余甘子干鮮品化學(xué)成分比較

鄧桂珠， 甘國興， 李 煒， 向燕芬， 龍國斌， 盧 泳， 吳茂勇， 朱衛(wèi)星*

(1.廣東省鮮藥民族醫(yī)藥工程技術(shù)研究中心，廣東 清遠(yuǎn) 511500；2.清遠(yuǎn)市中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 清遠(yuǎn) 511500)

余甘子系藏族習(xí)用藥材，為大戟科植物余甘子PhyllanthusemblicaL.的成熟果實，其味甘、酸、澀，性涼，歸肺、胃經(jīng)，具有清熱涼血、消食健胃、生津止咳的功效[1]，是藥食同源藥材[2]，富含鞣質(zhì)、維生素C、黃酮、氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖等成分。研究表明，余甘子新鮮果實中單寧含量高達(dá)45%，干燥果實中也有14%[3-4]，營養(yǎng)價值高[5]，具有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗腫瘤、抗突變、降血脂、降血壓、抑菌、保肝等藥理作用[6-12]。

目前，臨床應(yīng)用余甘子以干品為主，而嶺南民間習(xí)用鮮品[13-14]，歷史悠久[15]。但對余甘子研究主要集中于藥學(xué)、藥理作用、臨床應(yīng)用等方面，對鮮品涉及極少，干鮮品化學(xué)成分的差異也鮮有報道。在治療疾病的過程中，中醫(yī)傳統(tǒng)上使用鮮藥，往往具有獨特的或是比干品更顯著的效果[16]。

本研究對余甘子干鮮品的黃酮、鞣質(zhì)部位進(jìn)行HPLC指紋圖譜研究，并對總鞣質(zhì)、總黃酮、沒食子酸、蘆丁含量進(jìn)行測定，以期為其后續(xù)臨床應(yīng)用及藥理藥效考察提供參考。

1 材料

Waters 2695型高效液相色譜系統(tǒng)(美國沃特世公司，配置Waters 2489型紫外檢測器、Empower工作站)；Aglient ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；U-2910型紫外-分光光度計(天美科技有限公司)；XS205型電子天平[十萬分之一，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；DFY-500D 500 g搖擺式高速粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；KH-100A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海恒科學(xué)儀器有限公司)；SP-100A型超聲波清洗器(潔康超聲波儀器設(shè)備有限公司)；XMTD-7000型水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)。沒食子酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，純度91.5%)；蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，供HPLC法測定，純度91.7%；供UV法測定，純度92.4%)。乙腈、甲醇、磷酸、冰乙酸為色譜純；其他試劑均為分析純；水為屈臣氏水。

10批余甘子從廣東、云南、福建采收，經(jīng)清遠(yuǎn)市中醫(yī)院藥學(xué)部朱衛(wèi)星主任鑒定為大戟科余甘子PhyllanthusemblicaL.的果實。鮮品按照《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》第一冊[15]處理(抹去表面水分，除去果核，用非鐵質(zhì)刀具切細(xì))，干品是將切細(xì)后的鮮品置于60 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥制成，水分符合2020年版《中國藥典》要求，具體信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 總鞣質(zhì)含量測定 參照2020年版《中國藥典》第四部總鞣質(zhì)含量測定方法。

2.1.1 對照品溶液制備和線性關(guān)系考察 精密稱取沒食子酸對照品適量，20%乙醇稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為43 μg/mL的貯備液。精密量取1、2、3、4、5、6 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液1 mL，再分別加水11、10、9、8、7、6 mL，29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min，以相應(yīng)的試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法(通則0401)，在760 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)(A)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得方程為A=0.088 2X+0.060 5(r=0.999 8)。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱定藥材粉末1 g(過3號篩)，置于100 mL棕色量瓶中，加乙醇浸泡，超聲處理后放冷，乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液50 mL，精密量取續(xù)濾液5 mL，置于50 mL棕色量瓶中，20%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 提取方法優(yōu)化 通過單因素試驗，分別對乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、浸泡時間進(jìn)行考察，同時采用L9(34)正交試驗，獲得最佳提取方法為加入20%乙醇浸泡30 min(料液比1∶50)，超聲處理60 min。

