桔梗多糖對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的影響

劉 揚(yáng)， 芮雪琳， 李嘉誠(chéng)， 徐 莉， 楊 曄,2， 尹登科,2,3*

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.現(xiàn)代中藥研究與開(kāi)發(fā)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012；3.藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012)

炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病的重要原因[1-2]，促炎因子與抑炎因子之間的失衡會(huì)影響潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展[3]。在潰瘍性結(jié)腸炎患者和動(dòng)物模型中，活化的中性粒細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，干擾細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和粘膜屏障通透性增加，從而加速和持續(xù)進(jìn)行中的炎癥[4-5]。同時(shí)，氧化應(yīng)激除了改變抗氧化產(chǎn)物，還會(huì)導(dǎo)致腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)等細(xì)胞因子的改變，對(duì)炎癥產(chǎn)生影響[6]。

桔梗具有良好的抗炎、抗氧化和增強(qiáng)免疫等生物學(xué)活性[7-8]，相關(guān)復(fù)方(如潰結(jié)湯[9]、參苓白術(shù)散[10]等)對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎具有良好的治療作用。研究表明，桔梗皂苷D能通過(guò)改善腸道損傷和維持腸道完整性來(lái)減輕葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎炎癥[11]；桔梗多糖是桔梗的主要成分，具有良好的體外抗炎、抗氧化活性[12-13]，但它對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)考察桔梗多糖干預(yù)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型的作用，以期為相關(guān)天然藥物的開(kāi)以及潰瘍性結(jié)腸炎的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 雄性BALB/c小鼠36只，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自蘇州西山生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2020-0009，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲水進(jìn)食，保持12 h/12 h晝夜節(jié)律，溫度(25±2)℃。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)，倫理編號(hào)為AHUCM-mouse-2021028。

1.2 試劑與藥物 桔梗購(gòu)自安徽友信藥業(yè)有限公司(批號(hào)20210220)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)劉守金教授鑒定為正品。葡聚糖硫酸鈉(大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)J0118B)；柳氮磺吡啶腸溶片(上海信宜天平藥業(yè)有限公司，批號(hào)09201122)。BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(北京蘭杰柯科技有限公司，批號(hào)21056736)；髓過(guò)氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20210615、20210617、20210425)；TNF-α兔抗鼠多克隆抗體(沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司，批號(hào)I06211896)；IL-1β、IL-10兔抗鼠多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)BJ01046015、BJ09047697)。其余試劑為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 儀器 冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Marin Christ公司)；DM2000熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；十萬(wàn)分之一電子分析天平(美國(guó)奧豪斯公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)。

2 方法

2.1 多糖提取 按照文獻(xiàn)[14]報(bào)道，將桔梗飲片在60 ℃下烘干至恒重，搗碎，過(guò)60目篩，取100 g粉末，加100 mL蒸餾水，在80 ℃下回流5次，每次2 h，紗布過(guò)濾，水提液合并，濃縮至每1 mL含1 g藥物，采用一步醇沉法，向濃縮液加入乙醇使其終體積分?jǐn)?shù)達(dá)80%，在4 ℃下靜置過(guò)夜，3 000 r/min離心10 min，收集沉淀得粗品，Sevag法除蛋白后凍干，得率為27%。苯酚硫酸法測(cè)定其含量為78%。

2.2 單糖組成分析 通過(guò)高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法(HPAEC-PAD)(ICS-5000+高效離子色譜儀，美國(guó)戴安公司)，將多糖以三氟乙酸水解，采用Carbo PACTMPA10分析柱(2.0 mm×250 mm)分析；流動(dòng)相H2O-200 mmol/L NaOH-200 mmol/L NaAc，進(jìn)行三元梯度洗脫分離，再以脈沖安培檢測(cè)器分析單糖組成。

2.3 建模及給藥 小鼠隨機(jī)分為6組，分別為對(duì)照組、模型組、柳氮磺吡啶組(200 mg/kg 柳氮磺吡啶)及桔梗多糖低、中、高劑量組(100、200、400 mg/kg桔梗多糖)，每組6只，對(duì)照組小鼠灌胃給予正常飲用水，其余各組小鼠均灌胃給予3% DSS溶液，連續(xù)7 d。DSS末次給藥后第2天，給藥組小鼠再分別灌胃給予柳氮磺吡啶及不同劑量桔梗多糖，對(duì)照組、模型組小鼠灌胃給予等量生理鹽水，連續(xù)7 d。

2.4 樣本收集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前小鼠禁食過(guò)夜，在第15天摘眼球取血，血樣室溫放置30 min，3 000 r/min離心15 min，得血清，置于-80 ℃冰箱中保存。取血后小鼠頸椎脫臼致死，取結(jié)直腸，測(cè)量肛門(mén)到回盲瓣距離，取結(jié)腸中間干凈部位于4%多聚甲醛中進(jìn)行固定，用于包埋切片，剩余部位置于液氮中保存，收集脾臟并稱定質(zhì)量，計(jì)算脾臟指數(shù)。

