移植大鼠脊神經(jīng)前后根重建脊髓白質(zhì)纖維束的形態(tài)學(xué)*

徐紀(jì)偉 孫丹華 陳旭東

（漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，漯河 462000）

脊髓損傷導(dǎo)致的肢體運(yùn)動(dòng)功能障礙，影響患者的生活質(zhì)量，因此如何治療和改善脊髓損傷后肢體運(yùn)動(dòng)功能，一直是神經(jīng)康復(fù)學(xué)科的研究熱點(diǎn)。本研究行第10～12胸段脊髓半切損傷，根據(jù)神經(jīng)傳導(dǎo)通路和脊神經(jīng)根的解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，通過移植脊髓損傷區(qū)域廢用的脊神經(jīng)前后根到脊髓損傷區(qū)域，同時(shí)切取肋間神經(jīng)連接損傷節(jié)段上下的脊神經(jīng)，重建感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)通路，通過對(duì)再生神經(jīng)的熒光顯微鏡觀察，旨在證明該反射通路的完整性，為其臨床應(yīng)用提供可靠的形態(tài)學(xué)依據(jù)[1]。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組

選取4周齡SD雌性大鼠90只，由中原正大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按數(shù)字表法隨機(jī)分成神經(jīng)根移植組、損傷組、假手術(shù)組。移植組損傷第10～12胸段脊髓，然后切取脊髓損傷區(qū)廢用的脊神經(jīng)前根和后根，并將前根移植到脊髓損傷區(qū)域的皮質(zhì)脊髓束位置，再將后根移植到薄束位置，脊髓與移植的神經(jīng)根進(jìn)行顯微吻合，同時(shí)切取第12、13肋間神經(jīng)連接損傷節(jié)段上下的脊神經(jīng)，留置導(dǎo)管給予膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell derived neurotrophic factor，GDNF）、軸突生長相關(guān)蛋白43（growth associated protein-43，GAP-43）、突 觸 分化誘導(dǎo)基因產(chǎn)物1（synapse differentiation induced gene 1，SynDIG1）。損傷組僅損傷第10～12胸段脊髓，不做其他處理。假手術(shù)組僅切開皮膚和分離肌肉，不損傷脊髓。

1.2 脊髓半切損傷模型的制備

用1%戊巴比妥鈉（10 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，使其俯臥于手術(shù)臺(tái)上，剪除皮毛消毒，切開后背正中皮膚，分離皮下組織和肌肉，暴露出第10～12胸椎棘突和椎板，切除棘突，暴露出脊髓，用角膜刀自中線向外側(cè)作一次橫旋切脊髓，隨后大鼠左下肢及尾部痙攣性抽搐后出現(xiàn)癱瘓，表示造模成功。分層縫合肌肉和皮膚。術(shù)后輔助排尿、腹腔注射慶大霉素[2]。

1.3 神經(jīng)分離切斷

飼養(yǎng)大鼠3 d后，用1%戊巴比妥鈉（10 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠固定于立體定位儀上，剪除皮毛消毒，切開后背正中皮膚，分離皮下組織和肌肉，分離范圍自第1腰椎和第1腰神經(jīng)根，找出脊神經(jīng)前后根，用電刺激檢測(cè)神經(jīng)根，分別剪斷第1腰神經(jīng)前根和后根，置于DMEM中，于室溫下備用。

在第12、13肋骨尾側(cè)，找到與其平行走行的第12、13肋間神經(jīng)，在其進(jìn)入肌肉處切斷肋間神經(jīng)，置于DMEM中，于室溫下備用。

1.4 定位神經(jīng)傳導(dǎo)通路及移植神經(jīng)

