α-常春藤皂苷協(xié)同雷公藤紅素對SMMC7721肝癌細(xì)胞增殖和周期的影響

張夜航， 盧文麗， 彭佩克， 方肇勤

(上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203)

原發(fā)性肝癌(以下簡稱肝癌)是世界上第五大常見惡性腫瘤(發(fā)病率)，全球每年新發(fā)病例約有一半發(fā)生在我國[1-2]。越來越多證據(jù)表明，在應(yīng)對惡性腫瘤(如肝癌等擁有復(fù)雜病因?qū)W和病理生理學(xué)特征的疾病)時(shí)，聯(lián)合/協(xié)同療法具有更強(qiáng)的療效優(yōu)勢，如將多種藥物活性成分聯(lián)合，可構(gòu)成多靶點(diǎn)協(xié)同效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制[3-4]。

本課題組長期以來在肝癌臨床辨證論治常用熱解毒、行氣活血、健脾益氣等治則治法的指導(dǎo)下，沿治法-方藥-單味中藥-中藥有效組分-有效組分配伍思路不斷深入，通過大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，逐步篩選出行氣活血治法代表中藥預(yù)知子，發(fā)現(xiàn)它能有效抑制不同肝癌細(xì)胞惡性增殖，其機(jī)制包括選擇性誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等特殊途徑，并且與遺傳霉素、阿霉素、絲裂霉素、博來霉素等聯(lián)用后，存在減量、增效效應(yīng)[5-15]。最新研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)知子醇提物和雷公藤紅素在抑制肝癌細(xì)胞增殖方面存在協(xié)同效應(yīng)[16]，但部分機(jī)制仍待闡釋。

預(yù)知子提取物中包含多種成分，如α-常春藤皂苷，木通皂苷D，木通皂苷E等[17]，但具體是哪一種或哪幾種發(fā)揮了與雷公藤紅素的協(xié)同效應(yīng)尚未明確。鑒于α-常春藤皂苷為藥典中提及的主要成分[18]，本研究初步探索它與雷公藤紅素協(xié)同用藥對SMMC7721肝癌細(xì)胞增殖和周期的影響。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 SMMC7721人肝癌細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所，置于完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+0.1 mg/mL鏈霉素+RPMI-1640)中，在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4 d傳代1次，取對數(shù)生長期者實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與藥物 α-常春藤皂苷(批號7498)、二甲基亞砜(批號20200509)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；雷公藤紅素(美國Selleck公司，批號S129005)。RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25% 胰酶-EDTA(美國Corning公司，批號28620006、35081004、10519010)；噻唑藍(lán)(MTT)(美國Sigma-Aldrich公司，批號MKBH9792V)；PageRulerTM預(yù)染蛋白Ladder(美國Thermo Scientific公司，批號00792185)；青霉素-鏈霉素、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠Ig(H+L)、RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、BeyoECL Plus超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、一抗稀釋液、RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號C0222、A0208、A0216、P0013C、ST506、P0018S、P0023A、P0013C)；細(xì)胞FITC-PI細(xì)胞凋亡染色試劑盒(天津三箭生物技術(shù)股份有限公司，批號AG519)；細(xì)胞周期染色試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，批號A00611)；β-actin鼠抗人一抗(美國Affinity Biosciences公司，批號85r7978)；兔抗人一抗CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin A1/2、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E1(英國Abcam公司，批號GR3282664-3、GR3302404-8、GR3293297-3、GR3233421-7、GR211873-6、GR3256653-4、GR3233421-7、GR156113-14)。

1.3 儀器 CP2250型電子分析天平(德國Sartorus公司)；MH-1型搖床(海門其林貝爾儀器制造有限公司)； Model 310型二氧化碳培養(yǎng)箱、1300 SERIES A2型生物安全柜、HPS RT2 Advanced型加熱磁力攪拌器(美國Thermo Scientific公司)；ELX-800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)；XDS-1B型倒置顯微鏡(重慶光電儀器有限公司重慶光學(xué)儀器廠)；PowerPacTMBasic型電泳儀及配套電泳槽、170-3930型小型濕轉(zhuǎn)槽(美國Bio-Rad公司)；FluorChem E型化學(xué)發(fā)光高靈敏度凝膠成像與分析系統(tǒng)(美國Protein-Simple公司)；564A CytoFLEX S型流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)。

2 方法

2.1 MTT法檢測細(xì)胞存活率 將細(xì)胞接種于96孔板中，當(dāng)其生長至30%～40%時(shí)加入不同質(zhì)量濃度α-常春藤皂苷(20.0、10.0、5.0、2.5、0.5、0.1、0.01 μg/mL)、雷公藤紅素(1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.01 μg/mL)，另設(shè)對照組(有細(xì)胞，但無藥物干預(yù))，每組8個(gè)復(fù)孔，分別在24、48、72 h進(jìn)行MTT 檢測，吸棄原培養(yǎng)液，每孔加入200 μL 0.5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄MTT溶液，加入150 μL DMSO溶液，避光振搖10 min，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在570 nm波長處檢測吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為存活率=[(A用藥組-A空白孔)/(A空白組-A空白孔)]×100%，至少重復(fù)3次。