2.5 疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分 每天監(jiān)測(cè)小鼠體質(zhì)量、糞便稠度、直腸出血總量、存活率，檢查潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生情況。通過(guò)臨床評(píng)分系統(tǒng)(DAI)評(píng)估總體疾病嚴(yán)重程度[15]，公式為DAI評(píng)分=(體質(zhì)量減輕評(píng)分+糞便性狀評(píng)分+便血評(píng)分)/3，標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Criteria for DAI scoring

2.6 HE染色觀察小鼠結(jié)腸組織病理變化 將小鼠結(jié)腸組織固定在4%多聚甲醛24 h后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制成5 μm切片，采用HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，評(píng)估結(jié)腸損傷和炎癥情況。

2.7 小鼠結(jié)腸組織中MPO活性檢測(cè) 將小鼠結(jié)腸于冰上剪碎后，立即用玻璃勻漿器在冰上勻漿，BAC蛋白試劑盒檢測(cè)組織勻漿中蛋白濃度，相關(guān)試劑盒檢測(cè)MPO活性。

2.8 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-10表達(dá) 將小鼠結(jié)腸組織切片脫蠟、水合后，移入10 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液中煮沸15 min，過(guò)氧化物酶阻斷劑孵育10 min，PBS漂洗，室溫下加入山羊血清孵育1 h，再分別加入TNF-α(1∶250)、IL-1β(1∶250)、IL-10(1∶250)抗體，在4 ℃下孵育過(guò)夜，TBST洗滌，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，隨機(jī)抽取30個(gè)免疫組化切片視野，采用Image-pro Plus 6.0計(jì)算積分光密度值(IOD)。

2.9 小鼠血清及結(jié)腸組織中SOD活性和MDA水平檢測(cè) 取低溫保存的小鼠血清及冰上制備的組織勻漿，采用相關(guān)試劑盒檢測(cè)SOD活性、MDA水平。

3 結(jié)果

3.1 單糖組成 桔梗多糖主要由D-巖藻糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、半乳糖醛酸組成，比例為11.00∶1.00∶15.79∶17.48∶12.45∶5.19。

3.2 桔梗多糖對(duì)小鼠體質(zhì)量及DAI評(píng)分的影響 如圖1所示，飲用DSS水溶液后，除對(duì)照組外其余各組小鼠體質(zhì)量均迅速下降，停止飲用后該趨勢(shì)開(kāi)始停止，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)上升趨勢(shì)，并且給藥組小鼠體質(zhì)量上升趨勢(shì)高于模型組(P<0.05)；模型組小鼠DAI評(píng)分在停止飲用DSS后開(kāi)始逐漸下降，而給藥組該評(píng)分低于模型組(P<0.05，P<0.01)。由此可知，桔梗多糖對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠具有治療作用。

注：與對(duì)照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化(A)和DAI評(píng)分Fig.1 Changes of mouse body weight(A) and DAI score(B) in each

3.3 桔梗多糖對(duì)小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度及脾臟指數(shù)的影響 如圖2A所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度縮短(P<0.01)，而各給藥組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度增加(P<0.05，P<0.01)。如圖2B所示，模型組小鼠脾臟指數(shù)高于對(duì)照組(P<0.01)，而桔梗多糖各劑量組小鼠脾臟指數(shù)均低于模型組(P<0.05，P<0.01)。結(jié)腸長(zhǎng)度縮短以及脾臟指數(shù)升高是衡量潰瘍性結(jié)腸炎嚴(yán)重程度的指標(biāo)[16]，本實(shí)驗(yàn)中潰瘍性結(jié)腸炎模型建立成功，并且桔梗多糖能改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸縮短和脾腫大。

注：與對(duì)照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度(A)和脾臟指數(shù)Fig.2 Mouse colon lengths(A) and spleen indices(B) in each

3.4 桔梗多糖對(duì)小鼠結(jié)腸組織病理變化的影響 如圖3所示，對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜、隱窩結(jié)構(gòu)、腺體排列正常，組織結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)炎性浸潤(rùn)；模型組小鼠結(jié)腸組織黏膜損傷，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隱窩結(jié)構(gòu)嚴(yán)重變形，杯狀細(xì)胞丟失；桔梗多糖各劑量組小鼠腸組織形態(tài)逐漸改善，黏膜損傷減輕, 炎性細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸減少，杯狀細(xì)胞及其隱窩形態(tài)相對(duì)完整，并呈劑量依賴性。由此可知，潰瘍性結(jié)腸炎小鼠在接受桔梗多糖治療后，結(jié)腸病理?yè)p傷程度有所改善。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織病理變化(HE染色，×100)Fig.3 Pathological changes of mouse colon tissues in each group(HE staining,×100)

