益氣活血化痰方對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的影響

陳 昕， 李小雪， 俞佳利， 李屹龍， 孫琳潔， 薛金貴*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院心血管科，上海 201203；2.上海市第七人民醫(yī)院，上海 200120)

動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致人類心血管疾病發(fā)病率和死亡率居高不下的病因之一[1]，其形成與血脂水平升高、動(dòng)脈壁膽固醇累積、長(zhǎng)期慢性炎癥有關(guān)[2]，其中脂質(zhì)代謝功能失調(diào)占據(jù)了重要地位。膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)是脂質(zhì)代謝的重要途徑，對(duì)于維持機(jī)體的脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)有著重大意義[3]。研究表明，肝X受體α(liver X receptor，LXRα)可通過(guò)調(diào)控ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1/G1(ATP binding cassette transporter A1/G1,ABCA1/G1)的表達(dá)，將細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的膽固醇經(jīng)由血漿高密度脂蛋白(HDL-C)轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，經(jīng)糞便清除從而改變膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[4-7]，同時(shí)LXRα可以通過(guò)調(diào)控固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(terol regulatory element binding protein-1，SREBP1)介導(dǎo)的多種脂肪合成酶的合成，減少脂肪堆積。因此，干預(yù)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，可能對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的防治具有重要意義。

益氣活血化痰方由黃芪、丹參、全瓜蔞、水蛭、黃連組成，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)平衡、抑制炎癥反應(yīng)、穩(wěn)定粥樣斑塊的功效，可減少冠脈事件的發(fā)生[8-11]，但其具體作用靶點(diǎn)尚未明確。本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，用高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠以建立早期動(dòng)脈粥樣硬化模型，探究益氣活血化痰方抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 72只8周齡雄性ApoE-/-小鼠，體質(zhì)量27～30 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)環(huán)境，溫度(22±1)℃，相對(duì)濕度(50±5)%，晝夜12 h/12 h，自由進(jìn)食飲水。實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)審查通過(guò)，倫理審查編號(hào)PZSHUTCM190308018。

1.2 試劑與藥物 益氣活血化痰方由生黃芪30 g、丹參20 g、全瓜蔞15 g、水蛭9 g、黃連6 g組成，藥材購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，由醫(yī)院制劑室制成浸膏粉，每1 g相當(dāng)于生藥量2.96 g。阿托伐他汀(20 mg/片，美國(guó)輝瑞公司，批號(hào)AF3465)碾碎，過(guò)分樣篩100目篩后置于含0.5%羧甲基纖維素鈉的雙蒸水中，制成混懸劑。HE染液(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)2019001)；載脂蛋白A1(APOA1)檢測(cè)試劑盒(上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)2019006)；Masson染液(批號(hào)G1006)、油紅O染液(批號(hào)G1016)均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；總膽固醇(TC)(批號(hào)20181207)、甘油三酯(TG)(批號(hào)20181208)、高密度脂蛋白(HDL-C)(批號(hào)20190105)、低密度脂蛋白(LDL-C)(批號(hào)20190104)、極低密度脂蛋白(VLDL-C)試劑盒(批號(hào)20190105)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；總RNA提取試劑盒(批號(hào)M1119290)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)H4104750)均購(gòu)自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，批號(hào)7E501C1)。

1.3 儀器 切片分析系統(tǒng)(日本Olympus公司，型號(hào)BX51)；輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司，型號(hào)LEICA 819)；冰凍切片機(jī)(中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司，型號(hào)CRYOSTAR NX50)；高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司，型號(hào)AVANTI J-15R)；Western blot電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司，型號(hào)Synergy H1)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司，型號(hào)StepOnePlus)。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 小鼠隨機(jī)分成6組，每組12只，分別為空白對(duì)照組、模型組、阿托伐他汀組及益氣活血化痰方低、中、高劑量組，空白對(duì)照組給予普通飲食喂養(yǎng)，其余5組給予高脂飼料(21.8%脂肪，1.25%膽固醇，76.95%標(biāo)準(zhǔn)飼料)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始造模。根據(jù)動(dòng)物與人的等效劑量換算，以等效劑量為中劑量，益氣活血化痰方低、中、高劑量組分別灌胃給予相應(yīng)藥物混懸液7.7、14.14、28.28 g/kg，給藥量為0.5 mL/20 g，阿托伐他汀組灌胃給予2.98 mg/kg混懸液，空白對(duì)照組和模型組灌胃給予等量雙蒸水，每天1次。給藥前1天上午8點(diǎn)稱定各組小鼠體質(zhì)量，之后每周早上相同時(shí)間稱定1次，并在取材前稱定最后1次。連續(xù)灌胃給藥14周后處死小鼠,并取材。

