枳術(shù)丸湯劑含藥血清對大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細胞增殖及PI3K/Akt信號通路的影響

施 敏， 劉富林*， 涂琴蓉,2， 夏旭婷

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南師范大學(xué)附屬湘東醫(yī)院，湖南 株洲 412200)

胃腸動力障礙性疾病是指所有胃腸動力紊亂引起的以惡心、嘔吐、痞滿、排便異常等各種消化道癥狀為臨床表現(xiàn)的疾病，目前有專家認為其發(fā)生主要與胃腸道Cajal間質(zhì)細胞(interstitial cell of Cajal,ICC)、胃腸激素和5-羥色胺、腸壁微血管病變和微循環(huán)障礙、代謝紊亂、精神心理因素等有關(guān)[1]，包括慢傳輸型便秘、腸易激綜合征、賁門失弛緩癥、糖尿病性胃腸病、慢性特發(fā)性假性腸梗阻等疾病。ICC細胞是胃腸道的起搏細胞, 不但具有產(chǎn)生自發(fā)性電信號的功能，并且可以傳導(dǎo)慢波信號，參與神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)[2]，其表達異?？芍挛改c平滑肌舒縮功能下降造成胃腸動力障礙[3]。研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt參與增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種細胞功能的調(diào)節(jié)，對于鈣離子的活化、釋放從而產(chǎn)生慢波電位至關(guān)重要[4]。

ICC細胞在維持正常胃腸動力方面發(fā)揮著重要作用，一些以其為靶向的藥物已應(yīng)用于臨床或正在研究之中。中藥促進胃腸動力的效果強于莫沙必利等西藥，且效果持久，停藥后不易復(fù)發(fā)，遠期預(yù)后較佳[5]。枳術(shù)丸是以健脾運脾、理氣導(dǎo)滯通便立法，治療脾虛便秘的經(jīng)典名方，本課題組多年的臨床應(yīng)用和實驗研究表明其能改善患者的胃腸排空功能和臨床癥狀，能夠促進脾虛便秘小鼠ICC細胞的增殖分化，結(jié)合PI3K/Akt信號通路在細胞增殖分化中的作用[6-7]，猜測枳術(shù)丸可能通過激活PI3K/Akt通路，上調(diào)PI3K、Akt表達，促進ICC細胞增殖，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)胃腸動力的作用。

本實驗選用枳術(shù)丸湯劑，根據(jù)《脾胃論》[8]中枳術(shù)丸記載“白術(shù)二兩，枳實麩炒黃，去瓤，一 兩”的 2∶1 配比，以體外大鼠結(jié)腸ICC細胞為研究對象，觀察藥物血清對其增殖的影響以及對PI3K、Akt基因、蛋白表達的影響，探討相關(guān)調(diào)節(jié)胃腸動力的作用靶點及分子機制。

1 材料

1.1 動物、細胞株 20只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(220±5)g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物使用許可證號SYXK(湘)2013-0005，實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)同意，編號HN-LL-2015-026。大鼠結(jié)腸ICC細胞購于賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司，編號RAT/MIC/RAB-iCell-d024，取第2、3代生長狀態(tài)良好細胞用于檢測。

1.2 藥材 枳術(shù)丸湯劑白術(shù)與枳實按2∶1的比例配制，由于文獻[9-10]報道方中白術(shù)的最佳有效劑量為60 g，故取白術(shù)60 g、枳實30 g，按5倍比例加蒸餾水浸泡30 min，文火煎煮40 min，煎煮液用紗布過濾，再加5倍量蒸餾水，文火煎煮40 min，紗布過濾，合并2次煎液，在75 ℃下蒸發(fā)濃縮成2 kg/L湯劑，置于玻璃瓶中，密封，標(biāo)記，恢復(fù)至室溫后放入4 ℃冰箱冷藏。相關(guān)藥材購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院張志國主任藥師鑒定為正品。

