西紅花柱頭化學(xué)成分及其抗炎活性

童 鑫， 洪吟秋， 張 濤， 童應(yīng)鵬， 王 平*， 鄒忠梅*

(1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310024；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；3.臺(tái)州學(xué)院高等研究院天然產(chǎn)物與健康產(chǎn)品研究所，浙江 臺(tái)州 318000)

西紅花又名藏紅花、番紅花，由鳶尾科番紅花屬植物西紅花CrocussativusL.的柱頭干燥制成[1]，作為藥食兩用的貴重中藥，具有活血化瘀、溫經(jīng)涼血解毒、解郁安神功效[2]，以及抗抑郁、抗焦慮的潛在藥用價(jià)值[3]。

西紅花主要成分包括單萜類、二萜類、三萜類、四萜類及其衍生物[4-7]，此外還有少量黃酮類、酚酸類、蒽醌類、生物堿類[8-11]。研究顯示，小鼠西紅花柱頭乙醇提取物灌胃可減輕經(jīng)卡拉膠誘導(dǎo)的足腫脹癥狀并具有時(shí)間依賴性，證明西紅花柱頭乙醇部位具有抗炎活性[12]。針對(duì)西紅花柱頭95%乙醇提取物化學(xué)成分，本課題組進(jìn)行系統(tǒng)性分離和抗炎活性評(píng)價(jià)，從中分離并鑒定出14個(gè)化合物，其中化合物1是新化合物，2是新天然產(chǎn)物，6、8、13～14為首次從番紅花屬植物中分離得到，3、11具有一定抗炎活性。

1 材料

Advance Ⅲ型核磁共振儀(德國(guó)Bruker 公司)；Synapt G2 型超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀、2535型半制備高效液相色譜儀(美國(guó)Waters 公司)； gel CHP 20P型MIC(70～150 μmol/L，日本三菱公司)；Genysys-10S 型紫外光譜儀(美國(guó)Thermo公司)；大孔吸附樹(shù)脂D101型(東鴻化工有限公司)；YMC-Pack ODS-A 色譜柱(5 μm，10 mm×250 mm，日本YMC公司)；CHIRALCEL OD-H色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm，大賽璐藥物手性技術(shù)有限公司)；Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠(美國(guó)Pharmacia公司)；ODS(富士化學(xué)有限公司)；薄層色譜硅膠(GF254)、柱色譜硅膠(青島海洋化工廠)。RAW264.7細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；LPS(美國(guó)Sigma公司，L-2880)；Griess試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。甲醇等試劑均為分析純(北京化工廠)；實(shí)驗(yàn)用水為商用純凈水。

西紅花從浙江省建德市三都西紅花專業(yè)合作社采購(gòu)，經(jīng)浙江工業(yè)大學(xué)王平教授鑒定為西紅花CrocussativusL.干燥柱頭，標(biāo)本(編號(hào)20170302)保存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所國(guó)家中藥化合物庫(kù)。

2 提取與分離

4.5 kg藥材用95%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，提取液過(guò)濾合并后減壓濃縮，得到粗浸膏2.1 kg，加入8 L純水分散，等體積乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮稱定質(zhì)量，分別得乙酸乙酯、正丁醇、水部位254.5 g、520.0 g、1.5 kg。

254.5 g乙酸乙酯部位浸膏通過(guò)硅膠柱常壓層析，采用二氯甲烷-甲醇(100∶1、10∶1、1∶1)梯度洗脫，所得餾分合并為Fr.A ～ Fr.H。其中，F(xiàn)r.D(15.1 g)經(jīng)硅膠柱[二氯甲烷-甲醇(100∶1～1∶1)]梯度洗脫，然后由Sephadex LH-20[二氯甲烷-甲醇(1∶1)]純化得化合物6(11.2 mg)。Fr.E(47.5 g)通過(guò) MCI色譜柱[甲醇-水(85∶15～100∶0)]層析，硅膠柱[二氯甲烷-甲醇(250∶1～50∶1)]梯度洗脫，經(jīng)半制備HPLC得化合物7(18.2 mg)、8(37.7 mg)、9(330.4 mg)、10(39.5 mg)。