2.2 聯(lián)合指數(shù)(CI)值測定 依據(jù)MTT數(shù)據(jù)，α-常春藤皂苷質(zhì)量濃度選擇10.0、5.0、1.0、0.1 μg/mL，雷公藤紅素質(zhì)量濃度選擇0.30、0.15、0.03 μg/mL，排列組合后共12個(gè)聯(lián)合用藥組，分別為10.0 μg/mL+0.30 μg/mL、10.0 μg/mL+0.15 μg/mL、10.0 μg/mL+0.03 μg/mL、5.0 μg/mL+0.30 μg/mL、5.0 μg/mL+0.15 μg/mL、5.0 μg/mL+0.03 μg/mL、1.0 μg/mL+0.30 μg/mL、1.0 μg/mL+0.15 μg/mL、1.0 μg/mL+0.03 μg/mL、0.1 μg/mL+0.30 μg/mL、0.1 μg/mL+0.15 μg/mL、0.1 μg/mL+0.03 μg/mL，計(jì)算細(xì)胞抑制率，公式為抑制率=[1-(A用藥組-A空白孔)/(A空白組-A空白孔)]×100%。依據(jù)Chou-Talalay原理，將各單藥及各聯(lián)合組的質(zhì)量濃度及抑制率輸入CompuSyn 1.0軟件(www.combosyn.com)[19-20]，可自動(dòng)計(jì)算CI值，其數(shù)值<1、=1、>1分別表示協(xié)同作用、加性效應(yīng)、拮抗作用，計(jì)算公式為CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2，其中(Dx)是單獨(dú)抑制x%的藥物1或2的劑量，(D)是組合抑制x%的藥物1或2的劑量，故(D)1+(D)2是組合抑制x%，至少重復(fù)3次。

2.3 Annexin V-FITC/PI雙染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、α-常春藤皂苷(10.0 μg/mL α-常春藤皂苷)、雷公藤紅素(0.30 μg/mL雷公藤紅素)、協(xié)同組(10.0 μg/mL α-常春藤皂苷+0.30 μg/mL雷公藤紅素)，給予相應(yīng)藥物處理48 h，收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次，1×結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞1次后重懸，調(diào)整密度至1×106～5×106/mL，每管流式管加入100 μL細(xì)胞懸液、5 μL Annexin V-FITC(PI單染及雙陰組除外)，室溫避光孵育15 min，加入3 μL PI(Annexin V-FITC單染和雙陰組除外)，室溫避光孵育10 min，每管加入400 μL預(yù)冷的PBS，在2 h內(nèi)上機(jī)檢測完畢。數(shù)據(jù)采用FlowJo VX軟件進(jìn)行分析。

2.4 流式PI單染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布 收集各組細(xì)胞至離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，離心1次后棄上清，輕彈管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，緩慢加入1.0 mL預(yù)冷的無水乙醇，輕輕吸打混勻，在4 ℃下固定過夜，1 000 r/min離心5 min，棄上清，輕彈管壁使沉淀松散，加入1 mL PBS，靜置5 min，離心后棄上清，每管加入1 mL染色液，渦旋振蕩5 s混勻，轉(zhuǎn)入流式管，室溫避光孵育30 min，將樣本置于冰上送檢，當(dāng)日內(nèi)完成檢測。采用NovoExpress軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.5 Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，RIPR裂解液[含50 mmol/L Tris(pH 7.4)、150 mmol/L NaCl、1% NP-40、0.5% sodium deoxycholate、0.1% SDS]裂解，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液檢測蛋白濃度，上樣量20～30 μg，10% SDS-PAGE膠電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至0.45 μm PVDF膜上，5% BSA室溫封閉2 h，加入一抗CDK1(1∶20 000)、CDK2(1∶5 000)、CDK4(1∶5 000)、CDK6(1∶5 000)、Cyclin A1/2(1∶1 000)、Cyclin B1(1∶50 000)、Cyclin D1(1∶20 000)、Cyclin E1(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜，二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，BeyoECL顯色后采用成像與分析系統(tǒng)獲得條帶，以β-actin為內(nèi)參。采用Image J圖像軟件進(jìn)行灰度值計(jì)算。