在手術(shù)顯微鏡下，以后正中溝為中線，向左平移2.0 mm，向下伸入脊髓1.1 mm，確定皮質(zhì)脊髓束位置[3]，手持眼科鑷將脊神經(jīng)前根移植到此區(qū)域，在吻合口和移植神經(jīng)的周圍滴入防粘連的幾丁糖，縫合神經(jīng)外膜與周圍硬脊膜。以后正中溝為中線，向下伸入脊髓0.8 mm，確定薄束位置，手持眼科鑷將脊神經(jīng)后根移植到此區(qū)域，同時(shí)將第12、13肋間神經(jīng)連接損傷節(jié)段上下的脊神經(jīng)，在吻合口和移植神經(jīng)的周圍滴入防粘連的幾丁糖。硬脊膜下脊髓損傷處固定導(dǎo)管，然后逐層縫合，體外留置導(dǎo)管1 cm[4-5]，按照5 μL/d分別給予GDNF、GAP-43、SynDIG1。術(shù)后輔助排尿，腹腔注射慶大霉素，持續(xù)給藥治療10 d。

1.5 組織學(xué)結(jié)構(gòu)觀察

術(shù)后90 d取第10～12胸段脊髓，置于10%甲醛溶液中固定、石蠟包埋后，分成2段（各0.5 cm長），分別沿神經(jīng)作縱向切片和橫切片，片厚40 μm，3%H2O2孵育10 min，5%山羊血清孵育30 min，棄去血清，滴加微管相關(guān)蛋白2（MAP2）抗體，4℃過夜；加入FITC標(biāo)記二抗，4℃12 h，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)組織生長情況。

1.6 行為學(xué)評(píng)價(jià)方法

術(shù)后7、30、60、90 d通過斜板實(shí)驗(yàn)和BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)大鼠左側(cè)后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況[6-7]。

1.7 神經(jīng)電生理刺激

動(dòng)物麻醉后選擇左側(cè)脊髓損傷近端、左側(cè)股神經(jīng)和右側(cè)大腦皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)分別進(jìn)行電刺激，記錄體感誘發(fā)電位（somatosensory evoked potential，SEP）和運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位（motor evoked potential，MEP）波形曲線。刺激頻率4 Hz，波寬0.2 ms，強(qiáng)度40～60 mV，信號(hào)經(jīng)前置放大器放大10萬倍，計(jì)算機(jī)疊加300次[8]。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)組織結(jié)構(gòu)的變化

移植組肉眼可見脊髓吻合段光滑圓潤，組織色澤新鮮，無明顯萎縮，無膨大神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成。熒光顯微鏡下顯示吻合段神經(jīng)纖維排列整齊、走行一致，移植神經(jīng)根內(nèi)的脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)完整，大部分神經(jīng)細(xì)胞存活。損傷組脊髓組織部分缺損、灰質(zhì)形態(tài)不規(guī)則、斷端形成神經(jīng)瘢痕。假手術(shù)組脊髓組織整體結(jié)構(gòu)完整、灰質(zhì)形態(tài)規(guī)則（圖1，見封2）。

圖1 脊髓組織MAP2 免疫熒光染色

2.2 運(yùn)動(dòng)功能測(cè)試比較

術(shù)后7、30、60、90 d，移植組的BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分、斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)分均顯著高于損傷組（表1、2），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示移植組肢體運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)程度好于損傷組。

表1 3組大鼠BBB功能評(píng)分比較（n=30，±s，分）

表1 3組大鼠BBB功能評(píng)分比較（n=30，±s，分）

*P＜0.05 vs損傷組

分組 7 d 30 d 60 d 90 d假手術(shù)組 19.0±0.5 19.5±0.5 19.5±0.5 20.0±0.5損傷組 4.0±0.5 4.0±0.5 5.0±1.0 6.0±1.0移植組 5.0±0.5 10.0±1.0* 11.5±1.0* 12.5±1.5*

表2 3組大鼠斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)分比較（n=30，±s）

表2 3組大鼠斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)分比較（n=30，±s）

*P＜0.05 vs損傷組

分組 7 d 30 d 60 d 90 d假手術(shù)組 70.0±0.5 70.0±0.5 70.0±0.5 70.0±0.5損傷組 22.0±0.5 25.0±0.5 27.0±1.0 26.0±1.0移植組 35.0±0.5* 40.0±1.0* 40.5±1.0* 41.5±1.0*