520 g正丁醇浸膏通過(guò)D101大孔樹(shù)脂[乙醇-水(30∶70～100∶0)]層析獲得餾分，合并為Fr.1～Fr.3。Fr.2(107 g)經(jīng)硅膠柱[乙酸乙酯-甲醇(10∶1～1∶1)]粗分得到Fr.2.A ～Fr.2.G。其中Fr.2.C(6 g)經(jīng)中壓ODS[甲醇-水(30∶70～100∶0)]與Sephadex LH-20(甲醇)層析減壓得到F.2.C.1～F.2.C.11，其中F.2.C.2經(jīng)半制備HPLC得化合物1(10 mg)，F(xiàn).2.C.11經(jīng)半制備HPLC得化合物13(11 mg)、14(5 mg)。F.2.C.12經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)得化合物11(60 mg)、12(50 mg)。Fr.3(40 g)經(jīng)硅膠柱[二氯甲烷-甲醇(50∶1～2∶1)]層析，得到Fr.3.A～Fr.3.G，其中Fr.3.C～Fr.3.G經(jīng)硅膠柱[石油醚-丙酮(100∶1～4∶1)]梯度洗脫和半制備型HPLC得化合物2(3 mg)、3(10 mg)、4(160 mg)、5(15 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 化合物1的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of compound 1

圖2 化合物1的主要HMBC和1H-1H COSY相關(guān)Fig.2 Key HMBC and1H-1H COSY correlations of compound 1

表1 化合物1的1H-NMR(400 MHz, Acetone-d4)和13C-NMR數(shù)據(jù)(100 MHz, Acetone-d4)Tab.1 1H-NMR(400 MHz, Acetone-d4) and 13C-NMR data(100 MHz, Acetone-d4) of compound 1

化合物2：無(wú)色油狀物。ESI-MSm/z：191.1[M+Na]+, 分子式C9H12O3。1H-NMR(600 MHz, Acetone-d6)δ: 7.52(1H, dd,J=15.5, 12.3 Hz, H-4), 7.24(1H, d,J=12.3 Hz, H-3), 6.47(1H, d,J=15.5 Hz, H-5), 3.70(3H, s, H-9), 2.32(3H, s, H-7), 2.08(3H, d,J=1.5 Hz, H-8);13C-NMR(150 MHz, Acetone-d6)δ: 198.1(C-6), 167.8(C-1), 136.9(C-4), 136.1(C-2), 135.7(C-3), 135.7(C-5), 52.1(C-9), 27.3(C-7), 13.1(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故鑒定為(2E,4E)-2-甲基-6-羰基-2,4-庚二烯酸甲酯。

化合物3：黃色粉末。ESI-MSm/z：285.0[M-H]-, 分子式C15H10O6。1H-NMR(600 MHz, Methanol-d4)δ: 8.08(2H, d,J=8.4 Hz, H-2′, H-6′), 6.90(2H,d,J=8.4 Hz, H-3′, H-5′), 6.39(1H, s, H-6), 6.18(1H, s, H-8);13C-NMR(150 MHz, Methanol-d4)δ: 175.9(C-4), 164.2(C-7), 161.1(C-5), 159.1(C-4′), 156.8(C-9), 146.6(C-2), 135.7(C-3), 129.3(C-2′, 6′), 122.3(C-1′), 114.9(C-3′, 5′), 103.1(C-10), 97.8(C-6), 93.1(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致,故鑒定為山柰酚。

