丁香揮發(fā)油對參黃散中有效成分的透皮促滲作用

劉興亮， 王 博， 李 瑋， 關 旸， 張 婷， 丁美紅， 石森林

(浙江中醫(yī)藥大學藥學院，浙江 杭州 310053)

丁香是桃金娘科植物丁香EugeniacaryophyllataThunb.的干燥花蕾，主要成分是揮發(fā)油、苷類等，其中揮發(fā)油主要組成是丁香酚[1]，可將蛋白質(zhì)變性，從而影響細胞膜上的磷脂雙分子層，改變細胞膜的通透性，可能是其發(fā)揮促滲作用的機制。參黃散是國家級名老中醫(yī)徐志瑛的經(jīng)典名方, 由生曬參、丹參、大黃、厚樸、枳實、吳茱萸、丁香7味藥材組成，臨床上主要用于術(shù)后腸動力障礙的治療，將其敷貼于神闕穴時療效顯著[2-3]，其中丁香揮發(fā)油具有良好的透皮吸收作用，可增加全方藥用功效，在促滲方面優(yōu)于化學促滲劑[4-6]。但目前對中藥揮發(fā)油的研究只針對其所含某成分的透皮吸收作用，尚無同一揮發(fā)油對于不同活性成分的促滲規(guī)律。為了科學評價丁香揮發(fā)油對參黃散中有效成分的透皮促滲作用，本實驗通過傅里葉紅外色譜、組織病理、掃描電鏡、免疫組化檢測E-鈣黏素(上皮黏附分子，介導細胞之間的粘附)等方法觀察該成分對大鼠皮膚結(jié)構(gòu)的改變情況，探析其促滲規(guī)律，以期為今后研究處方配伍中的具體劑量提供參考。

1 材料

JA2003N電子天平(上海精密儀器有限公司)；XS105分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；Agilent 7890-5977A氣相色譜-單四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent 1200series高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器有限公司)；SCIENTZ-IID型超聲細胞破碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)；SHZ-80恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司)；Avanti J-26XP系列高效離心機[貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司]；EQUINOX55傅里葉變換紅外光譜儀(德國Bruker公司)；AXIO SCOPE.A1正置顯微鏡(德國卡爾·蔡司公司)；SU8010型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本日立公司)；病理組織漂烘機、RM2245石蠟切片機、Autostainer XL全自動染色劑(德國徠卡公司)；AP280-1石蠟包埋機(德國MicRom公司)。

對照品大黃素(純度≥98%，批號TO2S8F42983)、丹參酮ⅡA(純度≥98%，批號Y20J8C40264)、厚樸酚(純度≥98%，批號Y27J10C91584)；吳茱萸堿(純度≥98%，批號X26A8P34704)(上海源葉生物科技有限公司)；辛弗林(純度≥98%，批號L1819126)[阿拉丁試劑(上海)有限公司]。月桂氮卓酮(芮城縣壹善中間體有限公司)；E-cadherin抗體(英國Abcam公司)。丁香、大黃、丹參、厚樸、枳實、吳茱萸均購自浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片有限公司，經(jīng)專家鑒定為正品。甲醇、乙腈、磷酸為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2018-0006。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取 稱取丁香200 g，置于圓底燒瓶中，加10倍量水浸泡12 h，采用2020年版《中國藥典》中的水蒸氣蒸餾法提取8 h，即得(具有濃郁香味的無色透明液體)，共27.5 mL，得率為13.75%，置于4 ℃冰箱中密封保存。

2.2 揮發(fā)油成分分析 參考文獻[7]報道。

2.2.1 樣品前處理 稱取適量揮發(fā)油，無水硫酸鈉處理，無水乙醇溶解。

2.2.2 分析條件

2.2.2.1 色譜 載氣高純度氦氣，分流比20∶1，體積流量1.0 mL/min；程序升溫(初始50 ℃，以5 ℃/min升至200 ℃，再以10 ℃/min升至300 ℃)；進樣量1 μL。

2.2.2.2 質(zhì)譜 EI離子源溫度200 ℃；電子能量70 eV；接口溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z30～500。

2.2.3 結(jié)果分析 采用全掃描模式，采集1.00 mg/L揮發(fā)油溶液，總離子流圖見圖1，將結(jié)果與NIST標準譜庫進行匹配度檢查，發(fā)現(xiàn)保留時間12.12、13.53、14.37、16.51 min處的成分分別為丁香酚、石竹烯、蛇麻烯、乙酰丁香酚，面積歸一化法測定其相對含量，結(jié)果見表1。