2.3 神經(jīng)電生理指標(biāo)比較

術(shù)后7、30、60、90 d，移植組SEP和MEP潛峰時(shí)較損傷組明顯縮短（表3、4），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 3組大鼠體感誘發(fā)電位潛峰時(shí)比較（n=30，±s）

表3 3組大鼠體感誘發(fā)電位潛峰時(shí)比較（n=30，±s）

*P＜0.05 vs損傷組

分組 7 d 30 d 60 d 90 d假手術(shù)組 2.32±0.25 2.33±0.26 2.30±0.25 2.32±0.25損傷組 4.92±1.33 4.55±1.25 4.23±0.82 3.92±0.56移植組 3.93±1.45* 3.33±1.20* 3.05±0.33* 2.87±0.22*

表4 3組大鼠運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位潛峰時(shí)比較（n=30，±s）

表4 3組大鼠運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位潛峰時(shí)比較（n=30，±s）

*P＜0.05 vs損傷組

分組 7 d 30 d 60 d 90 d假手術(shù)組 1.45±0.45 1.43±0.46 1.43±0.45 1.45±0.45損傷組 5.52±1.43 4.77±1.23 4.44±1.08 4.05±1.06移植組 3.23±1.03* 2.93±0.95* 2.15±0.83* 1.97±0.56*

3 討論

脊髓損傷的研究已有近百年的歷史，解決脊髓損傷后的中樞神經(jīng)再生問題以及神經(jīng)纖維的功能重建是各國醫(yī)學(xué)界普遍關(guān)注并廣泛研究的重大難題，國內(nèi)外都缺乏有效的治療方法。很多學(xué)者通過組織工程技術(shù)研究制備能引導(dǎo)神經(jīng)纖維有序延伸的膠原蛋白生物支架材料，還有一些學(xué)者通過干細(xì)胞技術(shù)、納米技術(shù)、分子神經(jīng)影像技術(shù)，應(yīng)用施萬細(xì)胞、干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷，上述細(xì)胞均在不同程度上促進(jìn)了神經(jīng)纖維的再生和機(jī)體部分功能的恢復(fù)，但是在臨床治療過程中發(fā)現(xiàn)通過生物支架和細(xì)胞移植后，截癱患者的機(jī)體功能改善并不明顯[9-10]。

在脊髓損傷后，Brunelli等[11]切取腓神經(jīng)連接損傷近端的脊髓外側(cè)束與坐骨神經(jīng)，發(fā)現(xiàn)腓神經(jīng)的再生軸突穿過神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕組織與脊髓建立神經(jīng)連接；對(duì)損傷近端脊髓行電刺激，在靶肌肉上獲得動(dòng)作電位，但是肢體自主運(yùn)動(dòng)功能無明顯改善。Lucas等[12]在脊髓損傷后將肋間神經(jīng)插入脊髓腰膨大處，也發(fā)現(xiàn)這些肋間神經(jīng)的再生軸突穿過神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕組織與脊髓建立神經(jīng)連接，且電刺激肋間神經(jīng)的軸突能引起腰骶部肌肉強(qiáng)烈收縮，但肢體自主運(yùn)動(dòng)功能也沒有明顯改善。在脊髓損傷后，Lee等[13]切取肋間神經(jīng)連接損傷平面上下的脊神經(jīng)，Campos等[14]切取腓神經(jīng)連接損傷平面上下的脊神經(jīng)，李偉等[5]切取尾下神經(jīng)連接損傷平面上下的脊神經(jīng)前根，顯示橋接神經(jīng)可以與脊神經(jīng)建立神經(jīng)連接，對(duì)移植神經(jīng)行電刺激，在靶肌肉上獲得肌電表現(xiàn)，肉眼也觀察到肌肉收縮，但是肢體自主運(yùn)動(dòng)功能均沒有明顯改善。Song等[15]將脊神經(jīng)后根的脊神經(jīng)節(jié)損毀后，通過移植肋間神經(jīng)與脊神經(jīng)后根連接，顯示胸脊神經(jīng)節(jié)的突起長入了坐骨神經(jīng)，可以支配下肢皮膚的感覺。