1.3 試劑 原代細胞培養(yǎng)體系[賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司，批號PriMed-iCell-025]；胰蛋白酶(0.25%，美國Gibco公司，批號25200056)；細胞增殖毒性檢測(CCK-8)試劑(日本同仁化學(xué)研究所，批號KU746)；Tris、APS、SDS、TEMED、聚山梨酯-20(Tween-20)、丙烯酰胺、甘氨酸、甲叉雙丙烯酰胺(美國Sigma公司，批號分別為V900483、10002618、MB2479、T105497、30189328、0341、V900144、0172)；兔抗免疫球蛋白(Ig)G、鼠抗 IgG、大鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體(美國Proteintech公司，批號分別為SA00001-1、SA00001-2、10004413)；蛋白酶抑制劑(德國Merck公司，批號583794)；蛋白磷酸酶抑制劑(瑞士Roche公司，批號P1260)；SuperECL Plus超敏發(fā)光液(美國Thermo Pierce公司，批號K-12045-D50)；顯影液、定影液(上海市佳信科技有限公司，批號分別為BW-61、BW-62)；凋亡抑制蛋白(XIAP)、增殖細胞核抗原(PCNA)(英國Abcam公司，批號分別為ab21278、ab92552)；常規(guī)化學(xué)試劑(國藥控股上海生物醫(yī)藥有限公司)；LY294002(美國Selleck公司，批號S-1105)。

1.4 儀器 YT-CJ-2NB型超凈工作臺(蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司)；DH-160I型直熱式CO2培養(yǎng)箱、PIKO REAL 96型熒光定量RCP儀、SPL0960型熒光PCR板(美國Thermo公司)；DSZ2000X型熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；BCD-245F型普通冰箱(合肥榮事達電子電器集團有限公司)；DW-HL388SL02型-80 ℃冰箱(中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司)；FA-N型電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；EnSpire型多功能酶標(biāo)儀(美國Perkinelmer公司)；H1650R型臺式冷凍離心機(深圳黑馬公司)；DYCZ-24DN型電泳槽(美國Bio-Rad公司)；TS-92型水平搖床、DYY-6C型電泳儀、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器廠)；QL-901型旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；E-201-C型精密PH計[奧豪斯儀器(上海)有限公司]；DY89-1型電動玻璃勻漿器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；DY89-1型蓋玻片、AY89-2型載玻片(海門遠泰實驗器材廠)。

2 方法

2.1 原代ICC細胞培養(yǎng) 原代大鼠結(jié)腸ICC細胞使用原代間質(zhì)細胞培養(yǎng)體系培養(yǎng)。細胞株復(fù)蘇后，以1 mL胰蛋白酶消化貼壁細胞約1 min，倒置顯微鏡下觀察細胞回縮變圓形時，立即棄去消化液，加入2 mL完全培養(yǎng)基終止胰酶消化，以1 mL的Tip頭輕輕吹打內(nèi)皮細胞，使細胞從培養(yǎng)瓶脫落，置于15 mL離心管中，800 r/min離心5 min，再棄去上清液，加入全新的2 mL培養(yǎng)基重懸，以Tip頭輕柔打散細胞團塊，待細胞混和均勻后，以稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的含完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，每1～2 d換液1次。

2.2 含藥血清制備 將20只大鼠隨機分為枳術(shù)丸湯劑組、空白血清組，每組各10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，以60 kg成人每天服用枳術(shù)丸藥物劑量的3倍與220 g大鼠體表面積換算比值換算出大鼠1 d用量(根據(jù)公式D2=D1×R2/R1，R1=346.88，R2=7.502，D1=270 g)，枳術(shù)丸湯劑組灌胃枳術(shù)丸湯劑5.8 g/d，空白血清組灌胃等量蒸餾水，每天1次，連續(xù)7 d，末次給藥后1 h腹主動脈采血，室溫靜置2 h后離心取上清存于EP管，密封，在56 ℃恒溫水浴中滅活30 min，置于-80 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩Ｊ褂们?7 ℃水浴解凍，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。

2.3 分組與建模 選擇完全培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，待細胞傳代至3代時，選取80%融合、生長良好者，胰酶消化1 min后，細胞重懸計數(shù)，按照每孔1×104個細胞接種于96孔板中。待細胞密度達到80%后，加入不同濃度(15、25、35、45 μmol/L)的PI3K/Akt抑制劑LY294002進行干預(yù)，干預(yù)24 h后以CCK8法檢測細胞增殖抑制情況，分析確定大鼠結(jié)腸ICC細胞最佳的抑制劑濃度。將大鼠結(jié)腸ICC細胞分為正常組(正常細胞+培養(yǎng)液)、模型組(正常細胞+最佳抑制劑濃度的LY294002)、空白血清組(模型+最佳濃度的空白血清)、枳術(shù)丸湯劑組(模型+最佳濃度的枳術(shù)丸湯劑含藥血清)。