表1 揮發(fā)油主要成分相對含量測定結(jié)果

圖1 揮發(fā)油總離子流圖

2.3 在體皮膚滲透實驗

2.3.1 浸膏制備 將參黃散中5種組方藥材(大黃、丹參、枳實、厚樸、吳茱萸)粉碎，分別稱取200 g，置于圓底燒瓶中，加入10倍量80%乙醇減壓回流提取2次，每次1 h，濾過，收集合并濾液，即得。

2.3.2 分組與給藥 將大鼠隨機分為10組，分別為大黃浸膏組、大黃浸膏+揮發(fā)油組、丹參浸膏組、丹參浸膏+丁香組、厚樸浸膏組、厚樸浸膏+揮發(fā)油組、吳茱萸浸膏組、吳茱萸浸膏+揮發(fā)油組、枳實浸膏組、枳實浸膏+揮發(fā)油組，每組5只，尾部標號背部剃毛，自然飼養(yǎng)恢復1 d，背部脫毛左右位置分為2個區(qū)域，分別為各藥材浸膏組(0.72 g)、各藥材浸膏+揮發(fā)油組(0.72 g+20 μL)，將兩者涂于皮膚表面，空白巴布貼覆蓋(6 cm×6 cm，內(nèi)徑2 cm)，醫(yī)用膠帶纏繞固定。12、24 h后處死大鼠，取下給藥處皮膚，洗凈，剪碎，勻漿機將組織勻漿至乳糜狀，冰浴下采用探頭超聲提取30 min，在恒溫搖床中繼續(xù)提取12 h，將離心管在4 ℃、3 000 r/min下離心30 min，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，采用HPLC法測定大黃素、丹參酮ⅡA、厚樸酚、吳茱萸堿、辛弗林含量[8]，計算其皮膚滯留量，公式為皮膚滯留量=(藥物質(zhì)量濃度×提取液體積)/給藥面積。

2.3.3 結(jié)果分析 表2顯示，在體透皮12、24 h后，各藥材浸膏+揮發(fā)油組大鼠皮膚中各成分滯留量均高于各藥材浸膏組，表明揮發(fā)油具有明顯的促滲作用，可能與該成分可降低皮膚屏障功能有關。

表2 各成分在體透皮皮膚滯留量

2.4 揮發(fā)油對大鼠皮膚結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 角質(zhì)層采集 參考文獻[9]報道，將大鼠腹部皮膚置于0.5%胰酶溶液中，室溫放置12 h，更新胰酶溶液，繼續(xù)放置12 h，然后用棉簽小心剝離皮膚角質(zhì)層，蒸餾水洗凈，置于真空干燥箱中干燥。

2.4.2 分組與給藥 取1 cm×1 cm角質(zhì)層，隨機分為溶劑組、生理鹽水-無水乙醇(2∶3)組、0.5%揮發(fā)油組、0.5%氮酮組，向試管中加入相應溶液約10 mL，室溫靜置12 h，蒸餾水將角質(zhì)層表面沖洗干凈，濾紙吸干，真空干燥，采用全反射傅里葉紅外變換光譜(ATR-FTIR)對干燥后的角質(zhì)層進行掃描分析。

2.4.3 結(jié)果分析 表3、圖2顯示，與溶劑組比較，揮發(fā)油組皮膚角質(zhì)層CH2非對稱振動峰、對稱振動峰均向高峰位移動，表明該成分可使皮膚角質(zhì)層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)或構(gòu)象發(fā)生改變；振動Ⅰ峰向高峰位移動，振動Ⅱ峰產(chǎn)生裂峰，表明皮膚角質(zhì)層中角蛋白構(gòu)象可能有所變化[10]。

表3 皮膚角質(zhì)層脂質(zhì)、酰胺振動峰位移

注：a～c分別為揮發(fā)油組、氮酮組、溶劑組。圖2 大鼠皮膚角質(zhì)層ATR-FTIR圖譜

2.5 大鼠皮膚結(jié)構(gòu)觀察(光鏡) 大鼠背部脫毛后自然恢復1 d，按“2.3.2”項下方法給藥，24 h后處死，取用藥部位皮膚，10%甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟切片，進行HE、免疫組化染色。