2.1.4 結(jié)果分析 按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，測定10批干鮮品總鞣質(zhì)含量。結(jié)果，鮮品總鞣質(zhì)含量范圍為4.13%～9.55%，干品總鞣質(zhì)為2.99%～8.69%，以云南產(chǎn)地最高，并且鮮品高于干品，見圖1。

圖1 余甘子干鮮品總鞣質(zhì)含量比較Fig.1 Comparison of the contents of total tannins between fresh and dry P. emblica

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 操作 參照2020年版《中國藥典》第四部紫外-分光光度法，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，510 nm波長處吸光度為縱坐標(biāo)(A)進(jìn)行回歸，得方程為A=7.634 7X+0.018 2(r=0.999 9)。樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后取2 mL，加入4 mL水、1 mL 5%亞硝酸鈉溶液搖勻，靜置6 min，加入1 mL 10%硝酸鋁搖勻，靜置6 min，加入6 mL 10%氫氧化鈉搖勻，加水定容至20 mL棕色量瓶中，靜置15 min后測定吸光度，計算總黃酮提取率。

2.2.2 總黃酮提取方法優(yōu)化 通過單因素試驗，對乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、溫度進(jìn)行考察，同時采用L9(34)正交試驗，獲得最佳提取方法為加入60%乙醇后70 ℃水浴(料液比1∶60)，超聲處理20 min。

2.2.3 結(jié)果分析 按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下方法測定10 批余甘子干鮮品總黃酮含量。結(jié)果，鮮品總黃酮含量范圍為1.54%～6.01%，干品總黃酮為1.91%～7.03%，以云南產(chǎn)地最高，并且鮮品低于干品，見圖2。

圖2 余甘子干鮮品總黃酮含量比較Fig.2 Comparison of the contents of total flavonoids between fresh and dry P. emblica

2.3 鞣質(zhì)部位HPLC指紋圖譜建立

2.3.1 色譜條件 Aglient ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脫(0～4 min，體積流量1.0 mL/min，5%A；4～4.01 min，體積流量1.0～0.3 mL/min，5%A，4.01～30 min，體積流量0.3 mL/min，5%A；30～35 min，體積流量0.3～mL/min，5%A；35～35.01 min，體積流量0.5～1.0 mL/min，5%A；35.01～40 min，體積流量1.0 mL/min，5%～20%A)；柱溫25 ℃；檢測波長260 nm；進(jìn)樣量5 μL。

2.3.2 溶液制備

2.3.2.1 對照品 精密稱取沒食子酸對照品適量，加20%乙醇制成質(zhì)量濃度為43 μg/mL的溶液，即得。

2.3.2.2 HPD100大孔樹脂預(yù)處理 稱取30 g大孔樹脂，加入95%乙醇沒過液面浸泡24 h，再用水浸泡4 h，上樣前用200 mL水沖洗柱子。

2.3.2.3 干品供試品 按“2.1.3”項下方法提取，精密稱取藥材粉末(過3號篩)1.0 g，加入20%乙醇50 mL，置于100 mL棕色量瓶中浸泡30 min，50 ℃水浴超聲提取60 min，放冷，20%乙醇定容至刻度，濾過，濾液水浴蒸干，蒸干后的殘渣用10 mL水溶解，加到處理好的大孔樹脂中，靜置20 min后用90 mL水沖洗柱子，收集洗脫液，置于水浴鍋中蒸干，殘渣用20%乙醇溶解，定容于25 mL量瓶中，精密量取1 mL至10 mL量瓶中，即得，進(jìn)樣前過0.45 μm微孔濾膜。