化合物4：紅色粉末。ESI-MSm/z：675.2[M+Na]+, 分子式C32H44O14。1H-NMR(500 MHz, Methanol-d4)δ: 7.46(1H, m, H-10), 7.30(1H, d,J=9.3 Hz, H-10′), 6.85～6.80(2H, m, H-15, 15′), 6.76(1H, d,J=15.0 Hz, H-12), 6.72～6.60(m, 3H, H-11, 11′, 12′), 6.51～6.45(2H, m, H-14, 14′), 2.02(12H, s, H-19, 19′, 20, 20′), 5.55(1H, m, H-1″), 4.33(1H, d,J=7.8 Hz, H-1?);13C-NMR(125 MHz, Methanol-d4)δ: 172.2(C-8′), 168.6(C-8), 146.3(C-12), 145.1(C-12′), 142.0(C-10), 140.3(C-10′), 138.3(C-13), 137.9(C-13′), 137.5(C-14), 136.7(C-14′), 133.2(C-15), 132.7(C-15′), 126.4(C-9), 125.1(C-9′), 124.7(C-11,11′), 104.6(C-1″), 96.0(C-1′), 78.0(C-5″, 5?), 77.9(C-3?), 77.8(C-3″), 75.1(C-2?), 74.0(C-2″), 71.5(C-4?), 71.0(C-4″), 69.5(C-6″), 62.7(C-6?), 13.0(C-19′), 12.8(C-20′), 12.8(C-19′), 12.8(C-20′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致,故鑒定為單側(cè)西紅花酸龍膽二糖酯。

化合物5：白色粉末。ESI-MSm/z：501.1[M+Na]+, 分子式C20H30O13。1H-NMR(600 MHz, Methanol-d4)δ: 7.54(1H, dd,J=15.4, 12.3 Hz, H-4), 7.37(1H, d,J=12.3 Hz, H-3), 6.47(1H, d,J=15.4 Hz, H-5), 5.54(1H, d,J=7.62 Hz, H-1′), 4.31(1H, d,J=7.8 Hz, H-1″), 2.34(3H, s, H-7), 2.10(3H, d,J=1.2 Hz, H-8);13C-NMR(150 MHz, Methanol-d4)δ: 199.4(C-6), 165.9(C-1), 136.7(C-3), 136.3(C-5), 135.5(C-4), 134.9(C-2), 103.1(C-1″), 94.9(C-1′), 76.6(C-5′, C-5″), 76.4(C-3″), 76.3(C-3′), 73.6(C-2″), 72.5(C-2′), 70.0(C-4′), 69.4(C-4″), 68.0(C-6′), 61.2(C-6″), 26.3(C-7), 11.9(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故鑒定為(2E,4E)-2-甲基-6-羰基-2,4-庚二烯酸龍膽二糖酯。

化合物6：淡黃色粉末。ESI-MSm/z：309.1[2 M+H]+, 分子式C8H10O3。1H-NMR(500 MHz, Chloroform-d)δ: 7.32(1H, dq,J=11.7, 1.5 Hz, H-3), 7.41(1H, dq,J=15.1, 11.7 Hz, H-4), 6.44(1H, d,J=15.1 Hz, H-5), 2.34(3H, s, H-7), 2.08(3H, d,J=1.5 Hz, H-8);13C-NMR(125 MHz, Chloroform-d)δ: 172.6(C-1), 135.1(C-2), 135.8(C-3), 136.4(C-4), 137.3(C-5), 198.3(C-6), 28.4(C-7), 13.2(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故鑒定為(2E,4E)-2-甲基-6-羰基-2,4-庚二烯酸。

化合物7：無(wú)色油狀物。ESI-MSm/z：185.1[M+H]+, 分子式C10H16O3。1H-NMR(500 MHz, Acetone-d6)δ: 5.79(1H, s, H-2), 2.79(1H, d,J=17.2 Hz, H-6ax), 2.03(1H, d,J=17.2 Hz, H-6bx), 1.98(3H, s, H-7), 1.01(3H, s, H-8), 1.10(3H, s, H-9), 4.24(1H, d,J=11.4 Hz, H-10ax),3.78(1H, dd,J=11.4 Hz, 5.7 Hz, H-10bx);13C-NMR(125 MHz, Acetone-d6)δ: 197.8(C-1), 128.0(C-2), 164.5(C-3), 78.3(C-4), 41.0(C-5), 50.7(C-6), 20.1(C-7), 25.1(C-8), 24.3(C-9), 65.9(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，故鑒定為crocusatin M。

