參芪定悸湯調(diào)控p38MAPK表達(dá)抑制慢性心力衰竭大鼠心肌的氧化損傷

脫梅娟 韓 琳 劉 力 王斌科 杜增平

（寶雞職業(yè)技術(shù)學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院中藥教研室，寶雞 721000）

心力衰竭是由血流動力學(xué)負(fù)荷過重、炎癥等引起的心肌損傷，心肌結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生異常，致使心室泵血等功能產(chǎn)生障礙[1]。慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是持續(xù)存在的心力衰竭，老年CHF患者一般是由冠心病、高血壓等惡化而來，青年CHF患者主要病因為風(fēng)濕性心瓣膜病等[2]。常規(guī)應(yīng)用西藥治療CHF，副作用較大，且使患者產(chǎn)生不必要的治療費用，而中藥對人體危害較小，毒副作用較小，且會根據(jù)患者的病癥及病情辯證治療。據(jù)有關(guān)研究表明，中藥參芪定悸湯對氣虛兩虧型室性早搏的治療效果較好，但對于CHF的治療效果暫未可知。N端B型腦鈉肽前體（N-Terminal pro-B type natriuretic peptide，NT-proBNP）是 腦鈉肽前體，是反映心功能的因子。p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogemic activated protein kinase，p38MAPK）可將受體傳遞的信號傳入細(xì)胞核內(nèi)，并可調(diào)控基因的表達(dá)[3]。因此，本研究探討參芪定悸湯對CHF大鼠心功能、血清NT-proBNP水平和p38MAPK信號通路的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組

健康SD雄性大鼠44只，體質(zhì)量在200～250 g，購自南京便診生物公司，隨機分為對照組11只、模型組11只、參芪定悸湯低、高劑量組（12.9 g/kg-1·d-1、25.8 g/kg-1·d-1組）各11只，室溫飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。參芪定悸湯組成及劑量見表1。下列藥物濃度為2.6 g/mL和水（1.3 g/mL）煎劑備用。

表1 參芪定悸湯的組成

1.2 實驗試劑

參芪定悸湯所需藥材來自諾德原生中草藥公司、鹽酸阿霉素來自成都樂美天醫(yī)藥公司；HX-300S動物呼吸機來自涵飛醫(yī)療器械公司；戊巴比妥那來自斯信生物公司

1.3 模型建立

將鹽酸阿霉素用滅菌水溶解，加入生理鹽水中使?jié)舛葹?.8 mg/mL，注射劑量在2～3 mg/kg。除對照組給予生理鹽水外，其余大鼠進(jìn)行腹腔注射鹽酸阿霉素，1次/周、共6周；8 d后大鼠出現(xiàn)中毒癥狀，表現(xiàn)為精神萎靡、皮毛枯槁、活動能力降低，呼吸加快，左心室短軸縮短率（LVFS）＜30%，表示慢性心力衰竭大鼠模型建立成功[4]。對照組、模型組大鼠不進(jìn)行任何干預(yù)措施；參芪定悸湯低、高劑量組大鼠分別給予參芪定悸湯灌胃，劑量分別為每次12.9 g/kg-1·d-1、25.8 g/kg-1·d-1，1 d 2次，共給予28 d的灌胃。

1.4 檢測NT-proBNP和心肌肌鈣蛋白I（cTnI）的表達(dá)

灌胃結(jié)束，禁食、水12 h后，烏拉坦麻醉，動脈取血，離心，提取血清。采用ELISA法檢測血清NT-proBNP、cTnI含量。

1.5 檢測各組大鼠的心功能

末次灌胃后，各組大鼠禁食不禁水，12 h后進(jìn)行麻醉，用小動物高頻彩色超聲系統(tǒng)進(jìn)行心功能檢測，記錄大鼠左心室舒張期末壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP），左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）。

1.6 免疫印跡檢測p38MAPK、p-p38MAPK水平

各組大鼠麻醉后處死，取各組大鼠心肌組織，胰酶消化后提取細(xì)胞懸液，保存在-20℃的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液進(jìn)行混勻，然后將其煮沸、變性。把電泳后的50 μL蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗后PBS漂洗，最后加入二抗。取出PVDF膜，DAB顯色后照相。