以上研究結(jié)果表明，通過橋接神經(jīng)連接脊髓與肢體可以建立神經(jīng)連接，刺激橋接神經(jīng)可引起肌肉收縮，也可以恢復(fù)部分感覺功能，但是對(duì)肢體的自主運(yùn)動(dòng)功能沒有明顯改善。本研究通過切取脊髓損傷區(qū)域廢用的脊神經(jīng)前根和后根，并將前根移植到脊髓損傷區(qū)域的皮質(zhì)脊髓束位置，再將后根移植到薄束位置，同時(shí)切取肋間神經(jīng)連接損傷節(jié)段上下的脊神經(jīng)，并給予GDNF、GAP-43、SynDIG1，肉眼觀察脊髓吻合段組織光滑圓潤，沒有明顯萎縮現(xiàn)象，吻合段在顯微鏡下可見神經(jīng)纖維排列整齊、走行一致，神經(jīng)根內(nèi)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞大量存活。斜板實(shí)驗(yàn)、BBB功能運(yùn)動(dòng)評(píng)分明顯提高，熒光顯微鏡觀察可見移植組大鼠皮質(zhì)脊髓束、薄束神經(jīng)纖維，移植脊神經(jīng)前后根可以重建脊髓白質(zhì)纖維束，神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)吻合修復(fù)良好，有利于神經(jīng)信號(hào)傳遞，促進(jìn)了下肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。這是因?yàn)橐皇羌股窠?jīng)前后根只有內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞容易侵入，可以降解神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕，另外脊神經(jīng)前后根內(nèi)施萬細(xì)胞、軟脊膜細(xì)胞分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子、細(xì)胞黏連分子等有利于突起修復(fù)，脊神經(jīng)前后根自身具有良好的再生修復(fù)能力[16-17]；二是脊神經(jīng)前根由脊髓前角運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的軸突組成，其內(nèi)部神經(jīng)遞質(zhì)、突觸小泡、受體等結(jié)構(gòu)成分均與運(yùn)動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)，并且前根內(nèi)部的神經(jīng)纖維較多，可以用來替代脊髓內(nèi)部粗大的皮質(zhì)脊髓束，解決神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)的下行通路[18-19]；三是脊神經(jīng)后根是由脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)假單極神經(jīng)元的中樞突和周圍突組成的，而脊髓內(nèi)部的薄束則主要是由脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)假單極神經(jīng)元的中樞突組成，后根與薄束具有高度的同源性，完全可以用來替代脊髓內(nèi)部的薄束，解決神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)的上行通路[20]；四是為了連接損傷節(jié)段脊神經(jīng)與脊髓信號(hào)傳導(dǎo)通路，通過切取自身的肋間神經(jīng)連接損傷節(jié)段上下的脊神經(jīng)，可恢復(fù)損傷節(jié)段脊神經(jīng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。

總之，本研究通過切取脊髓損傷節(jié)段的脊神經(jīng)前根、后根，分別移植到脊髓損傷區(qū)域的皮質(zhì)脊髓束、薄束位置，重建白質(zhì)纖維束，再切取肋間神經(jīng)連接損傷節(jié)段上下的脊神經(jīng)，進(jìn)而恢復(fù)脊髓組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，橋接損傷節(jié)段脊神經(jīng)，重建粗大的神經(jīng)纖維傳導(dǎo)束，貫通脊髓、脊神經(jīng)神經(jīng)傳導(dǎo)通路，有效解決脊髓損傷后的中樞神經(jīng)再生問題以及神經(jīng)纖維的功能重建，有利于恢復(fù)肢體的自主運(yùn)動(dòng)功能。