2.3.2.4 鮮品供試品 鮮品切制小塊，按表1干鮮品兌換比精密稱取適量，研磨成漿，剩余步驟同“2.3.2.3”項，即得。

2.3.3 方法學(xué)考察

2.3.3.1 精密度試驗 取同一份供試品溶液，在“2.3.1”項條件下進(jìn)樣測定6次，測得各色譜峰相對保留時間RSD均小于1%，相對峰面積RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.3.2 重復(fù)性試驗 取同一批樣品(編號G6)過3號篩，按“2.3.2”項下方法制備干品供試品溶液，在“2.3.1”項條件下進(jìn)樣測定，測得各色譜峰相對保留時間RSD均小于1%，相對峰面積RSD均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于4、8、12、16、20、24 h在“2.3.1”項條件下進(jìn)樣測定，測得各色譜峰相對保留時間RSD均小于1%，相對峰面積RSD均小于2%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 圖譜生成 取對照品溶液，在“2.3.1”項條件下進(jìn)樣測定，獲得色譜圖；將10批干鮮品按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項條件下進(jìn)樣測定，獲得色譜圖。將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012A版)，采用平均數(shù)法和多點矯正法，時間寬度0.1 min，生成相應(yīng)的對照指紋圖譜，以沒食子酸為參照，10批干鮮品各標(biāo)定了5 個共有峰，但峰面積有差異，見圖3～4；鮮品相似度大于0.840 0，干品相似度大于0.770 0，表明各批樣品之間存在差異，可能與采收時間和產(chǎn)地來源有關(guān)。

圖3 10 批余甘子鮮品鞣質(zhì)部位指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of tannin fraction of ten batches of fresh P. emblica

2.4 黃酮部位HPLC指紋圖譜建立

2.4.1 色譜條件 Aglient ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～20 min，10%～16%A；20～40 min，16%～18%A；40～45 min，18%～40%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長360 nm；進(jìn)樣量10 μL。

圖4 10 批余甘子干品鞣質(zhì)部位指紋圖譜Fig.4 HPLC fingerprints of tannin fraction of ten batches of dry P. emblica

2.4.2 溶液制備

2.4.2.1 對照品 精密稱取蘆丁對照品適量，60%乙醇制成質(zhì)量濃度為59.26 μg/mL的溶液，即得。

2.4.2.2 干品供試品 精密稱取藥材粉末(過3號篩)1.0 g，加入60%乙醇60 mL，稱定質(zhì)量，70 ℃水浴超聲處理20 min，放冷，60%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣用60%乙醇溶解并定容至25 mL量瓶中，即得，進(jìn)樣前過0.45 μm微孔濾膜。

2.4.2.3 鮮品供試品 鮮品切制小塊，按表1干鮮品兌換比精密稱取適量，研磨成漿，剩余步驟同“2.4.2.2”項，即得。

2.4.3 方法學(xué)考察

2.4.3.1 精密度試驗 取同一份供試品溶液，在“2.4.1”項條件下進(jìn)樣測定6次，測得各色譜峰相對保留時間RSD均小于1%，相對峰面積RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.3.2 重復(fù)性試驗 取同一批樣品(編號G6)過3號篩，按“2.4.2”項下方法制備干品供試品溶液，在“2.4.1”項條件下進(jìn)樣測定，測得各色譜峰相對保留時間RSD均小于1%，相對峰面積RSD均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于4、8、12、16、20、24 h在“2.4.1”項條件下進(jìn)樣測定，測得各色譜峰相對保留時間RSD均小于1%，相對峰面積RSD均小于3%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 圖譜生成 取對照品溶液，在“2.4.1”項條件下進(jìn)樣測定，獲得色譜圖；將10批干鮮品按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.4.1”項條件下進(jìn)樣測定，獲得色譜圖。將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012版)，采用平均數(shù)法和多點矯正法，時間寬度0.1 min，生成相應(yīng)對照指紋圖譜，以峰面積最大的蘆丁為參照，鮮品共有峰有7個，干品共有峰有10個。將干鮮品指紋圖譜的共有模式進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)兩者共有峰為7 個(1～7號峰)，峰面積和數(shù)量均不同，表明化學(xué)成分存在差異，見圖5～7。同時，測得各批樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.85，表明它們之間存在差異，可能與采收時間和產(chǎn)地來源有關(guān)。

圖5 10批余甘子鮮品黃酮部位指紋圖譜Fig.5 HPLC fingerprints of flavanoid fraction of ten batches of fresh P. emblica

