定化醋酸菌發(fā)酵的醋液ΔL*值差異不大，透明度相近，且三者均比游離醋酸菌發(fā)酵的醋液顏色深，游離醋酸菌發(fā)酵的醋液ΔL*值較高而Δb*值相對(duì)較低，醋液為淺黃色，通過(guò)肉眼觀察，以玉米芯和稻殼為載體的固定化醋酸菌發(fā)酵的醋液為淺棕色，和色差儀檢測(cè)的結(jié)果接近。由表2可知，從香氣上看，因稻殼和玉米芯本身自帶果香和少量的糖分，作為固定化載體發(fā)酵的醋液，增加了其香氣物質(zhì)并協(xié)調(diào)厚重了醋液的酸味[14]，以玉米芯和稻殼為載體的固定化醋酸菌發(fā)酵的醋液香氣和滋味都優(yōu)于游離醋酸菌。從品質(zhì)與感官評(píng)分得到，以稻殼為載體發(fā)酵的醋液香氣最濃，醋體透亮，其感官評(píng)分最高，為91，其次是玉米芯，為90，以海藻酸鈉為載體發(fā)酵的醋液有輕微渾濁。

2.2 不同載體固定化醋酸菌發(fā)酵甘蔗醋對(duì)發(fā)酵效率的影響

2.2.1 第1次發(fā)酵

不同載體固定化醋酸菌第1次發(fā)酵甘蔗醋的總酸含量變化結(jié)果見圖2，不同載體固定化醋酸菌第1次發(fā)酵甘蔗醋的產(chǎn)酸速率對(duì)比結(jié)果見圖3。

圖2 不同載體固定化醋酸菌第1次發(fā)酵甘蔗醋的總酸含量變化Fig.2 Changes of total acid content of sugarcane vinegar fermented by different immobilized carriers in the first feeding

圖3 不同載體固定化醋酸菌第1次發(fā)酵甘蔗醋的產(chǎn)酸速率對(duì)比Fig.3 Comparison of acid production rates of sugarcane vinegar with different immobilized carriers in the first fermentation

由圖2可知，以稻殼為載體的發(fā)酵液發(fā)酵作用最為顯著，發(fā)酵1 d時(shí)其總酸含量最高，這與稻殼的作用表面積大且分散系數(shù)高有直接關(guān)系，其次是玉米芯；以稻殼或玉米芯為固定化載體的發(fā)酵液總酸含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷上升，發(fā)酵至7 d時(shí)以稻殼為固定化載體的發(fā)酵液總酸含量最高達(dá)到24.1 g/L，以玉米芯為固定化載體的發(fā)酵液總酸含量只達(dá)到15.9 g/L；海藻酸鈉的發(fā)酵液總酸含量先緩慢下降，可能是醋酸菌細(xì)胞繼續(xù)大量繁殖，產(chǎn)酸較慢，加入酒液后稀釋了活化后的總酸，在發(fā)酵1 d后其總酸含量開始升高，1 d～4 d時(shí)總酸含量升高比較緩慢，表現(xiàn)為曲線比較平穩(wěn)，4 d后總酸含量增加較快；發(fā)酵7 d，總酸含量從高到低的順序：稻殼（24.1 g/L）＞玉米芯（15.9 g/L）＞海藻酸鈉（13.2 g/L）。

由圖3可知，3種載體固定化醋酸菌發(fā)酵甘蔗醋的產(chǎn)酸速率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈正增長(zhǎng)的趨勢(shì)，產(chǎn)酸速率從高到低的順序?yàn)榈練ぃ居衩仔荆竞Ｔ逅徕c，這可能與固定化載體的表面積有關(guān)，可接觸的表面積大吸附性強(qiáng)，更利于醋酸菌固定在上面生長(zhǎng)繁殖，將乙醇轉(zhuǎn)化成醋酸[23]。發(fā)酵至7 d時(shí)以稻殼為固定化載體的發(fā)酵液產(chǎn)酸速率最高，達(dá)到1.0 g/（L·h），以玉米芯為固定化載體的發(fā)酵液達(dá)到0.66 g/（L·h），以海藻酸鈉為固定化載體的發(fā)酵液達(dá)到0.55 g/（L·h）。

2.2.2 第2次發(fā)酵

不同載體固定化醋酸菌第2次發(fā)酵甘蔗醋的總酸含量變化結(jié)果見圖4，不同載體固定化醋酸菌第2次發(fā)酵甘蔗醋的產(chǎn)酸速率對(duì)比結(jié)果見圖5。

圖4 不同載體固定化醋酸菌第2次發(fā)酵甘蔗醋的總酸含量變化Fig.4 Changes of total acid content of sugarcane vinegar fermented by different immobilized carriers in the second feeding

圖5 不同載體固定化醋酸菌第2次發(fā)酵甘蔗醋的產(chǎn)酸速率對(duì)比Fig.5 Comparison of acid production rates of sugarcane vinegar fermented by different immobilized carriers in the second feeding