3.5 桔梗多糖對(duì)小鼠結(jié)腸組織中MPO活性及炎癥因子表達(dá)的影響 如圖4A～4D所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β表達(dá)升高(P<0.01)，抑炎因子IL-10表達(dá)降低(P<0.01)；與模型組比較，桔梗多糖各劑量組抑制了TNF-α、IL-1β表達(dá)(P<0.01)，促進(jìn)了IL-10表達(dá)(P<0.05)。 如圖4E所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中MPO活性升高(P<0.01)；與模型組比較，柳氮磺吡啶組及桔梗多糖各劑量組能抑制MPO活性的升高(P<0.05，P<0.01)。結(jié)腸中MPO的活性是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的標(biāo)志，是評(píng)價(jià)炎癥程度的指標(biāo)[17]，由此可知，桔梗多糖能通過(guò)減少中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)以及調(diào)節(jié)促炎因子與抗炎因子的平衡來(lái)起到治療效果。

注：與對(duì)照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 各組小鼠結(jié)腸組織中MPO活性和炎癥因子表達(dá)(免疫組化，F(xiàn)ig.4 Activities of MPO and expressions of inflammatory factors in mouse colon tissues in each

注：與對(duì)照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖5 各組小鼠血清與結(jié)腸組織中SOD活性和MDA水平Fig.5 Activities of SOD and levels of MDA in mouse serum and colon tissues in each

3.6 桔梗多糖對(duì)小鼠血清及結(jié)腸組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清與結(jié)腸組織中MDA水平升高(P<0.01)，SOD活性降低(P<0.01)；與模型組比較，柳氮磺吡啶組及桔梗多糖各劑量組小鼠血清和結(jié)腸組織中的MDA水平降低(P<0.05，P<0.01)，SOD活性升高(P<0.05，P<0.01)。MDA、SOD在氧化應(yīng)激中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，是氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要標(biāo)志[18]，由此可知，桔梗多糖能調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)抗氧化作用來(lái)起到治療效果。

4 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種常見(jiàn)于腸道黏膜層的潰瘍性炎癥性疾病，與可發(fā)生在口腔到肛門(mén)的任何部位的克羅恩病不同，它一般只局限于結(jié)腸部位[19]。使用化學(xué)誘導(dǎo)劑DSS誘導(dǎo)小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的模型已被廣泛使用，可誘發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎患者常見(jiàn)的各種癥狀，包括體質(zhì)量減輕、糞便松軟、腹瀉甚至直腸出血[20]。 本研究使用3% DSS誘導(dǎo)7 d建立小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，發(fā)現(xiàn)成模后小鼠體質(zhì)量降低，出現(xiàn)腹瀉便血癥狀，DAI評(píng)分升高；桔梗多糖干預(yù)后，小鼠體質(zhì)量、DAI評(píng)分、結(jié)腸長(zhǎng)度、脾腫大都明顯改善，并且結(jié)腸病理?yè)p傷隨著其劑量增加而減輕，表明該成分具有顯著的藥效。

目前，對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制尚未明確，但大量研究表明，嚴(yán)重的炎性反應(yīng)以及氧化應(yīng)激水平的升高是影響本病進(jìn)程的重要因素[21- 22]。細(xì)胞因子在潰瘍性結(jié)腸炎的炎性反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，不同細(xì)胞因子發(fā)揮著促炎或抗炎作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中促炎因子TNF-α、IL-1β表達(dá)升高，抑炎因子IL-10表達(dá)降低，并且結(jié)腸組織中MPO活性升高；桔梗多糖干預(yù)后，上述促炎因子水平降低，抑炎因子水平升高，兩者之間平衡得以恢復(fù)，MPO活性也有所降低，表明炎癥得到改善。因此，桔梗多糖對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的改善作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)促炎因子和抑炎因子之間的平衡緩解炎性反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。

在潰瘍性結(jié)腸炎期間，組織中會(huì)產(chǎn)生大量活性氧，并且SOD等抗氧化酶活性會(huì)下降，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化，增加MDA水平，從而加劇和延長(zhǎng)炎癥[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)腸和血清中SOD活性降低，MDA水平升高，說(shuō)明潰瘍性結(jié)腸炎小鼠氧化應(yīng)激水平的升高不僅僅發(fā)生在結(jié)腸組織，體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平也同樣升高了；桔梗多糖干預(yù)后，潰瘍性結(jié)腸炎小鼠組織以及血清中SOD活性升高，MDA水平降低，表明該成分能平衡氧化與抗氧化介質(zhì)，緩解脂質(zhì)過(guò)氧化，降低結(jié)腸組織乃至體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，從而發(fā)揮治療作用。

綜上所述，桔梗多糖能通過(guò)抑制MPO活性和炎性反應(yīng)，減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，下調(diào)促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β表達(dá)，上調(diào)抑炎因子IL-10表達(dá)，提高小鼠結(jié)腸組織及血清中SOD活性，降低MDA水平，緩解體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，從而發(fā)揮抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的作用。