黃連中1個(gè)新型生物堿的研究

孫 雨， 蘇本正， 蔣海強(qiáng)， 王 珺， 于宗淵*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014)

黃連CoptischinensisFranch為毛茛科黃連屬植物，主產(chǎn)于四川峨眉、洪雅、彭州，重慶石柱、巫山，湖北利川等地[1]，在歷代本草《名醫(yī)別錄》《唐本草》《本草綱目》中均有記載[2]，其中峨眉是道地主產(chǎn)區(qū)，其味苦性寒，無(wú)毒，歸心、肝、胃、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、止血涼血的功效[3]，具有多種藥理活性，主要為抗菌[4]、抗炎、抗氧化[5]、降壓及擴(kuò)張血管、舒張平滑肌[6]、保護(hù)胃黏膜[7]、保護(hù)中樞神經(jīng)細(xì)胞[8]、調(diào)血脂[9]、降血糖等[10-11]，具有較高的藥用和保健價(jià)值[12-13]。目前，從黃連屬植物中發(fā)現(xiàn)的生物堿均為異喹啉類生物堿，絕大多數(shù)為芐基異喹啉類，包括原小檗堿類、雙芐基異喹啉類、阿樸菲類、苯菲啶類等，其中原小檗堿類又包括原小檗堿型、氧化原小檗堿型、甲基原小檗堿型、四氫原小檗堿型等，以季銨型生物堿為主[14]。大量研究表明，生物堿是黃連主要有效成分[15]，現(xiàn)已從中發(fā)現(xiàn)了四十多種，其中小檗堿、黃連堿、表小檗堿、巴馬汀、藥根堿在黃連總生物堿中的占比高達(dá)70%～80%，除此之外還含有木脂素、香豆素、黃酮、萜類、甾體、有機(jī)酸、揮發(fā)油、多糖等多種成分[16]。為深入探究黃連藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，通過(guò)1H-NMR、13C-NMR等波譜技術(shù)和從相近的極性環(huán)境中分離得到3個(gè)化合物，其中，化合物1為未見文獻(xiàn)報(bào)道的新型芐基異喹啉生物堿，結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of compound 1

1 材料

VANCE III-600型核磁共振儀(瑞士布魯克公司)；UV3000型紫外光譜測(cè)定儀(日本日立公司)；NEXUS 670 FT-IR型紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；Agilent 1260型高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-Q-TOF-MS)(美國(guó)Agilent公司)；半制備色譜柱ODS-2(20 mm×250 mm, 5 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司)；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、CCA-1112A型低溫冷卻液循環(huán)泵(上海愛(ài)朗儀器有限公司)；Bio-Rad SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；VG AutoSPE-3000光譜儀(德國(guó)斯派克分析儀器公司)；HP-Q-UV100型高壓制備液相色譜儀(天津博納艾杰爾科技有限公司)。

薄層色譜硅膠GF254(100 mm×100 mm)、柱色譜用硅膠(100～200、200～300目)(青島海洋化工有限公司)。98%硫酸(重慶川東化工有限公司)；甲醇、乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

黃連于2018年購(gòu)自山東省濟(jì)南百味堂中藥飲片公司(批號(hào)180506)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李峰教授鑒定為毛茛科黃連屬黃連CoptischinensisFranch的根莖，樣品保存放于山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

2 提取與分離

取黃連干燥根莖10 kg，75%乙醇室溫浸漬提取3次，每次8 d，提取液過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮至無(wú)醇味，依次用石油醚(3×5 L)、二氯甲烷(3×5 L)、乙酸乙酯(3×5 L)、正丁醇(3×5 L)萃取，減壓濃縮得二氯甲烷萃取物33.6 g，經(jīng)硅膠柱(石油醚-乙酸乙酯梯度)洗脫，分離得到3個(gè)流分Fr.1～Fr.3。Fr.1經(jīng)半制備HPLC(甲醇-水)洗脫，得到化合物1、2、3。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