2.4 CCK8法檢測大鼠結(jié)腸ICC細胞增殖抑制率 大鼠結(jié)腸ICC細胞按照每孔1×104個細胞接種于96孔板中，經(jīng)過同步化處理24 h后，分別用15、25、35、45 μmol/L的含藥培養(yǎng)液于37 ℃培養(yǎng)24 h后吸棄上清，每孔加入100 μL反應(yīng)液，37 ℃培養(yǎng)4 h，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測光密度(OD)值，并根據(jù)公式細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率=1-[(OD藥物處理組-OD空白對照組)/(OD標(biāo)準(zhǔn)-OD空白對照組)]×100%，實驗重復(fù)3次。

2.5 含藥血清濃度及時間篩選 設(shè)立5%、10%、15%、20%含藥血清、空白血清分別作用于大鼠結(jié)腸ICC細胞，并設(shè)培養(yǎng)液作用于不含血清的正常組大鼠結(jié)腸ICC細胞。采用CCK8法根據(jù)OD值結(jié)果計算增殖率并進行統(tǒng)計學(xué)分析，篩選出最佳濃度。制成含藥血清最佳濃度后，設(shè)計細胞培養(yǎng)時間節(jié)點分別為12、24、48 h，計算增殖率并進行統(tǒng)計學(xué)分析，篩選出濃度的最佳時間，重復(fù)3次。

2.6 免疫熒光檢測ICC細胞中PI3K、Akt蛋白表達 取出細胞爬片，PBS清洗2～3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，加入3% H2O2，37 ℃孵育30 min以滅活內(nèi)源性酶；PBS沖洗3次，每次3 min，10%正常血清或5% BSA封閉60 min，孵育一抗；PBS沖洗3次，每次5 min，孵育二抗；PBS沖洗3次，每次5 min，37 ℃下DAPI工作液染核10 min；PBS沖洗3次，每次5 min，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。大鼠結(jié)腸ICC細胞中PI3K、Akt均以紅色熒光為染色陽性，藍色為核染信號，染色結(jié)果通過熒光顯微鏡電腦采集400倍鏡下圖像，Image J軟件采集分析樣本中紅色部分的累積光密度(IOD)。

2.7 Western blot檢測ICC細胞中PI3K、Akt蛋白表達 預(yù)冷PBS洗滌細胞1次后，棄去上清，加入200 μL RIPA裂解液吹打混勻，冰上裂解10 min，4 ℃離心后取上清，根據(jù)BCA試劑盒操作檢測蛋白濃度，蛋白樣品與5×Loading buffer混勻，沸水煮5 min后放入冰盒中速冷。配制SDS-PAGE膠，80、120 V電泳，300 mA轉(zhuǎn)膜；1×TBST中洗滌5 min，用麗春紅染膜，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜的效率，1×TBST洗凈麗春紅，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h；加入稀釋好的一抗(Akt 1∶10 000，p-Akt 1∶5 000，PI3K 1∶1 000，p-PI3K 1∶750，β-actin 1∶5 000)4 ℃過夜孵育，1×TBST洗膜3次，每次15 min；用1×TBST稀釋HRP標(biāo)記的二抗，兔抗(R)稀釋比例1∶6 000，鼠抗(M)稀釋比例1∶5 000，與膜共同孵育90 min，1×TBST洗3次，每次15 min；ECL化學(xué)發(fā)光液與膜孵育3 min，暗盒內(nèi)與X膠片曝光約15～120 min，顯影沖洗。將曝光后的底片掃描，Quantity one專業(yè)灰度分析軟件進行分析。

2.8 RT-qPCR檢測ICC細胞中PI3K、AktmRNA表達 根據(jù)試劑盒說明書操作提取細胞總的RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為Template 2 μL,正反向引物各0.5 μL,PCR水12 μL,2×SYBGREEN PCR Master Mix 15 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min; 95 ℃變性5 s，60 ℃退火60 s，共40個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用儀器自帶qbase plus軟件分析，采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達。在NCBI上搜索目的基因的序列，運用primer5軟件設(shè)計引物，β-actin正向引物ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC，β-actin反向引物TACTC CTGCTTGCTGATCCAC；Akt正向引物ACGCCAAGGAG ATCATGCAG，Akt反向引物ATGCTGTCATCTTGGTCAGGT；PI3K正向引物CTTACCTAGCTCTTCGCCACC，PI3K反向引物CCCGGATGTATTCAATGTCCT。