1.7 檢測超氧化物歧酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量

麻醉大鼠，動脈取血3 mL，離心得血清，SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法檢測，MDA含量采用硫代巴比妥酸法檢測。

1.8 TUNEL及DAPI雙熒光染色

取對照組、模型組以及參芪定悸湯低、高劑量組大鼠心肌組織，石蠟包埋，切片（5張）入水，4℃，含0.1%Triton X-100的0.1%枸櫞酸鈉溶液透化處理4 min，3%雙氧水孵育10 min，PBS沖洗3 min×3次，converter-POD 37℃孵育30 min，PBS沖洗3 min×3次，DAB顯色劑顯色，室溫10 min，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染3 min，常規(guī)脫水，中性樹膠封片，PBS沖洗3 min×3次，DAPI染色液避光室溫下染色15 min，PBS沖洗3 min×3次，晾干。將制作完成的病理切片置于熒光顯微鏡下觀察，分析其組織特征并拍照。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，對照組，模型組，參芪定悸湯低、高劑量組4組大鼠的心功能、NT-proBNP、p38MAPK水平比較采用單因素方差分析，計量資料采用±s，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NT-proBNP和cTnI的表達(dá)

對照組大鼠NT-proBNP、cTnI的水平低于模型組（P＜0.05）；模型組NT-proBNP、cTnI的水平高于參芪定悸湯低劑量組與高劑量組（P＜0.05）；高劑量組大鼠NT-proBNP、cTnI的水平低于低劑量組（P＜0.05），CHF大鼠NT-proBNP、cTnI水平呈現(xiàn)高表達(dá)，給予參芪定悸湯干預(yù)后可降低大鼠NT-proBNP、cTnI表達(dá)水平（表2）。

表2 各組大鼠NT-proBNP、cTnI表達(dá)水平（n=11，±s，pg/mL）

表2 各組大鼠NT-proBNP、cTnI表達(dá)水平（n=11，±s，pg/mL）

*P＜0.05 vs 對照組；#P＜0.05 vs模型組；△P＜0.05 vs參芪定悸湯低劑量

組別 NT-proBNP cTnI對照組 0.31±0.04 132.45±12.57模型組 1.32±0.14* 312.67±30.49*參芪定悸湯低劑量組 1.03±0.11*# 267.21±25.42*#參芪定悸湯高劑量組 0.75±0.09*#△ 238.11±22.64*#△

2.2 各組大鼠心功能指標(biāo)

對照組LVSP的水平高于模型組，LVEDP的水平低于模型組（P＜0.05）；模型組LVSP的水平低于參芪定悸湯低、高劑量組，LVEDP的水平高于參芪定悸湯低、高劑量組（P＜0.05）；參芪定悸湯高劑量組LVSP的水平高于低劑量組，LVEDP的水平低于低劑量組（P＜0.05）。提示給予參芪定悸湯干預(yù)后可改善大鼠心功能（表3）。

表3 各組大鼠心功能指標(biāo)表達(dá)（n=11，±s，mmHg）

表3 各組大鼠心功能指標(biāo)表達(dá)（n=11，±s，mmHg）

*P＜0.05 vs對照組； #P＜0.05 vs模型組；△P＜0.05 vs參芪定悸湯低劑量組

組別 LVEDP LVSP對照組 1.52±0.17 142.35±13.26模型組 8.24±0.41* 83.77±8.92*參芪定悸湯低劑量組 6.37±0.35*# 103.49±10.36*#參芪定悸湯高劑量組 4.22±0.31*#△ 124.67±12.38*#△

2.3 p38MAPK、p-p38MAPK的表達(dá)

對照組大鼠心肌組織中p38MAPK、p-p38MAPK的表達(dá)低于模型組（P＜0.05）；模型組p38MAPK、p-p38MAPK的表達(dá)高于參芪定悸湯低、高劑量組（P＜0.05）；參芪定悸湯高劑量組大鼠心肌組織中p38MAPK、p-p38MAPK的表達(dá)低于低劑量組（P＜0.05）。提示給予參芪定悸湯干預(yù)后可降低p38MAPK、p-p38MAPK表達(dá)水平（圖1）。