在1H-NMR譜中，低場(chǎng)區(qū)有3組芳香氫的質(zhì)子信號(hào)[δH8.37(1H, d,J=5.4 Hz, H-3)，7.86(1H, d,J=5.4 Hz, H-4)；7.49(1H, s, H-5)，7.38(1H, s, H-8)；7.31(1H, d,J=8.4 Hz, H-6′)，7.18(1H, d,J=8.4 Hz, H-5′)]、1個(gè)亞甲二氧基質(zhì)子信號(hào)[δH6.24(2H, s)]，中場(chǎng)區(qū)給出1個(gè)連氧亞甲基質(zhì)子信號(hào)[δH4.09(2H, q,J=7.2 Hz, COOCH2CH3)]，高場(chǎng)區(qū)給出1個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào)[δH1.18(3H, t,J=7.2 Hz, COOCH2CH3)]、2個(gè)甲氧基質(zhì)子信號(hào)[δH3.92(3H, s, 4′-OCH3)，3.78(3H, s, 3′-OCH3)]。在13C-NMR譜中有22個(gè)碳信號(hào)，包括2個(gè)羰基碳信號(hào)[δC193.2(CO),δC166.1(C-1″)]、1組異喹啉碳信號(hào)[δC152.9(C-1)，150.9(C-7)，149.5(C-6)，140.3(C-5)，135.2(C-4a)，123.0(C-8a)，122.6(C-4)，112.8(C-8)，102.9(C-3)；156.6(C-4′)，145.7(C-3′)，129.9(C-2′)，129.6(C-5′)，127.8(C-1′)，100.6(C-6′)]、1個(gè)亞甲二氧基信號(hào)(δC102.4)、1個(gè)亞甲基碳信號(hào)[δC61.0(C-2″)]、2個(gè)甲氧基碳信號(hào)[δC61.3(3′-OCH3)，56.4(4′-OCH3)]、1個(gè)甲基碳信號(hào)[δC13.8(C-3″)]，通過(guò)數(shù)據(jù)分析和文獻(xiàn)比對(duì)，推測(cè)化合物1可能為生物堿[17]，再通過(guò) HSQC譜進(jìn)一步將其1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)予以歸屬，見表1。

表1 化合物1的1H-NMR(600 MHz, DMSO-d6)和13C-NMR數(shù)據(jù)(150 MHz, DMSO-d6)Tab.1 1H-NMR(600 MHz, DMSO-d6) and 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6) data on compound 1

根據(jù)1H-1H COSY譜可知，H-3(1H, d,J=5.4 Hz)與H-4(1H, d,J=5.4 Hz)相耦合，結(jié)合HMBC譜(圖2)中H-3與C-1(δ152.9)、C-4(δ122.6)、C-4a(δ135.2)相關(guān)，H-4與C-3(δ102.9)、C-5(δ140.3)、C-8a(δ123.0)相關(guān)，H-5(δ7.49, s)與C-6(δ149.5)、C-8a相關(guān)，H-8(δ7.38, s)與C-1、C-7(δ150.9)、C-4a相關(guān)，表明存在1個(gè)喹啉單元。結(jié)合碳譜、氫譜、HMBC譜中C-6、C-7的δC102.4、δH6.24(2H, s)發(fā)現(xiàn)，兩者有1個(gè)亞甲二氧基與喹啉單元相連；根據(jù)C-1′(δ127.8)、C-2′(δ129.9)、C-3′(δ145.7)、C-4′(δ156.6)、C-5′(δ129.6)、C-6′(δ100.6)、H-5′(1H, d,J=8.4 Hz)、H-6′(1H, d,J=8.4 Hz)位移值，并結(jié)合HMBC譜中H-5′與C-1′、C-3′、C-4′、C-6′相關(guān)，H-6′與C-2′、C-5′、-CO-相耦合，提示存在1個(gè)1′,2′,3′,4′-4取代的苯環(huán)；δC193.2位于低場(chǎng)區(qū)，說(shuō)明存在1個(gè)羰基，而且H-6′與其遠(yuǎn)程相關(guān),說(shuō)明羰基連在苯環(huán)的C1′位，同時(shí)羰基為強(qiáng)吸電子基團(tuán)，會(huì)使相連C的化學(xué)位移值升高；在異喹啉環(huán)上，C1的化學(xué)位移值達(dá)到了152.9，在DEPT 135譜圖中也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)化學(xué)位移值為152.9的碳，說(shuō)明C1與羰基碳相連；在1H-NMR中存在化學(xué)位移值為3.92、3.78的2個(gè)單峰，表明存在2個(gè)甲氧基，HMBC譜中4′-OCH3(δ3.92)與C-4′相關(guān)，3′-OCH3(δ3.78)與C-3′相關(guān)，說(shuō)明3′-OCH3、4′-OCH3分別與苯環(huán)上的C3′、C4′位相連；δH7.31、7.18的耦合常數(shù)為8.6 Hz，說(shuō)明這2個(gè)氫處于鄰位，而且δH7.31與C-6′直接相關(guān)，δH7.18與C-5′直接相關(guān)，表明δH7.31、δH7.18分別為C-6′、C-5′上的氫。H-2″(2H, q,J=7.2 Hz)與C-1″(δ166.1)、C-3″(δ13.8)相耦合，H-3″(3H, t,J=7.2 Hz)與C-2″(δ61.0)相耦合，H-2″與C-1″遠(yuǎn)程相關(guān)，說(shuō)明存在1個(gè)-COOCH2CH3片段連在苯環(huán)的C2′位；C-1位移值表明異喹啉單元與1′,2′,3′,4′-4取代的苯環(huán)通過(guò)-CO-相連。綜上所述，化合物1為1個(gè)新型異喹啉類生物堿，命名為6-([1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinoline-5-carbonyl)-2,3-dimethoxybenzoic acid ethyl ester。