3 結(jié)果

3.1 LY294002對大鼠結(jié)腸ICC細胞的增殖抑制作用 不同濃度LY294002作用于大鼠結(jié)腸ICC細胞，抑制率如圖1所示，隨著抑制劑濃度的升高，大鼠結(jié)腸ICC細胞增殖抑制率升高，說明LY294002對大鼠結(jié)腸ICC細胞增殖抑制作用呈現(xiàn)出濃度依賴性，濃度越高，抑制細胞增殖的效果越明顯。但在25 μmol/L濃度時，斜率趨于平緩，即抑制率趨于平緩，并且根據(jù)SPSS軟件計算半數(shù)抑制濃度IC50值，置信限度范圍為24.8%～39.5%，選取25 μmol/L為實驗用最佳抑制劑濃度。

圖1 不同濃度LY294002干預(yù)大鼠結(jié)腸ICC細胞24 h后的增殖抑制率

3.2 含藥血清濃度、干預(yù)時間篩選 不同濃度的枳術(shù)丸湯劑含藥血清組及空白血清組分別作用于大鼠結(jié)腸ICC細胞，增殖率見表1?？瞻籽褰M與正常組比較其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，空白血清組不同濃度之間也無明顯差異(P>0.05)。與正常組比較，不同濃度枳術(shù)丸湯劑含藥血清組ICC細胞增殖率均增加(P<0.01)，其中5%枳術(shù)丸湯劑含藥血清細胞增殖率最高，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

表1 不同濃度血清干預(yù)大鼠結(jié)腸ICC細胞24 h后增殖率比較

取5%枳術(shù)丸湯劑含藥血清及10%空白血清分別作用于大鼠結(jié)腸ICC細胞，時間分別為12、24、48 h，增殖率見表2。與正常組比較，10%空白血清組作用于3個不同時間后ICC細胞增殖率無明顯變化(P>0.05)，5%枳術(shù)丸湯劑含藥血清組ICC細胞增殖率均升高，且以作用24 h最高(P<0.01)。由此可知，根據(jù)課題組枳實、白術(shù)單味藥部分實驗結(jié)果[11]，選取10%作為藥物濃度，選取5%枳術(shù)丸湯劑作為最佳作用濃度，最佳反應(yīng)時間點為24 h。

表2 不同作用時間下血清干預(yù)大鼠結(jié)腸ICC細胞增殖率比較

3.3 免疫熒光檢測大鼠結(jié)腸ICC細胞中PI3K、Akt蛋白表達 如表3、圖2～3所示，與正常組比較，模型組ICC細胞中PI3K、Akt蛋白表達降低(P<0.01)；與模型組比較，枳術(shù)丸湯劑組ICC細胞中PI3K、Akt蛋白表達均升高(P<0.01)；與空白血清組比較，枳術(shù)丸湯劑組ICC細胞中PI3K、Akt蛋白表達升高(P<0.05)。圖2～3中紅色熒光(PI3K、Akt蛋白)為染色陽性，藍色為核染信號。

圖2 各組大鼠結(jié)腸ICC細胞中PI3K蛋白表達(免疫熒光，×400)

表3 各組大鼠結(jié)腸ICC細胞中PI3K、Akt蛋白表達比較

3.4 Western blot檢測大鼠結(jié)腸ICC細胞中PI3K、Akt蛋白表達 如表4、圖4所示，與正常組比較，模型組ICC細胞中PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達均降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，枳術(shù)丸湯劑組ICC細胞中PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達均升高(P<0.01)；與空白血清組比較，枳術(shù)丸湯劑組ICC細胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-PI3K蛋白表達均升高(P<0.05)。

圖3 各組大鼠結(jié)腸ICC細胞中Akt蛋白表達(免疫熒光，×400)