2.2 指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 HE染色 取小鼠主動(dòng)脈組織，置于預(yù)先配好的4%多聚甲醛中固定24 h，70%～100%梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，切片、貼片后脫蠟染色，蘇木精染色，酸水及氨水分化，流水沖洗，置于70%、90%乙醇中各脫水10 min，伊紅染色液染色2～3 min；染色后的切片經(jīng)無(wú)水乙醇脫水，再經(jīng)二甲苯透明，最后樹(shù)膠封固，在顯微鏡下觀察，并采用Image J軟件對(duì)血塊剖面斑塊面積進(jìn)行定量分析。

2.2.2 Masson染色 將小鼠主動(dòng)脈石蠟切片依次放入二甲苯、無(wú)水乙醇、70%乙醇中脫蠟至水，重鉻酸鉀染色，浸泡過(guò)夜，鐵蘇木素染液染色，分化液分化，返藍(lán)液返藍(lán)，麗春紅酸性品紅浸染5～10 min，磷鉬酸水浸染1～3 min，苯胺藍(lán)染色，1%冰醋酸分化，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片，在顯微鏡下觀察，采集圖像。結(jié)果，膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維、纖維素和紅細(xì)胞呈紅色。

2.2.3 油紅O染色 將小鼠主動(dòng)脈冷凍切片復(fù)溫干燥，固定15 min后水洗，晾干，油紅染液浸染，75%乙醇分化，蘇木素染液染3～5 min，分化液分化，返藍(lán)液返藍(lán)，流水沖洗，甘油明膠封片劑封片，在顯微鏡下觀察，采集圖像。結(jié)果，脂滴呈橘紅色至鮮紅色，細(xì)胞核藍(lán)色。

2.2.4 血脂水平檢測(cè) 取小鼠全血樣本，3 000 r/min離心5 min，取血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)TG、TC、HDL-C、LDL-C、VLDL-C、APOA1水平，計(jì)算動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(atherosclerosis index，AI)。

2.2.5 Western blot檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈組織相關(guān)蛋白表達(dá) 采用RIPA裂解液裂解小鼠主動(dòng)脈組織，提取總蛋白，BCA法檢測(cè)主動(dòng)脈組織蛋白濃度，每泳道20 μg蛋白進(jìn)行上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5% BSA封閉，按推薦比例配制LXRα、SREBP1、ABCG1、ABCA1一抗，在4 ℃下孵育過(guò)夜，TBST洗膜4次，二抗常溫孵育1 h，加入ECL發(fā)光液，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光并采集圖片，采用Image J對(duì)圖像進(jìn)行定量分析。

2.2.6 RT-qPCR檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈組織相關(guān)基因表達(dá) 提取小鼠主動(dòng)脈組織總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件為預(yù)變性，95 ℃ 30 s；擴(kuò)增反應(yīng)，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCT法對(duì)結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

3 結(jié)果

3.1 益氣活血化痰方對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊面積的影響 如圖1所示，與空白對(duì)照組比較，模型組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈壁增厚且可見(jiàn)斑塊形成，而益氣活血化痰方各劑量組和阿托伐他汀組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈未見(jiàn)明顯斑塊。

圖1 各組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈板塊面積(HE,×200)Fig.1 Aortic plaque areas of ApoE-/- mice in each group(HE,×200)

3.2 益氣活血化痰方對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈膠原纖維水平的影響 如圖2所示，與空白對(duì)照組比較，模型組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈膠原纖維水平升高(P<0.01)；與模型組比較，益氣活血化痰方中、高劑量組和阿托伐他汀組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈膠原纖維水平降低(P<0.01)。

3.3 益氣活血化痰方對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈脂質(zhì)蓄積水平的影響 如圖3所示，與空白對(duì)照組比較，模型組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈脂質(zhì)蓄積水平均升高(P<0.01)；與模型組比較，益氣活血化痰方中、高劑量組和阿托伐他汀組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈脂質(zhì)蓄積水平均降低(P<0.01)

3.4 益氣活血化痰方對(duì)ApoE-/-小鼠血脂水平的影響 如圖4所示，與空白對(duì)照組比較，模型組ApoE-/-小鼠血清TC、TG、LDL-C水平升高(P<0.01)；與模型組比較，益氣活血化痰方中、高劑量組和阿托伐他汀組ApoE-/-小鼠血清TC、TG、LDL-C水平均降低(P<0.01)；益氣活血化痰方高劑量組和阿托伐他汀組ApoE-/-小鼠血清VLDL-C水平降低(P<0.05，P<0.01)，HDL-C、APOA1水平均升高(P<0.01)。