3 結(jié)果

3.1 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)存活率的影響 如圖1所示，隨著α-常春藤皂苷、雷公藤紅素質(zhì)量濃度增加，細(xì)胞存活率均呈降低趨勢；與對照組比較，2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL α-常春藤皂苷和0.2、0.4、0.8、1.6 μg/mL雷公藤紅素分別作用24、48、72 h后，細(xì)胞存活率均降低(P<0.05)；0.1 μg/mL雷公藤紅素作用24、48 h后，細(xì)胞存活率均低于對照組(P<0.05)。

注：與對照組比較，*P<0.05。圖1 α-常春藤皂苷(A)、雷公藤紅素(B)對SMMC7721細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)存活率的影響Fig.1 Effects of α-hederin(A) and orcelastrol(B) on survival rates of SMMC7721 cells at different time

3.2 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)及聯(lián)合指數(shù)CI值 如表1、圖2所示，作用48 h后，當(dāng)α-常春藤皂苷質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL，雷公藤紅素質(zhì)量濃度為0.30 μg/mL時(shí)，CI值最低，即具有最強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)，故選擇上述條件開展后續(xù)研究。

表1 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)及CI值Tab.1 Inhibitory effects of α-hederin and celastrol on SMMC7721 cell proliferation and CI values

3.3 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721肝癌細(xì)胞凋亡的影響 如圖3A、表2所示，協(xié)同組SMMC7721細(xì)胞早期凋亡率高于對照組和單獨(dú)給藥組(P<0.05)；與對照組比較，α-常春藤皂苷組、協(xié)同組SMMC7721細(xì)胞晚期凋亡率和總凋亡率均升高(P<0.05)。

3.4 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721肝癌細(xì)胞周期分布的影響 如圖3B、表3所示，與對照組比較，雷公藤紅素組、協(xié)同組SMMC7721細(xì)胞G0/G1期比例、G1+S期總比例均升高(P<0.05)，G2/M期比例均降低(P<0.05)；與對照組比較，α-常春藤皂苷組SMMC7721細(xì)胞S期比例升高(P<0.05)，雷公藤紅素組、協(xié)同組SMMC7721細(xì)胞S期比例無明顯變化(P>0.05)。

首先，可能是一種素養(yǎng)的養(yǎng)成。不管是在自己家里成天找東西的人，還是那個(gè)險(xiǎn)些命喪自己丟在床上的西瓜刀的孩子，他們并無害人之心，更無傷己之意。他們之所以沒有養(yǎng)成將用完的東西放回原處這樣簡單的生活習(xí)慣，多半是因?yàn)樽孕]有受到這樣的家庭教育和熏陶，也就沒有在心里固化這樣的意識(shí)。他們的父母，也沒有認(rèn)識(shí)到這樣的家庭教養(yǎng)的重要性；或者，他們的父母自身，也缺乏這樣的素養(yǎng)。

表3 各組SMMC7721細(xì)胞周期分布Tab.3 Cell cycle distribution of SMMC7721 cells in each

注：Fa為細(xì)胞增殖抑制效果水平。A為量效曲線圖，B為CI值-Fa曲線圖。圖2 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721細(xì)胞增殖抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of α-hederin and celastrol on SMMC7721 cell proliferation

圖3 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721肝癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布的影響Fig.3 Effects of α-hederin and celastrol on apoptosis and periodic distribution of SMMC7721 cells

表2 各組SMMC7721細(xì)胞早期、晚期及總凋亡率Tab.2 Early, late and total apoptotic rates of SMMC7721 cells in each

3.5 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖4A、4G所示，與對照組比較，α-常春藤皂苷組、雷公藤紅素組SMMC7721細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)呈升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與α-常春藤皂苷組比較，協(xié)同組SMMC7721細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；各組SMMC7721細(xì)胞Bax/Bcl2值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：與對照組比較，*P<0.05；與α-常春藤皂苷組比較，#P<0.05；與雷公藤紅素組比較，▲P<0.05。圖4 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721肝癌細(xì)胞凋亡和周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of α-hederin and celastrol on apoptosis and cell cycle-related protein expressions of SMMC7721

3.6 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721肝癌細(xì)胞CDKs表達(dá)的影響 如圖4B～4F、4H所示，與對照組比較，α-常春藤皂苷組、雷公藤紅素組SMMC7721細(xì)胞中CDK2、CDK4蛋白表達(dá)均無明顯變化(P>0.05)，但協(xié)同組SMMC7721細(xì)胞中CDK2、CDK4蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，并且低于各單獨(dú)給藥組(P<0.05)；各組SMMC7721細(xì)胞CDK1、CDK6蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.7 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721肝癌細(xì)胞Cyclins表達(dá)的影響 如圖4B～4F、4I所示，與對照組比較，各給藥組SMMC7721細(xì)胞中Cyclin E1蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)，但各給藥組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；雷公藤紅素組、協(xié)同組SMMC7721細(xì)胞中Cyclin D1蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)，以協(xié)同組更明顯(P<0.05)；協(xié)同組中Cyclin A1/2表達(dá)低于雷公藤紅素組(P<0.05)；CyclinB1蛋白表達(dá)比較，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