圖3顯示，對照組大鼠皮膚角質(zhì)層緊密排列在活性表皮上，角質(zhì)層呈帶狀均勻分布，無角質(zhì)層脫落或游離；氮酮組、揮發(fā)油組大鼠皮膚角質(zhì)層脫落現(xiàn)象較明顯，一些區(qū)域外層角質(zhì)呈帶狀游離，表明揮發(fā)油改變了皮膚角質(zhì)層有序致密結(jié)構(gòu)，使其變得疏松，從而降低了皮膚的屏障作用[11]。

圖3 各組大鼠皮膚角質(zhì)層HE染色

E-cadherin是重要的細胞間連接分子, 可維持細胞形態(tài)、細胞運動及黏附功能，廣泛分布于上皮細胞(基底層和棘層細胞間)中，其低表達表明細胞間粘附作用減弱，皮膚通透性增加，使藥物更容易穿透皮膚[12-13]。圖4顯示，對照組大鼠角質(zhì)層皮膚中E-cadherin分布和表達較深，而氮酮組、揮發(fā)油組較淺。

圖4 各組大鼠皮膚角質(zhì)層免疫組化染色

2.6 大鼠皮膚結(jié)構(gòu)觀察(掃描電鏡) 將大鼠皮膚隨機分為對照組、揮發(fā)油組，分別涂抹大黃浸膏、含有丁香揮發(fā)油的大黃浸膏，立即處死，取皮，置于生理鹽水中漂洗，剪切成適宜大小，室溫下固定于2.5%戊二醛固定液中12 h，0.1 mol/L磷酸緩沖液中漂洗3次，每次10 min，再置于1%鋨酸中固定1 h，依次經(jīng)50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇→乙醇→乙醇→50%叔丁醇→70%叔丁醇→80%叔丁醇→90%叔丁醇→叔丁醇→叔丁醇各脫水10 min，完全干燥后在掃描電鏡下觀察。

圖5顯示，對照組大鼠皮膚表面光滑，角質(zhì)層細胞緊密堆積排列，裂隙較窄，部分細胞碎屑及其分泌物附著于表皮上；揮發(fā)油組大鼠表皮折皺明顯增多，角質(zhì)層脫落較明顯，表皮間裂隙增寬，角質(zhì)層明顯疏松，可見孔穴樣結(jié)構(gòu)。

圖5 各組大鼠皮膚橫切面形態(tài)

圖6顯示，對照組大鼠表皮角質(zhì)層結(jié)構(gòu)比較緊密，各層之間無明顯間隙；揮發(fā)油組大鼠表皮角質(zhì)層結(jié)構(gòu)出現(xiàn)松動，各層之間出現(xiàn)明顯間隙。

圖6 各組大鼠皮膚縱切面形態(tài)

3 討論與結(jié)論

皮膚角質(zhì)層致密的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)是藥物經(jīng)皮吸收的主要屏障，其所含脂質(zhì)成分及角蛋白結(jié)構(gòu)、構(gòu)象等發(fā)生變化時，可導致其通透性及屏障作用改變。研究表明，丁香揮發(fā)油對多種藥物的經(jīng)皮吸收具有促透作用，但其促透機制不明確。

本實驗發(fā)現(xiàn)，丁香揮發(fā)油可通過影響大鼠皮膚角質(zhì)層的脂質(zhì)和角蛋白構(gòu)象來增加其流動性，降低皮膚屏障功能，從而發(fā)揮經(jīng)皮促滲作用；對參黃散有效成分均有明顯促滲作用，強度依次為厚樸酚>丹參酮ⅡA>大黃素>吳茱萸堿>辛弗林，其機制除了與該成分可降低皮膚屏障功能有關外，還可能因為它由親脂劑組成，更有利于對親脂藥物的滲透。

HE染色顯示，丁香揮發(fā)油改變了大鼠皮膚角質(zhì)層的有序致密的結(jié)構(gòu)，從而降低其屏障作用。與對照組比較，揮發(fā)油組皮膚E-cadherin水平降低,表明該成分促滲作用還與細胞黏附分子減少有關。在掃描電鏡下發(fā)現(xiàn)，丁香揮發(fā)油處理過的皮膚表皮皺折明顯增多，角質(zhì)層脫落明顯，表皮角質(zhì)層結(jié)構(gòu)松動。

綜上所述，丁香揮發(fā)油對參黃散中有效成分具有優(yōu)良的透皮促滲作用，可為該方治療術(shù)后腸動力障礙提供實驗支持，也為相關經(jīng)皮給藥制劑開發(fā)提供依據(jù)。