注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖2 各組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈膠原纖維水平Fig.2 Levels of aortic collagen fiber of ApoE-/- mice in each group(Masson,×200, n=12)

注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖3 各組ApoE-/-小鼠脂質(zhì)蓄積水平(油紅Fig.3 Levels of lipid accumulation of ApoE-/- mice in each group(oil red O,×200, n=12)

3.5 益氣活血化痰方對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)的影響 如圖5所示，與空白對(duì)照組比較，模型組ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)均升高(P<0.01)；與模型組比較，益氣活血化痰方高劑量組和阿托伐他汀組ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)均降低(P<0.01)。

3.6 益氣活血化痰方對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織LXRα、ABCA1、ABCG1、SREBP1蛋白表達(dá)的影響 如圖6所示，與空白對(duì)照組比較，模型組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織中LXRα蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，ABCA1、ABCG1、SREBP1蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)；與模型組比較，益氣活血化痰方各劑量組和阿托伐他汀組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織中LXRα、ABCA1、ABCG1、SREBP1蛋白表達(dá)均升高(P<0.05，P<0.01)。

3.7 益氣活血化痰方對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織中LXRα、SREBP1、ABCA1、ABCG1 mRNA表達(dá)的影響 如圖7所示，與空白對(duì)照組比較，模型組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織中LXRα、ABCA1、ABCG1 mRNA表達(dá)降低(P<0.01)，SREBP1 mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)；與模型組比較，益氣活血化痰方中、高劑量組和阿托伐他汀組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織中LXRα、SREBP1、ABCA1、ABCG1 mRNA表達(dá)均升高(P<0.01)。

4 討論

現(xiàn)代研究表明，血漿膽固醇水平與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)[12]，其中粥樣斑塊的形成多與LDL-C密切相關(guān)，而HDL-C可以通過(guò)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇，抗氧化，改善血管內(nèi)皮功能等發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[13-14]；APOA1是血漿HDL-C的主要載脂蛋白，在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15-16]；動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)可以體現(xiàn)人體血管承受的壓力與可擴(kuò)張性，與機(jī)體動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[17-19]。本研究結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠血清脂質(zhì)水平升高，HE染色可見(jiàn)明顯斑塊，說(shuō)明小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型建立成功。益氣活血化痰方干預(yù)后可以減少ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈內(nèi)壁脂質(zhì)蓄積，降低膠原纖維、TC、LDL-C水平和動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)，而對(duì)HDL-C、APOA1水平具有升高作用。

膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)是機(jī)體排出多余膽固醇的重要生理途徑，是緩解動(dòng)脈粥樣硬化的新策略[2]。LXR可將細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的膽固醇通過(guò)血漿HDL-C轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)化、清除，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[20]；LXRα與視黃醛X受體(retinoid X receptor，RXR)形成異二聚體后，與SREBP1啟動(dòng)子上游的LXR反應(yīng)元件結(jié)合，從而調(diào)控SREBP1的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)多種脂肪合成酶的合成[21]；LXRα調(diào)控SREBP1的同時(shí)，還可以升高ABCA1/G1的表達(dá)，并呈時(shí)間和劑量依賴性。ABCA1/G1介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇分別轉(zhuǎn)運(yùn)至成熟HDL-C顆粒、APOA1和未成熟的HDL-C顆粒[22]。研究表明，ABCA1突變會(huì)導(dǎo)致丹吉爾病，即嚴(yán)重的HDL-C缺乏和全身性動(dòng)脈粥樣硬化[23]，因此ABCA1/G1在動(dòng)脈粥樣硬化中具有重要作用。本課題組發(fā)現(xiàn)，益氣活血化痰方可以激活A(yù)poE-/-小鼠體內(nèi)LXRα表達(dá)，促使下游SREBP1、ABCA1和ABCG1表達(dá)升高，進(jìn)而影響小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C等脂質(zhì)水平。

注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖6 各組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織中LXRα、SREBP1、ABCA1/G1蛋白表達(dá)Fig.6 Aortic protein expressions of LXRα, SREBP1 and ABCA1/G1 of ApoE-/- mice in each

綜上所述，益氣活血化痰方可通過(guò)刺激LXRα表達(dá)，調(diào)控SREBP1、ABCA1/G1表達(dá)，影響膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖7 各組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織中LXRα、SREBP1、ABCA1/G1 mRNA表達(dá)Fig.7 Aortic mRNA expressions of LXRα, SREBP1 and ABCA1/G1 in ApoE-/- mice of each