化合物8：無(wú)色油狀物。ESI-MSm/z：185.1[M+H]+, 分子式C10H16O3。1H-NMR(500 MHz, Methanol-d4)δ: 10.09(1H, s, 1-CHO), 3.85(1H, d,J=12.0 Hz, H-5), 3.69(1H, ddd,J=12.0, 8.0, 3.7 Hz, H-4), 1.63(1H, dd,J=12.6, 3.7 Hz, H-3bx), 1.53(1H, d,J=12.6 Hz, H-3ax), 2.17(3H, s, H-7), 1.26(3H, s, H-8), 1.20(3H, s, H-9);13C-NMR(125 MHz, Methanol-d4)δ: 194.7(CHO), 156.1(C-2), 141.6(C-1), 78.5(C-5), 70.4(C-4), 46.9(C-3), 36.5(C-6), 27.6(C-8), 29.7(C-9), 14.3(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致,故鑒定為crocusatin K。

化合物9：無(wú)色油狀物。ESI-MSm/z：119.0[M-H]-,分子式C4H8O4。1H-NMR(500 MHz, Methanol-d4)δ: 4.66(1H, t,J=6.5 Hz, H-3), 4.41(1H, dd,J=12.0, 6.0 Hz, H-4bx), 4.29(1H, d,J=12.0 Hz, H-4ax), 2.74(1H, dd,J=18.0, 6.0 Hz, H-2bx), 2.51(1H, d,J=18.0 Hz, H-2ax)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定為3,4-二羥基丁酸。

化合物10：無(wú)色針狀晶體,易溶于甲醇。ES-MSm/z：137.0[M-H]-,分子式C7H6O3。1H-NMR(500 MHz, Methanol-d4)δ: 7.88(2H, d,J=8.6 Hz, H-2, H-6), 6.82(2H, d,J=8.6 Hz, H-3, H-5)。結(jié)合文獻(xiàn)[19]與對(duì)羥基苯甲酸對(duì)照品的TLC薄層色譜比對(duì),鑒定為對(duì)羥基苯甲酸。