4 討論

國內(nèi)外研究結(jié)果顯示，甘草次酸、紫杉醇、大黃酸均可增強(qiáng)雷公藤紅素對HepG2細(xì)胞增殖抑制作用，而且在低質(zhì)量濃度時(shí)作用更明顯[21]；與雷公藤甲素聯(lián)用時(shí)，可使人非小細(xì)胞肺癌H1299、H157細(xì)胞G2/M期周期阻滯[22]；與索拉非尼聯(lián)用時(shí)，在體內(nèi)外均能增強(qiáng)它對癌細(xì)胞的生長抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，并降低用量[23]；可增強(qiáng)拉帕替尼的細(xì)胞毒性和促凋亡能力[24]。α-常春藤皂苷與紫杉醇聯(lián)用時(shí)，在抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡方面具備協(xié)同作用[25]；與5-FU聯(lián)用時(shí)，在中等細(xì)胞毒性范圍對HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制顯示出協(xié)同效應(yīng)，增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞敏感性[26]。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)α-常春藤皂苷質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL，雷公藤紅素質(zhì)量濃度為0.30 μg/mL時(shí)，具有較好的協(xié)同效應(yīng)，以作用48 h更明顯；在早期凋亡中，協(xié)同組凋亡率較其他組均升高，而晚期凋亡和總凋亡表現(xiàn)出類似的現(xiàn)象，即α-常春藤皂苷和協(xié)同組凋亡率均高于對照組，并以協(xié)同組更明顯。但在上述質(zhì)量濃度下，單獨(dú)給藥、協(xié)同作用所誘發(fā)的凋亡現(xiàn)象并不嚴(yán)重，后續(xù)針對在肝癌細(xì)胞凋亡中被視為具有重要調(diào)控作用的經(jīng)典分子(如Bax、Bcl-2等)開展的研究也印證了這一點(diǎn)[27]，即誘發(fā)凋亡可能并不是兩者協(xié)同效應(yīng)產(chǎn)生的主要原因。為進(jìn)一步明確其機(jī)制，有必要繼續(xù)觀察對細(xì)胞周期分布的影響。

前期關(guān)于α-常春藤皂苷或雷公藤紅素致不同細(xì)胞周期阻滯也有相關(guān)報(bào)道，但結(jié)果無一致性，如前者可誘導(dǎo)SKOV-3人卵巢癌細(xì)胞發(fā)生G0/G1期細(xì)胞周期阻滯[28]，誘導(dǎo)SW620人結(jié)腸癌細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期周期阻滯[29]；后者可致鼻咽癌NPC細(xì)胞G2/M期周期阻滯[30]，致骨肉瘤HOS和MG-63細(xì)胞G2/M期周期阻滯[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，α-常春藤皂苷作用后細(xì)胞周期S期比例升高；雷公藤紅素可引起G0/G1期周期阻滯；兩者協(xié)同作用后，可使細(xì)胞周期分布中G1+S期總比例進(jìn)一步被提升，同時(shí)也提示其作用機(jī)制的差異。

為進(jìn)一步揭示周期阻滯分子機(jī)制，本研究一方面圍繞細(xì)胞由G1向S期轉(zhuǎn)變檢測點(diǎn)周期蛋白相關(guān)分子，即CDKs如CDK2、CDK4和CDK6，Cyclins如Cyclin D1和Cyclin E1開展了檢測，發(fā)現(xiàn)協(xié)同組CDK2、CDK4表達(dá)均降低，而Cyclin D1、Cyclin E1表達(dá)升高，推測可能由于CDK2、CDK4表達(dá)降低影響了CDK4/6-Cyclin D、CDK2-Cyclin E復(fù)合物的形成，從而使細(xì)胞阻滯于G0/G1期，另外Cyclin D1的變化趨勢與各組周期阻滯效果的差異較為對應(yīng)，推測可能是參與其中的關(guān)鍵分子，具體仍需進(jìn)一步驗(yàn)證；另一方面，α-常春藤皂苷作用后細(xì)胞周期S期比例也出現(xiàn)了小幅度升高，故嘗試對Cyclin A1/2和Cyclin B1開展了觀察，但未發(fā)現(xiàn)特殊變化，可能與其質(zhì)量濃度較低有關(guān)。

綜上所述，本研究明確了α-常春藤皂苷、雷公藤紅素協(xié)同抑制SMMC7721肝癌細(xì)胞增殖作用，兩者雖然可致細(xì)胞凋亡現(xiàn)象增加，但主要與誘導(dǎo)G0/G1期周期阻滯、進(jìn)一步提升G1+S期總比例有關(guān)，而且Cyclin D1可能是參與其中的關(guān)鍵分子。