由圖4可知，第2次發(fā)酵后，以稻殼為固定化載體的發(fā)酵液隨著時(shí)間增加總酸含量上升最快，其次是玉米芯，發(fā)酵2 d后這兩個(gè)發(fā)酵液產(chǎn)酸含量呈上升的趨勢(shì)，發(fā)酵至7 d，以稻殼為固定化載體的發(fā)酵液總酸含量高達(dá)28.1 g/L，以玉米芯為固定化載體的發(fā)酵液總酸含量為18.7 g/L；而以海藻酸鈉為固定化載體的發(fā)酵液在發(fā)酵前4 d其總酸含量變化不明顯，發(fā)酵4 d后其總酸含量增加較為明顯，曲線呈緩慢上升趨勢(shì)，但都低于以稻殼或玉米芯為固定化載體的發(fā)酵液總酸含量。發(fā)酵7 d，用不同載體材料進(jìn)行固定化醋酸發(fā)酵的最高總酸含量依次為稻殼（28.1 g/L）＞玉米芯（18.7 g/L）＞海藻酸鈉（13.7 g/L），這與何炯靈[14]利用固定化醋酸菌發(fā)酵獼猴桃醋的二批次發(fā)酵的現(xiàn)象較為一致。

由圖5可知，3種載體固定化醋酸菌第2次發(fā)酵的發(fā)酵液產(chǎn)酸速率在同一發(fā)酵時(shí)間均高于第1次加料的產(chǎn)酸速率；3種載體的發(fā)酵液產(chǎn)酸速率隨著時(shí)間的增加不斷上升，其中以稻殼為固定化載體的發(fā)酵體系產(chǎn)酸速率增加最為明顯，當(dāng)發(fā)酵至7 d時(shí)，其產(chǎn)酸速率最高，為1.17 g/（L·h），以玉米芯為固定化載體的發(fā)酵體系產(chǎn)酸速率在7 d時(shí)達(dá)到最高，為0.78 g/（L·h），以海藻酸鈉為固定化載體的發(fā)酵液的產(chǎn)酸速率在發(fā)酵4 d前增加不明顯，產(chǎn)酸速率都在0.40 g/（L·h）左右，隨著時(shí)間的增加，在發(fā)酵7 d時(shí)其產(chǎn)酸速率最高為0.57 g/（L·h）。

2.2.3 第3次發(fā)酵

不同載體固定化醋酸菌第3次發(fā)酵甘蔗醋的總酸含量對(duì)比結(jié)果見圖6，不同載體固定化醋酸菌第3次發(fā)酵甘蔗醋的產(chǎn)酸速率對(duì)比結(jié)果見圖7。

圖6 不同載體固定化醋酸菌第3次發(fā)酵甘蔗醋的總酸含量對(duì)比Fig.6 Changes of total acid content of sugarcane vinegar fermented by different immobilized carriers in the third feeding

圖7 不同載體固定化醋酸菌第3次發(fā)酵甘蔗醋的產(chǎn)酸速率對(duì)比Fig.7 Comparison of acid production rates of sugarcane vinegar fermented by different immobilized carriers in the third feeding

由圖6可知，第3次發(fā)酵1 d時(shí)，以稻殼為固定化載體的發(fā)酵體系中總酸含量最高，但發(fā)酵2 d時(shí)，以玉米芯為固定化載體的發(fā)酵體系總酸含量上升至最高值，之后隨著時(shí)間的增加其總酸含量升高趨于緩慢，發(fā)酵7 d其總酸含量最高達(dá)41.5 g/L；第2次補(bǔ)料后，以稻殼作為載體的發(fā)酵體系總酸含量隨著時(shí)間的增加仍然不斷上升，發(fā)酵5 d其總酸含量最高為40.7 g/L，隨后其總酸含量略有下降，這主要是因?yàn)榇姿峋谌狈I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的情況下會(huì)分解部分醋酸獲得能量而導(dǎo)致的[14]；以海藻酸鈉為固定化載體的發(fā)酵體系在發(fā)酵2 d后其總酸含量變化不明顯，趨于平緩，其總酸含量保持在20.5 g/L左右，這可能與海藻酸鈉是采用包埋法固定制作而成有關(guān)，固定化處理過(guò)程中為了多包埋醋酸菌細(xì)胞及增強(qiáng)凝膠珠與發(fā)酵液之間的物質(zhì)交換能力，會(huì)限制海藻酸鈉與鈣離子濃度，從而導(dǎo)致凝膠珠強(qiáng)度比較低，易溶出，影響其重復(fù)使用性與壽命[9]。因此菌種繁殖速度降低，產(chǎn)酸速度變慢。

