不同化皮、濃縮工藝對阿膠中核苷、氨基酸的影響

齊曉丹， 劉海濱， 牛偉霞， 高登鋒， 王延濤， 王春艷,3， 李 麗,2，張 淹*

(1.東阿阿膠股份有限公司，山東 聊城 252201；2.山東省膠類中藥技術(shù)創(chuàng)新中心，山東 聊城 252201；3.山東省膠類中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 聊城 252201)

阿膠為馬科動物驢EquusasinusL.的皮經(jīng)去毛、化皮、濃縮等制備工藝，并加入冰糖、豆油等輔料后在高溫下長時(shí)間煉制而成的傳統(tǒng)補(bǔ)益類膠類中藥，具有補(bǔ)血滋陰，潤燥、止血等功效[1]，蛋白質(zhì)含量約占其總量60%～85%，主要包括驢血清白蛋白[2]、核苷、微量元素、糖胺聚糖等[3-4]。近年來，對阿膠成分的研究主要集中在含量較高的蛋白質(zhì)上，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為阿膠發(fā)揮療效的主要成分是膠原蛋白，2020年版《中國藥典》也繼續(xù)保留了其主要組成氨基酸的含量測定方法。但實(shí)際上阿膠是驢皮經(jīng)化皮、濃縮、煉膠等長時(shí)間高溫過程中逐漸降解后形成的復(fù)雜多元體系[5]，不同廠家阿膠生產(chǎn)工藝及輔料均存在一定差異，導(dǎo)致其所含成分含量、分子質(zhì)量分布、物理性狀等均有較大區(qū)別，故僅依據(jù)氨基酸含量來對阿膠生產(chǎn)工藝的合理性或優(yōu)化進(jìn)行精準(zhǔn)評價(jià)仍具有局限性。

核苷作為維持生物生命活動的基本組成單元，在DNA代謝過程中扮演著重要角色，并且參與體內(nèi)各種生理過程的調(diào)節(jié)，表現(xiàn)出多種生物活性，如免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)、抗血小板凝聚、抗心律失常、抗腫瘤、抗病毒等[6-7]，同時(shí)有一些也被證明為動物類藥材的藥效成分[8-10]。因此，本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[11-14]，測定不同化皮、濃縮工藝中阿膠所含尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、鳥苷、腺苷的含量，并與2020年版《中國藥典》收載的氨基酸(L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸)含量進(jìn)行比較，以期客觀評價(jià)該藥材生產(chǎn)工藝的合理性和科學(xué)性，也為工藝優(yōu)化和藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善提供參考。

1 材料

Waters型高效液相色譜儀，配置Waters 2998 PDA檢測器(美國Waters公司)；MS105型電子分析天平(十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo公司)；KQ-800KDE型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BGZ-246型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)?；C(jī)組(1 m3，山東浩特能源設(shè)備有限公司)；WQ-005型單效外循環(huán)濃縮器(湖南精誠制藥機(jī)械有限公司)。

尿嘧啶(批號100147-20030，純度≥98.0%)、尿苷(批號100147-200302，純度≥98.0%)、胸腺嘧啶(批號10047-200302，純度≥98.0%)、鳥苷(批號111977-201501，純度≥98.0%)、腺苷(批號110879-200202，純度≥98.0%)、L-羥脯氨酸(批號111578-201602，純度99.9%)、甘氨酸(批號140689-202006，純度100.0%)、丙氨酸(批號140680-201604，檢查及含量測定用)、脯氨酸(批號140677-201808，純度99.9%)對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。驢皮(5歲驢)由山東天龍牧業(yè)有限公司提供，經(jīng)東阿阿膠股份有限公司牛偉霞副主任中藥師鑒定為馬科動物驢EquusasinusL.的干皮。乙酸銨、甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法

2.1 制備工藝考察 根據(jù)文獻(xiàn)[15-17]報(bào)道及實(shí)際生產(chǎn)過程中的化皮、濃縮工藝，將驢皮進(jìn)行泡皮、焯皮后切塊(2 cm×2 cm)混合，取10 kg，按表1條件處理，濃縮至相對密度為1.18(20 ℃)后進(jìn)行冷凍干燥，平行3次。再采用2020年版《中國藥典》四部通則“0832水分測定法”項(xiàng)下第二法，測定干燥后不同樣品含水量。

表1 阿膠制備工藝條件

2.2 核苷含量測定

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、鳥苷、腺苷對照品適量，置于100 mL量瓶中，20 mL甲醇溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.105、0.176、0.109、0.242、0.287 mg/mL的貯備液，分別精密量取1.0 mL，置于100 mL量瓶中，20%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 參考文獻(xiàn)[3,14]報(bào)道，精密稱取按表1工藝條件制備的樣品各1.5 g，置于25 mL量瓶中，水浴加熱溶解，冷卻，加水至刻度，搖勻，靜置，精密吸取中層溶液3 mL，置于10 mL量瓶中，精密加入2 mL甲醇，加水定容至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2.3 色譜條件 Agilent Zorbox SB-Aq C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相1 mmol/L乙酸銨(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～10 min，98%A；10～20 min，98%～95%A；20～35 min，95%～80%A；35～45 min，80%～60% A；45～50 min，60%A)；體積流量0.7 mL/min；檢測波長260 nm[3]。色譜圖見圖1。