圖6 10批余甘子干品黃酮部位指紋圖譜Fig.6 HPLC fingerprints of flavanoid fraction of ten batches of dry P. emblica

注：X為余甘子鮮品共有指紋圖譜，G為余甘子干品共有指紋圖譜。圖7 余甘子干鮮品指紋圖譜共有模式Fig.7 Common patterns of fingerprints for dry and fresh P. emblica

2.5 沒食子酸含量測定

2.5.1 色譜條件 Aglient ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脫(0～4 min，體積流量1.0 mL/min,5%A；4～4.01 min，體積流量1.0～0.3 mL/min，5%A；4.01～15 min，體積流量0.3 mL/min，5%A；15～17 min，體積流量0.3～1.0 mL/min，5%～20%A；17～23 min，體積流量1.0 mL/min，20%～5%A)；柱溫25 ℃；檢測波長273 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.5.2 溶液制備

2.5.2.1 對照品 精密稱取沒食子酸對照品適量，20%乙醇稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為98.4 μg/mL的溶液，即得。

2.5.2.2 干品供試品 按“2.1.3”項下方法提取，精密稱取藥材粉末(過3號篩)1.0 g，加入20%乙醇50 mL，置于100 mL棕色量瓶中浸泡30 min，50 ℃水浴超聲提取60 min，放冷，20%乙醇定容至刻度，濾過，取續(xù)濾液，即得，進(jìn)樣前過0.45 μm微孔濾膜。

2.5.2.3 鮮品供試品溶液 鮮品切制小塊，按表1兌換比精密稱取適量，研磨成漿，剩余步驟同“2.5.2.2”項，即得，色譜圖見圖8。

注：S1為對照品圖譜，S2為樣品圖譜。1.沒食子酸1.gallic acid圖8 余甘子HPLC色譜圖(Ⅰ)Fig.8 HPLC chromatogram of P. emblica(Ⅰ)

2.5.3 方法學(xué)考察

2.5.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取“2.5.2”項下對照品溶液1、2、3、4、5、6、7、8 mL，置于10 mL量瓶中定容，過0.45 μm微孔濾膜，吸取10 μL，在“2.5.1”項條件下進(jìn)樣測定。以沒食子酸進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程為Y=107 205X-231 130(r=0.999 6)，在0.09～0.72 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.3.2 精密度試驗 取同一份對照品溶液，在“2.5.1”項條件下進(jìn)樣測定6次，測得沒食子酸峰面積RSD為1.97%，表明儀器精密度良好。

2.5.3.3 重復(fù)性試驗 取同一批樣品(編號G6)過3號篩，按“2.5.2”項下方法制備干品供試品溶液，在“2.5.1”項條件下進(jìn)樣測定，測得沒食子酸含量RSD為1.85%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、4、8、12、16、20、24 h在“2.5.1”項條件下進(jìn)樣測定，測得沒食子酸含量RSD為1.35%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取藥材(編號G6)9份，按高、中、低水平加入對照品溶液，平行3份，按“2.5.2”項下方法制備干品供試品溶液，在“2.5.1”項條件下進(jìn)樣測定，測得沒食子酸平均加樣回收率為100.19%，RSD為1.37%。

2.5.4 樣品含量測定 精密稱定10批干鮮品，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項條件下進(jìn)樣測定，計算含量。結(jié)果，鮮品沒食子酸含量范圍為0.062%～0.427%，干品沒食子酸為0.064%～0.691%，以云南產(chǎn)地最高，并且鮮品低于干品，見圖9。

圖9 余甘子干鮮品沒食子酸含量比較Fig.9 Comparison of the contents of gallic acid between fresh and dry P. emblica

2.6 蘆丁含量測定

2.6.1 色譜條件 Aglient ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～35 min，10%～18%A；35～40 min，18%～10%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長360 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.6.2 溶液制備

2.6.2.1 對照品 精密稱取蘆丁對照品適量，60%乙醇制成質(zhì)量濃度為0.215 4 mg/mL的溶液，即得。

2.6.2.2 干品供試品 精密稱取藥材粉末(過3號篩)1.0 g，加入60%乙醇60 mL，稱定質(zhì)量，70 ℃水浴超聲處理20 min，放冷，60%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得，進(jìn)樣前過0.45 μm微孔濾膜。