圖4 各組大鼠結(jié)腸ICC細胞中PI3K、Akt蛋白表達

表4 各組大鼠結(jié)腸ICC細胞PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達比較

3.5 RT-qPCR檢測大鼠結(jié)腸ICC細胞中PI3K、AktmRNA表達 如表5所示，與正常組比較，模型組ICC細胞中PI3K、AktmRNA表達降低(P<0.01)；與模型組比較，枳術(shù)丸湯組ICC細胞中PI3K、AktmRNA表達均升高(P<0.01)；與空白血清組比較，枳術(shù)丸湯劑組ICC細胞中PI3K、AktmRNA表達均升高(P<0.05，P<0.01)。

表5 各組大鼠結(jié)腸ICC細胞中PI3K、Akt mRNA表達比較

4 討論

胃腸動力障礙性疾病屬于中醫(yī)“痞證”“納呆”“腹?jié)M”“便秘”等范疇[12]，脾胃虛弱、氣機失調(diào)為其病機，以調(diào)理脾胃氣機為基本治則[13]。枳術(shù)丸始于《金匱要略》中的枳術(shù)湯，后變化為丸劑，方中白術(shù)[14]功效主要在于益氣補脾燥濕，并通過補氣健脾來調(diào)整胃的消化腐熟功能[15]；枳實功效破氣消積、化痰除痞，二藥合用消補共施，可有調(diào)養(yǎng)之效。

胃腸道ICC細胞是以網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)存在于胃腸道的一類特殊間質(zhì)細胞，是胃腸道活動的起搏者和調(diào)節(jié)者，壁內(nèi)神經(jīng)信息向平滑肌傳送的中轉(zhuǎn)站，控制胃腸道平滑肌的收縮和蠕動，其自噬過度可使ICC細胞與平滑肌細胞之間，神經(jīng)與平滑肌之間的慢波電位產(chǎn)生、神經(jīng)興奮傳遞、神經(jīng)反射與平滑肌收縮節(jié)律失去調(diào)控，胃腸平滑肌舒縮功能下降等，造成胃腸動力障礙[16]。

課題組前期實驗證實枳術(shù)丸能改善脾虛患者的胃腸排空功能和臨床癥狀，能提高STC小鼠結(jié)腸黏膜ICC的數(shù)量，上調(diào)C-kit、SCF的表達，促進慢傳輸型便秘小鼠結(jié)腸功能恢復(fù)[6-7，11，17]。本研究結(jié)果顯示，25 μmol/L PI3K/Akt抑制劑LY294002、5%枳術(shù)丸湯劑含藥血清及10%空白血清干預(yù)大鼠結(jié)腸ICC細胞24 h為最佳干預(yù)措施。正常組大鼠結(jié)腸ICC細胞中PI3K、AktmRNA高表達；與正常組比較，模型組p-PI3K、p-Akt、PI3K、Akt蛋白和PI3K、AktmRNA表達均降低，說明大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細胞生長受到抑制，且與PI3K、Akt表達降低有關(guān)。PI3K/Akt是C-kit/SCF途徑下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[18]，SCF/c-kit系統(tǒng)通過PI3K信號通路PI3K→Akt→mTOR→P70S6K→Cyclin D3→Rbp42/p94完成細胞DNA合成信號的傳遞，導(dǎo)致細胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)變而介導(dǎo)細胞增殖。Ward等[19]報道用Wortmannin及LY294002阻斷C-kit/SCF信號途徑下游信號分子PI3K，可導(dǎo)致ICC細胞發(fā)育及表型異常。與模型組比較，枳術(shù)丸湯劑組p-PI3K、p-Akt、PI3K、Akt蛋白和PI3K、AktmRNA表達均升高；與空白血清組比較，枳術(shù)丸湯劑組p-PI3K、p-Akt、PI3K、Akt蛋白和PI3K、AktmRNA表達均升高，表明枳術(shù)丸能在一定程度上促進ICC細胞增殖，其機制可能與作用于PI3K、Akt信號通路，上調(diào)PI3K和Akt的表達有關(guān)。

然而，本研究尚存在不足，其一是采取枳術(shù)丸湯劑，然文獻記載枳術(shù)丸為“荷葉裹燒飯為丸”的丸劑，改用湯劑后功效與丸劑功效的一致性難以定量與鑒別，其中的差別有待進一步研究；其二是未檢測PI3K、Akt對應(yīng)的表型。課題組將繼續(xù)進一步研究，深入探索枳術(shù)丸湯劑含藥血清在改善胃腸動力方向的作用機制。