1.尿嘧啶 2.尿苷 3.胸腺嘧啶 4.鳥苷 5.腺苷圖1 各核苷HPLC色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下貯備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置于100 mL量瓶中，20%甲醇定容至刻度，搖勻，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品峰面積(Y)對其進(jìn)樣量(X)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各核苷在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各核苷線性關(guān)系

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取同一批樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、鳥苷、腺苷含量RSD分別為0.25%、0.65%、0.65%、0.64%、0.78%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，室溫下于0、1、2、4、6、12 h在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、鳥苷、腺苷峰面積RSD分別為0.15%、1.02%、0.54%、0.68%、0.94%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、鳥苷、腺苷含量RSD分別為0.25%、0.65%、0.65%、0.64%、0.78%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取各核苷含量已知的樣品1.262 9、1.314 5、1.296 8、1.285 7、1.365 4、1.326 4 g，置于25 mL量瓶中，加入對照品溶液(尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、鳥苷、腺苷質(zhì)量濃度分別為5.841 6、8.045 2、21.232 1、9.896 9、9.813 3 μg/mL)5 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、鳥苷、腺苷平均加樣回收率分別為100.46%、100.05%、100.14%、99.48%、100.03%，RSD分別為1.52%、1.20%、0.91%、1.04%、1.37%。

2.4 氨基酸含量測定 參照2020年版《中國藥典》一部阿膠項(xiàng)下方法進(jìn)行測定。

2.4.1 對照品溶液制備 精密稱取L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸對照品適量，0.1 mol/L鹽酸制成每1 mL分別含四者80 μg、0.16 mg、70 μg、0.12 mg的溶液，即得。

2.4.2 供試品溶液制備 取按表1工藝條件制備的阿膠約0.25 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸20 mL，超聲(功率500 W、頻率40 kHz)處理30 min，放冷，加0.1 mol/L鹽酸至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置于5 mL安瓿中，加2 mL鹽酸，在150 ℃下水解1 h，放冷，移至蒸發(fā)皿中，用10 mL水分次洗滌，洗液并入蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)?.1 mol/L鹽酸溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸至刻度，搖勻，即得。

2.4.3 色譜條件 Agilent Zorbox SB-Aq C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相[乙腈-0.1 mol/L醋酸鈉(醋酸調(diào)節(jié)pH值至6.5)(7∶93)](A)-[乙腈-水(4∶1)](B)，梯度洗脫，程序見表3；體積流量1 mL/min；柱溫43 ℃；檢測波長254 nm。色譜圖見圖2，理論塔板數(shù)按L-羥脯氨酸峰計(jì)，應(yīng)不低于4 000。

表3 梯度洗脫程序

1.L-羥脯氨酸 2.甘氨酸 3.丙氨酸 4.L-脯氨酸圖2 各氨基酸HPLC色譜圖

2.5 數(shù)據(jù)分析 采用Microsoft Excel 2013軟件處理數(shù)據(jù)，SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

3 結(jié)果

表4顯示，高壓化皮-減壓濃縮工藝所制備樣品中各核苷含量高于常壓化皮-常壓濃縮工藝所制備樣品中(P<0.05)；化皮溫度、時(shí)間對該類成分含量有明顯影響，而濃縮溫度、時(shí)間影響不顯著。另外，4種工藝所制備樣品中各氨基酸含量無顯著差異(P>0.05)，也無規(guī)律性變化。

表4 各核苷、氨基酸含量測定結(jié)果(n=3)

4 討論

在2020年版《中國藥典》阿膠“制法”項(xiàng)中，僅簡單描述為“將驢皮浸泡去毛，切塊洗凈，分次水煎，濾過，合并濾液，濃縮(可分別加入適量的黃酒、冰糖及豆油)至稠膏狀，冷凝，切塊，晾干，即得”，而化皮和濃縮工藝[15-17]作為該藥材品質(zhì)質(zhì)量等級的關(guān)鍵工序之一，對驢皮中驢血清白蛋白、核苷、微量元素、糖胺聚糖等成分的溶出具有至關(guān)重要的影響。因此，本實(shí)驗(yàn)探索上述2種工藝對阿膠中核苷、氨基酸含量的影響。

結(jié)果顯示，不同化皮工藝不僅是溫度的差異，化皮時(shí)間也有所區(qū)別，其中高壓化皮工藝溫度高于常壓化皮工藝，但化皮時(shí)間明顯更短。為了使不同化皮工藝之間具有可比性，本實(shí)驗(yàn)選擇一致的加水量，發(fā)現(xiàn)高壓化皮過程中化皮設(shè)備始終處于一個密閉狀態(tài)，默認(rèn)所加溶劑量未變；常壓化皮采用回流裝置，可保證化皮溶劑量與高壓化皮的一致。對于濃縮工藝而言，由于化皮溶劑量的一致也使得化皮液一致，故在濃縮過程中也未添加任何輔料。最終確定，核苷可作為阿膠化皮工藝優(yōu)化的評價(jià)指標(biāo)。