2.6.2.3 鮮品供試品溶液 鮮品切制小塊，按表1兌換比精密稱取適量，研磨成漿，剩余步驟同“2.6.2.2”項，即得，色譜圖見圖10。

注：L1為對照品，L2為鮮品。1.蘆丁1.rutin圖10 余甘子HPLC色譜圖(Ⅱ)Fig.10 Liquid spectrum of P. emblica(Ⅱ)

2.6.3 方法學(xué)考察

2.6.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取“2.6.2”項下對照品溶液1、2、3、4、5、6、7 mL，置于10 mL量瓶中，過0.45 μm微孔濾膜，吸取10 μL，在“2.6.1”項條件下進(jìn)樣測定。以蘆丁進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程為Y=16 445X+153 445(r=1.000 0)，在0.20～1.38 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.3.2 精密度試驗 取同一份對照品溶液，在“2.6.1”項條件下進(jìn)樣測定6次，測得蘆丁峰面積RSD為0.64%，表明儀器精密度良好。

2.6.3.3 重復(fù)性試驗 取同一批樣品(編號G6)過3號篩，按“2.6.2”項下方法制備干品供試品溶液，在“2.6.1”項條件下進(jìn)樣測定，測得蘆丁含量RSD為2.76%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于4、8、12、16、20、24 h在“2.6.1”項條件下進(jìn)樣測定，測得蘆丁含量RSD為2.45%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取樣品(編號G6)9 份，按高、中、低水平加入對照品溶液，按“2.6.2”項下方法制備干品供試品溶液，平行3份，在“2.6.1”項條件下進(jìn)樣測定，測得蘆丁平均加樣回收率為99.09%，RSD為1.86%。

2.6.4 樣品含量測定 精密稱定10 批干鮮品，按“2.6.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.6.1”項條件下進(jìn)樣測定，計算含量。結(jié)果，鮮品蘆丁含量范圍為0.05%～0.10%，干品為0.22%～0.49%，3個產(chǎn)地相當(dāng)，并且鮮品低于干品，見圖11。

圖11 余甘子干鮮品蘆丁含量比較Fig.11 Comparison of the contents of rutin between fresh and dryP. emblica

3 討論

中藥在臨床使用中，常有干品、熟品、鮮品之分，鮮品即鮮藥材，也稱鮮藥，是指未經(jīng)干燥及加工處理的、具有治療疾病或保健作用的新鮮植物藥、動物藥、菌類藥，是針對干藥材而言[17]。鮮藥是傳統(tǒng)中醫(yī)臨床上的特色用藥之一，具有悠久的歷史，在兩千多種常用中草藥中以其為主的高達(dá)486種[18]。余甘子被國家衛(wèi)生部列入“既是食品又是藥品”的名單，也被世界衛(wèi)生組織指定為在全世界推廣種植的三大保健植物之一，開發(fā)潛力巨大。

余甘子干鮮品均具有清熱涼血、消食健脾、生津止咳的功效，中醫(yī)認(rèn)為鮮品在清熱涼血、生津方面上較干品更優(yōu)。本研究發(fā)現(xiàn)，余甘子鮮品總鞣質(zhì)含量顯著高于干品，推測前者上述功效優(yōu)于后者可能與此有關(guān)；在余甘子干鮮品鞣質(zhì)部位HPLC指紋圖譜中，鮮品鞣質(zhì)部位1、2號峰的峰面積高于干品，進(jìn)一步印證了這一點。

另外，余甘子干品總黃酮、蘆丁、沒食子酸含量均高于鮮品，推測前者消食健胃功效優(yōu)于后者可能與此有關(guān)；干品HPLC指紋圖譜的共有峰數(shù)量比鮮品多，峰面積也有差異，進(jìn)一步印證了這一點。

綜上所述，余甘子干鮮品化學(xué)成分的差異與其中醫(yī)臨床應(yīng)用的不同有一定聯(lián)系，但后期仍需繼續(xù)對其進(jìn)行藥效學(xué)驗證。