圖1 各組p-p38MAPK、p38MAP表達(dá)量比較

2.4 SOD、MDA水平

對照組大鼠SOD的水平高于模型組（P＜0.05），MDA的水平低于模型組（P＜0.05）；模型組SOD的水平低于參芪定悸湯低、高劑量組（P＜0.05），MDA的水平高于參芪定悸湯低、高劑量組（P＜0.05）；參芪定悸湯高劑量組大鼠SOD的表達(dá)較低劑量組高，MDA的表達(dá)較低劑量組低（P＜0.05）。提示給予參芪定悸湯干預(yù)后改善大鼠氧化應(yīng)激水平（表4）。

表4 各組大鼠SOD、MDA表達(dá)水平（n=11，±s）

表4 各組大鼠SOD、MDA表達(dá)水平（n=11，±s）

*P＜0.05 vs 對照組；#P＜0.05 vs模型組；△P＜0.05 vs 參芪定悸湯低劑量組

組別 SOD（U/mL） MDA（μmol/L）對照組 165.22±21.37 4.35±1.04模型組 81.45±8.26* 22.31±2.45*參芪定悸湯低劑量組 118.31±12.35*# 12.57±1.49*#參芪定悸湯高劑量組 152.67±15.28*#△ 7.21±1.17*#△

2.5 心肌細(xì)胞凋亡情況

正常心肌細(xì)胞核顯色為藍(lán)色，凋亡小體顯色為綠色?？梢妼φ战M大鼠存在大量的存活心肌細(xì)胞，無明顯的心肌細(xì)胞凋亡；模型組大鼠正常心肌細(xì)胞明顯減少，存在大量凋亡小體；參芪定悸湯低劑量組和參芪定悸湯高劑量組與模型組相比，心肌細(xì)胞凋亡有所減少（圖2）。

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況，×200

3 討論

近年來CHF發(fā)病率逐漸提升，且其發(fā)病的原因復(fù)雜多樣、病程較長，臨床常用治療藥物有β受體阻滯劑、利尿劑等，但此類常見藥物副作用較大，安全性欠缺，而中醫(yī)醫(yī)藥安全、見效快、副作用也較少。因此，本研究采用參芪定悸湯對CHF進(jìn)行治療，觀察其對心功能及NT-proBNP水平、p38MAPK信號通路的影響。

本研究結(jié)果顯示，NT-proBNP、cTnI在模型組中為高表達(dá)，經(jīng)過參芪定悸湯干預(yù)后水平均有所下降，且以高劑量組下降更為明顯。CHF的產(chǎn)生及發(fā)展主要依賴于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分泌過度激活后釋放的大量活性物質(zhì)，此活性物質(zhì)可使心肌細(xì)胞加速壞死、心室重塑，最終加速心衰的發(fā)展[5]。心肌細(xì)胞、心肌壁、心室容量以及心肌缺血等受刺激時均可產(chǎn)生NT-proBNP，進(jìn)入血液循環(huán)。NT-proBNP可作為CHF患者的診斷指標(biāo)，具有調(diào)控心肌細(xì)胞重構(gòu)及增生的作用。在CHF患者中，心容量超負(fù)荷、心壓升高會使NT-proBNP的表達(dá)提升[6-7]。cTnI可調(diào)節(jié)橫紋肌的收縮，以游離或混合物的形態(tài)存在，正常機體中cTnI的表達(dá)較少，在機體發(fā)生CHF時，患者心臟產(chǎn)生超負(fù)荷，神經(jīng)內(nèi)分泌被激活過度，使得心肌細(xì)胞受損，cTnI由復(fù)合物形態(tài)轉(zhuǎn)為游離形態(tài)，進(jìn)入血液，使血清中cTnI含量大增[8]。CHF在中醫(yī)中屬“心悸”等范疇，其病因為患者機體心氣虛，淤血停留[9]。已有研究證實NT-proBNP與cTnI呈正相關(guān)，參芪定悸湯具有補中益氣，養(yǎng)心活血，安神定悸之功效，其中黃芪具有強心、治療表虛及氣虛等作用，黨參具有養(yǎng)血生津等作用，參芪定悸湯的作用機制可能是通過減少NT-proBNP的產(chǎn)生后使心臟負(fù)荷減輕，減少神經(jīng)內(nèi)分泌的激活使得cTnI進(jìn)入血液中的濃度降低，從而改善橫紋肌收縮，促使CHF得到改善[10]。曹平等[11]表明黃芪可通過抑制心肌細(xì)胞酶活性、提高CHF患者免疫功能、增強SOD活性、降低NT-proBNP水平，從而達(dá)到保護(hù)心功能的作用，本研究結(jié)果與曹平等研究結(jié)果相似。