化合物11：黃色粉末。ESI-MSm/z：449.1[M+H]+,C21H20O11。1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 12.49(1H, s, 5-OH), 10.16(1H, s, 3-OH), 9.55(1H, s, 4′-OH), 8.07(2H, d,J=8.8 Hz, H-2′, 6′), 6.94(2H, d,J=8.8 Hz, H-3′, 5′), 6.80(1H, d,J=2.0 Hz, H-8), 6.42(1H, d,J=2.0 Hz, H-6), 5.07(1H, d,J=6.8 Hz, H-1″);13C-NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 176.6(C-4), 162.5(C-7), 160.8(C-5), 159.9(C-4′), 156.2(C-9), 148.0(C-2), 136.5(C-3), 130.1(C-2′, 6′), 122.0(C-1′), 115.9(C-3′, 5′), 105.2(C-10), 100.3(C-1″), 94.8(C-6), 94.8(C-8), 77.6(C-3″), 76.9(C-5″), 73.6(C-2″), 70.0(C-4″), 61.1(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道基本一致，故鑒定為山柰酚7-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物12：黃色粉末。ESI-MSm/z：449.1[M+H]+,分子式C21H20O11。1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 12.62(1H, s, OH-5), 10.89(1H, s, 7-OH), 10.21(1H, s, 4′-OH), 8.05(2H, d,J=8.8 Hz, H-2′, 6′), 6.89(2H, d,J=8.8 Hz, H-3′, 5′), 6.44(1H, d,J=1.9 Hz, H-8), 6.22(1H, d,J=2.0 Hz, H-6), 5.47(1H, d,J=7.3 Hz, H-1″);13C-NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 177.9(C-4), 164.6(C-7), 161.7(C-5), 160.4(C-4′), 156.9(C-9), 156.4(C-2), 133.6(C-3), 131.3(C-2′, 6′), 121.3(C-1′), 115.6(C-3′, 5′), 104.5(C-10), 101.3(C-1′), 99.2(C-6), 94.1(C-8), 77.9(C-3″), 76.9(C-5″), 74.6(C-2″), 70.3(C-4″), 61.3(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致，故鑒定為山柰酚3-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物13：黃色粉末。ESI-MSm/z：457.1[M+Na]+,分子式C21H22O10。1H-NMR(400 MHz, Methanol-d4)δ: 7.31(2H, d,J=7.7 Hz, H-2′, 6′), 6.81(2H, d,J=8.4 Hz, H-3′, 5′), 6.24～6.15(2H, m, H-6, 8), 5.36(1H, d,J=12.8 Hz, H-2), 4.96(1H, d,J=6.9 Hz, H-1″), 3.87(1H, d,J=11.3 Hz, H-6bx″), 3.68(1H, dd,J=11.3, 5.3 Hz, H-6ax″), 3.54～3.37(4H, m, H-2″, 5″), 3.14(1H, d,J=15.2 Hz, H-3bx), 2.73(1H, d,J=17.2 Hz, H-3ax);13C-NMR(100 MHz, Methanol-d4)δ: 197.2(C-4), 165.6(C-5), 163.5(C-7), 163.2(C-9), 157.7(C-4′), 129.5(C-1′), 127.7(C-2′, 6′), 115.0(C-3′, 5′), 103.5(C-10), 99.8(C-1″), 96.6(C-6), 95.5(C-8), 79.3(C-2), 76.9(C-3″), 76.4(C-5″), 73.2(C-2″), 69.7(C-4″), 60.9(C-6″), 42.7(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道基本一致，故鑒定為柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物14：黃色粉末。ESI-MSm/z：457.1[M+Na]+,分子式C21H20O11。1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ:7.41(2H, d,J=8.7 Hz, H-2′, 6′), 7.04(2H, d,J=8.7 Hz, H-3′, 5′), 5.87(2H, m,J=4.9 Hz, H-6, 8), 5.49(1H, dd,J=12.5, 2.8 Hz, H-2), 4.86(1H, d,J=7.2 Hz, H=1″), 3.68(1H, d,J=11.5, 5.3 Hz, H-6ax″), 3.44(1H, d,J=11.5 Hz, H-6bx″), 3.26(1H, d,J=2.9 Hz, H-3bx), 2.67(d,J=2.9 Hz, 1H, H-3ax);13C-NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 196.3(C-4), 168.2(C-7), 164.0(C-5), 163.2(C-9), 158.0(C-4′), 132.5(C-1′), 128.5(C-2′, 6′), 116.7(C-3′, 5′), 102.1(C-10), 100.7(C-1″), 96.5(C-6), 95.7(C-8), 78.5(C-2), 77.5(C-3″), 76.6(C-5″), 73.8(C-2″), 70.2(C-4″), 61.2(C-6″), 42.5(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道基本一致，故鑒定為柚皮素-4′-O-β-D-葡萄糖苷。

4 抗炎活性篩選

取指數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，接種于96孔板(1×105/孔)中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)12 h，用5 μmol/mL單體化合物預(yù)處理0.5 h后, 再加入LPS(0.5 μg/mL) 反應(yīng)24 h。以同濃度姜黃素為陽(yáng)性對(duì)照, 通過(guò)Griess反應(yīng)評(píng)估細(xì)胞培養(yǎng)基中NO水平。

研究表明，在小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)毒素(如 LPS)的誘導(dǎo)下，可產(chǎn)生大量 NO，而抗炎活性物質(zhì)可消除炎癥，減少NO釋放[24]。因此，通過(guò)測(cè)定化合物抑制小鼠巨噬細(xì)胞NO的生成量，可篩選西紅花中抗炎活性成分。

本實(shí)驗(yàn)采用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7炎癥模型，以姜黃素為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)化合物1、3～5、11～13進(jìn)行體外抑制炎癥測(cè)評(píng)，結(jié)果顯示姜黃素的RAW264.7細(xì)胞NO生成量的抑制率(57.9±2.01)%，而3、11在5 μmol/mL濃度下的抑制率分別為(61.77±1.00)%、(55.05±4.52)%，但1、4～5、12～13無(wú)明顯抑制作用。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)共分離鑒定出14個(gè)化合物，體外抗炎活性實(shí)驗(yàn)表明，化合物3、11對(duì)脂多糖誘導(dǎo)RAW 267.4細(xì)胞的炎癥有一定抑制作用。以上結(jié)果豐富了西紅花的化學(xué)成分研究，可為后續(xù)開(kāi)展其抗炎物質(zhì)探索提供參考。