高效液相熒光色譜法測定坤寶丸中赭曲霉毒素A

葉林鏈， 王少敏， 周 恒， 毛 丹， 季 申*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203；2.上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203)

坤寶丸是由白芍、赤芍、黃芩等23味中藥制成的成方制劑，具有滋補(bǔ)肝腎、養(yǎng)血安神功效，為原料藥材粉碎混勻后加水和蜜煉制成的水蜜丸[1-2]，但原料藥材在種植、采收、加工、儲藏、運(yùn)輸?shù)倪^程中操作不當(dāng)時(shí)易感染產(chǎn)毒真菌，從而產(chǎn)生真菌毒素[3]。其中，赭曲霉毒素A具有腎毒性、致畸性等多種毒性作用，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為2B類[4-6]，其檢測方法主要有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，雖然薄層色譜法操作簡單，但靈敏度低；酶聯(lián)免疫吸附法檢測速度快，但易出現(xiàn)假陽性；液相色譜法靈敏度高，專屬性強(qiáng)；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法特異性強(qiáng)，靈敏度高，但儀器普及度低[7-9]。

目前，對中藥成方制劑中真菌毒素檢測的報(bào)道較少，而它可監(jiān)測生產(chǎn)企業(yè)投料的安全性，對成藥安全性把控具有重大意義。因此，本實(shí)驗(yàn)建立高效液相熒光色譜法測定坤寶丸中赭曲霉毒素A含量，以期為確保該制劑及投料藥安全性提供支持。

1 材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Milli-Q純水儀(美國密理博公司)；CP225D分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；ShaQer 1500研磨機(jī)(美國SPEX公司)；Eppendorf 5415R型冷凍高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。赭曲霉毒素A(批號303-47-9，99.0%)、赭曲霉毒素A免疫親和柱(G1033，3 mL)(美國Vicam公司)。坤寶丸收集自寧夏、四川、江蘇等地。甲醇為色譜純(德國Merck公司)；磷酸為色譜純(純度≥99.0%，美國Sigma公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Inertsil ODS3色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm); 流動相2%磷酸(A)-乙腈(B)(57∶43)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；熒光檢測激發(fā)波長333 nm，發(fā)射波長477 nm；進(jìn)樣量40 μL。色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液制備 取適量赭曲霉毒素對照品，置于5 mL量瓶中，乙腈稀釋至刻度，配制成每1 L含112.8 μg該成分的溶液，即得，在-20 ℃下避光保存。臨用前用乙腈稀釋10倍，作為標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.3 供試品溶液制備 取本品(剪碎)約2 g，精密稱定，置于50 mL離心管中，加入氯化鈉2 g，精密加入70%甲醇40 mL，高速振蕩5 min(1 516 r/min)，離心10 min(8 000 r/min)，精密量取上清液5 mL，置于50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，離心(8 000 r/min)，精密量取上清液20 mL，經(jīng)免疫親和柱，體積流量3 mL/min，用吐溫PBS緩沖液(稱取8.0 g氯化鈉、1.2 g磷酸氫二鈉、0.2 g磷酸二氫鉀、0.2 g氯化鉀，加990 mL水溶解，鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0，加入1 mL吐溫-20，加水稀釋至1 000 mL)10 mL洗脫，棄去洗脫液，再用10 mL水洗脫，棄去水洗液，使空氣進(jìn)入柱子，擠出水后用1.5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，置于2 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 吸取標(biāo)準(zhǔn)工作液1、2、10、20、50、100 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以赭曲霉毒素A進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程為Y=0.326 8X-0.009 5(R2=1.000 0)，在11.28～1 128 pg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。分別以儀器信噪比S/N=3、10為檢出限、定量限，測得兩者分別為0.26、0.86 ng/mL。

2.5 中間精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液40 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測定6次，測得赭曲霉毒素A峰面積RSD為0.53%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取中等添加濃度的加樣回收供試品溶液，于0、6、12、18、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得赭曲霉毒A峰面積RSD為5.0%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 在陰性樣品中分別添加低、中、高水平(5、20、50 μg/kg)對照品溶液，每個水平重復(fù)6次，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 赭曲霉毒素A加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.8 樣品含量測定 取19批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表2，可知有13批檢出赭曲霉毒素A。

表2 赭曲霉毒素A含量測定結(jié)果

3 討論

真菌毒素含量低，為千萬分之一級別，同時(shí)坤寶丸為23味藥組成的中藥復(fù)方，基質(zhì)干擾巨大。為了排除干擾，準(zhǔn)確定量，本研究采用與赭曲霉毒素A專一性結(jié)合的免疫親和柱凈化樣品，同時(shí)通過優(yōu)化色譜條件進(jìn)一步排除干擾。研究過程中發(fā)現(xiàn)，在流動相極性較小時(shí)，色譜柱的保留能力下降，雜質(zhì)和目標(biāo)物不容易分開，出現(xiàn)了假陽性的情況，色譜峰體現(xiàn)為包峰，通過優(yōu)化流動相梯度，以流動相為2%磷酸-乙腈等度洗脫，樣品中干擾和目標(biāo)物達(dá)到基線分離。

結(jié)果顯示，19批坤寶丸中有13批檢出赭曲霉毒素A，檢出率高達(dá)68.4%，含量最高為26.14 μg/kg，說明中成藥中確實(shí)存在較高的真菌毒素污染率。2010年歐盟修訂了甘草中赭曲霉毒素A的限量為20 μg/kg[10]，2015年歐盟修訂香料黑胡椒、肉豆蔻、姜、姜黃等赭曲霉毒素A的限量為15～20 μg/kg[11]，GB 2761-2017食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定谷物及其制品、豆類及其制品等赭曲霉毒素A的限量在2～10 μg/kg[12]。參照歐盟20 μg/kg限度，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1批樣品中赭曲霉毒素A含量超過規(guī)定，不合格率為5.3%，存在被污染的較高風(fēng)險(xiǎn)。因此，亟需重視中成藥中真菌毒素的安全性，對中成藥進(jìn)行相關(guān)監(jiān)控。本實(shí)驗(yàn)所用方法前處理簡單，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，可用于坤寶丸中真菌毒素赭曲霉毒素A的含量測定和安全性防控，并可供其他中成藥借鑒。