由圖7可知，稻殼和海藻酸鈉的發(fā)酵體系產(chǎn)酸速率在發(fā)酵1d時(shí)最高，分別為1.01、0.64 g/（L·h），之后隨著時(shí)間的增加產(chǎn)酸速率不斷下降，醋酸發(fā)酵后期高酸度的發(fā)酵醪液對(duì)醋酸菌具有抑制作用[23]，包埋細(xì)胞逐漸凋亡等原因也導(dǎo)致產(chǎn)酸量下降；以玉米芯為固定化載體的發(fā)酵體系產(chǎn)酸速率在發(fā)酵2 d時(shí)達(dá)到最高值，為0.82 g/（L·h），隨后逐漸下降。在每個(gè)發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，海藻酸鈉發(fā)酵體系的產(chǎn)酸速率都低于以玉米芯或稻殼為固定化載體的發(fā)酵體系產(chǎn)酸速率；同時(shí)玉米芯發(fā)酵體系的產(chǎn)酸速率在1 d時(shí)低于以稻殼發(fā)酵體系，但發(fā)酵1 d后，其產(chǎn)酸速率均高于以稻殼為固定化載體的發(fā)酵體系的產(chǎn)酸速率，這充分表明3次補(bǔ)料后，玉米芯作為載體的發(fā)酵體系中醋酸菌總數(shù)相對(duì)較高，將乙醇轉(zhuǎn)化成醋酸作用時(shí)間更長(zhǎng)。

2.3 3次發(fā)酵后固定化菌種的完好程度比較

3次發(fā)酵后，不同載體固定化醋酸菌發(fā)酵后的發(fā)酵體系完好程度及菌膜生長(zhǎng)情況見表3。

表3 固定化醋酸菌種的完好程度變化和菌膜生長(zhǎng)情況Table 3 Changes of immobilized acetic acid strain integrity and bacterial film growth

由表3可知，第1次發(fā)酵結(jié)束后，3種載體固定化菌種都完好；但第2次發(fā)酵后，以海藻酸鈉為載體的固定化凝膠顆粒開始出現(xiàn)溶解的現(xiàn)象，第3次結(jié)束后，其溶解更多，穩(wěn)定性較差；而以玉米芯或稻殼為載體經(jīng)過(guò)3個(gè)批次發(fā)酵后組織形態(tài)還保留完好。綜合比較，以海藻酸鈉為載體的固定化凝膠顆粒重復(fù)發(fā)酵使用的周期遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及以玉米芯或稻殼為固定化載體的周期長(zhǎng)，后者可連續(xù)發(fā)酵利用3次以上。以海藻酸鈉或以稻殼為固定化載體的發(fā)酵液在第2次發(fā)酵時(shí)表面開始產(chǎn)生一層白色菌膜，至第3次發(fā)酵時(shí)游離醋酸菌和固定化醋酸菌的發(fā)酵液表面都長(zhǎng)有白色菌膜。魏冉等[24]曾提出在靜態(tài)發(fā)酵中菌膜的形成是發(fā)酵液正常發(fā)酵的表現(xiàn)，在自然發(fā)酵的食醋中，一層薄菌膜的產(chǎn)生是造醋成功的標(biāo)志，產(chǎn)生的菌膜可控制O2通透性，避免雜菌污染。何炯靈[14]研究表明菌膜粘附在載體表面，會(huì)導(dǎo)致載體通氧量不足及液體無(wú)法順利下流，故產(chǎn)酸穩(wěn)定性變差。綜合對(duì)比圖2、圖4、圖6，發(fā)現(xiàn)第3次發(fā)酵，以玉米芯為載體的固定化發(fā)酵體系中，后期的總酸含量高于稻殼，這可能與菌膜的附著有關(guān)，影響了稻殼作為載體的固定化發(fā)酵的產(chǎn)酸穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

從產(chǎn)酸量的角度考慮，分別以海藻酸鈉、玉米芯和稻殼為固定化載體連續(xù)發(fā)酵甘蔗醋，3種不同載體的發(fā)酵能力明顯高于游離醋酸菌發(fā)酵；其中稻殼、玉米芯體系以吸附法固定醋酸菌產(chǎn)酸的作用最明顯，且玉米芯和稻殼自身的結(jié)構(gòu)組織狀態(tài)比較好，沒(méi)有出現(xiàn)變軟變爛的現(xiàn)象；海藻酸鈉體系以包埋法固定醋酸菌產(chǎn)酸，因?yàn)榧骖櫞姿峋?xì)胞及凝膠珠與發(fā)酵液之間的物質(zhì)交換能力，海藻酸鈉與鈣離子濃度不能太高，因此凝膠珠不夠牢固，易溶出從而減短壽命，導(dǎo)致產(chǎn)酸能力低于稻殼、玉米芯體系。從穩(wěn)定性和使用壽命的角度考慮，經(jīng)過(guò)3批次連續(xù)發(fā)酵后，玉米芯體系相對(duì)于稻殼體系的產(chǎn)酸性能更穩(wěn)定些；玉米芯自身組織均勻、硬度適宜、韌性好、耐磨性好，在使用過(guò)程中不易破碎，且具有很大的表面積，表面疏松，通透性強(qiáng)，很適合醋酸菌活細(xì)胞著床生長(zhǎng)發(fā)酵繁殖。在固定化處理方面，玉米芯相對(duì)于稻殼更便于處理，從而降低成本。海藻酸鈉在第2次發(fā)酵后就出現(xiàn)溶解的現(xiàn)象，穩(wěn)定性稍差，不適宜做甘蔗醋的固定化載體。綜合生產(chǎn)成本、生產(chǎn)工藝的可便性、穩(wěn)定性等方面考慮，玉米芯更適合作為固定化載體來(lái)發(fā)酵甘蔗醋。