圖2 化合物1的主要HMBC和1H-1H COSY相關(guān)Fig.2 Key HMBC and 1H-1H COSY correlations of compound 1

化合物2：白色粉末，ESI-MSm/z: 205.2[M+H]+,分子式C11H11NO3。1H-NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ:7.28(1H, s, H-8), 6.85(1H, s, H-5), 6.05(2H, s, -OCH2O-), 3.48(2H, t,J=6.6 Hz, H2-3), 2.98(3H, s, N-CH3), 2.86(2H, t,J=6.6 Hz, H2-4);13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ:163.2(C-1), 47.4(C-3), 27.2(C-4), 123.0(C-4a), 106.8(C-5), 149.8(C-6), 146.2(C-7), 107.2(C-8), 134.1(C-8a), 34.5(N-CH3), 101.5(-OCH2O-)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，故鑒定為oxohydrastinine。

化合物3：白色粉末，EI-MSm/z: 358.4[M]+，分子式C20H22O6。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 6.88(2H, s, H-2′, 2″)，6.75(2H, dd,J=9.0 Hz, H-6′, 6″)，6.72(2H, d,J=9.0 Hz, H-5′, 5″)，4.60(2H, d,J=4.2 Hz, H-2, 6)，4.11(4H, m, H-4, 8)，3.76(6H, s, -OCH3×2)，3.03(2H, m, H-1,5)；13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ:147.5(C-3′,3″), 146.0(C-4′,4″)，132.2(C-1′,1″)，118.7(C-6′,6″)，115.2(C-5′,5″)，110.4(C-2′,2″)，85.2(C-2,6)，70.9(C-4,8)，55.6(-OCH3×2)，53.6(C-1,5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道基本一致，故鑒定為pinoresinol。

4 討論

黃連是一種極具特色的傳統(tǒng)中藥，中醫(yī)臨床上常用來(lái)清熱解毒、預(yù)防上火、消炎殺菌，也常與其他中藥組成復(fù)方來(lái)治療各種疾病。本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃連化學(xué)成分進(jìn)行研究，采用多種分離純化技術(shù)和鑒定手段，從其75%乙醇提取物的二氯甲烷部位中發(fā)現(xiàn)3個(gè)化合物，包括1個(gè)新型異喹啉類生物堿，可為該藥材藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供依據(jù)，也為其深入開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，但上述成分的具體活性尚不明確，還需進(jìn)一步考察。