本研究的模型組大鼠LVEDP水平較高、LVSP水平較低，在經(jīng)過參芪定悸湯干預(yù)后LFEDP水平有所下降、LVSP水平有所升高，以高劑量組效果更為明顯。LVEDP與LVSP是評價左心室舒縮功能的重要指標(biāo)，檢測其水平變化是研究心功能變化常用的方法。心室重構(gòu)是CHF的重要特征，其決定CHF的發(fā)生及發(fā)展。CHF心肌不足以恢復(fù)正常室壁張力，使心肌收縮功能異常加劇，LVEDP、LVSP水平變化異常，因此負(fù)荷加重，左心室整體功能降低，造成心室重構(gòu)晚期，心肌細(xì)胞增大，CHF病情加重[12-13]。參芪定悸湯中黨參具有養(yǎng)血生津等作用，麥冬具有治療心悸易驚等作用，五味子具有益氣生津、寧心等作用。參芪定悸湯對心功能的作用機制可能通過改善心肌細(xì)胞受損，減少左心室的重構(gòu)，改善心肌纖維束間的收縮功能，改善LFEDP、LVSP水平。黃芪是參芪定悸湯中的組成藥材之一，黃芪多糖是黃芪的提取物。朱曉雨等[14]研究表明，黃芪多糖可改善心肌功能、抑制心肌纖維化。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似。

本研究結(jié)果顯示，p38MAPK、p-p38MAPK在模型組中為高表達(dá)，在經(jīng)過參芪定悸湯干預(yù)后其表達(dá)有所下降，以高劑量組下降更為明顯。p38MAPK是細(xì)胞內(nèi)的重要信號通路分子，是MAPK 家族中的四大亞族之一，是介導(dǎo)細(xì)胞炎性反應(yīng)的主要信號通路蛋白[15]。p-p38MAPK是磷酸化的p38MAPK，被上游調(diào)控基因或環(huán)境相關(guān)因素刺激激活后，可以通過磷酸化修飾進(jìn)而激活多種轉(zhuǎn)錄因子，加劇心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，使其受到損傷[16]。炎癥因子通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活性、p38MAPK被激活后可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡[17]。參芪定悸湯中茯神、酸棗仁可寧心安神，遠(yuǎn)志可安神益智。楊桂菊等[18]研究顯示，黃芪多糖通過降低p38MAPK-HSP27信號通路的水平，減輕急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷的情況。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似。

本研究結(jié)果顯示，SOD的水平在模型組中為低表達(dá)、MDA的水平為高表達(dá)，在經(jīng)過參芪定悸湯干預(yù)后，可改善氧化應(yīng)激水平，以高劑量組效果更為明顯。SOD可通過催化超陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，在機體氧化與抗氧化中起著重要的作用。MDA、SOD的活性與心衰程度、心功能分級有關(guān)，MDA、SOD的活性被釋放，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，并促進(jìn)炎癥細(xì)胞的分泌，抑制細(xì)胞的收縮[19-20]。參芪定悸湯中丹參可活血化瘀、清心除煩，川芎可活血行氣、祛風(fēng)止痛、消炎等。參芪定悸湯的作用機制可能是通過改善心肌缺血及缺氧等狀態(tài)，降低心肌細(xì)胞損傷，使得過氧化減少，從而減輕炎癥細(xì)胞分泌，對病情具有治療作用。黨璇等[21]提示，丹參、黃芪和葛根通過提高SOD水平、降低MDA水平對腦缺血性再灌注損傷大鼠具有保護(hù)作用，同時抑制血栓的形成。本研究與上述研究結(jié)果相似。

綜上所述，參芪定悸湯可改善CHF大鼠心功能，從而達(dá)到對CHF大鼠的治療效果，其作用機制可能與調(diào)控NT-proBNP、p38MAPK的表達(dá)有關(guān)。本文存在一定的不足，未對p38MAPK水平升高導(dǎo)致p-p38MAPK水平升高進(jìn)行佐證，在今后的實驗中應(yīng)通過多元化實驗方案為CHF提供有力的依據(jù)。