TOMM40 基因多態(tài)性及基因- 環(huán)境交互作用對血管性癡呆的影響

馬玥 ，張鵬 ，盧杉

1.黑龍江省醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，黑龍江哈爾濱 150000；2.黑龍江省醫(yī)院老年神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江哈爾濱 150000；3.黑龍江省醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，黑龍江哈爾濱 150000

阿爾茨海默病是世界排名第一的癡呆類型疾病，血管性癡呆（vascular dementia, VD）是世界排名第二大癡呆類型的疾病， 腦血管因素引發(fā)的腦部組織損害造成的癡呆綜合征是該病的主要發(fā)病原因，分類型為缺血性腦血管疾病、 急慢性缺氧腦血管疾病和出血性腦血管疾病， 約占老年認(rèn)知障礙病因的20%,其臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能減退、記憶障礙、情感障礙、行為異常、 生活自理能力及其他社會功能下降，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[1-3]。 血管性癡呆受多因素影響，認(rèn)為其與基因、環(huán)境、基因-環(huán)境共同作用發(fā)生。 在研究VD 疾病發(fā)病因素時，如果單純考慮遺傳因素或環(huán)境因素單一因素對疾病病因的相關(guān)性，忽略基因-環(huán)境兩因素的交互作用，會對病因的風(fēng)險評估出現(xiàn)誤差[4-6]。該研究選擇2020 年6 月—2021 年6月門診及住院治療的100 例VD 患者入組， 對照組選取沒有認(rèn)知功能障礙的老年人100 名入組， 探索基因、 周圍環(huán)境和基因-環(huán)境之間的交互作用機(jī)制，以此來更好地解釋血管性癡呆疾病的發(fā)生發(fā)展過程，進(jìn)行更為有效的預(yù)防VD 發(fā)生的風(fēng)險預(yù)測，對該病具有重大的指導(dǎo)意義。 現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取門診及住院治療的100 例VD 患者為病例組， 同時選取無認(rèn)知功能障礙的健康老年人100 名作為隨機(jī)對照組。研究對象患者簽訂知情同意書，采用簡易智能狀態(tài)檢測量表（MMSE）和蒙特利爾認(rèn)知評估量表（MoCA）兩個量表檢測評估[7]，評分測試由該院?？漆t(yī)師完成，避免出現(xiàn)偏倚。參與患者均了解該次研究的目的， 均自愿參加并該次研究方法和內(nèi)容經(jīng)過醫(yī)院倫理委員批準(zhǔn)。

病例組納入標(biāo)準(zhǔn)： 均符合瑞士日內(nèi)瓦國際神經(jīng)科學(xué)研究協(xié)會和美國國立衛(wèi)生院兩個權(quán)威機(jī)構(gòu)制定的血管性癡呆疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)； 顱腦CT、MRI 影像檢查證實(shí)腦內(nèi)有多發(fā)腔隙性梗死或梗死灶或缺血性廣泛性白質(zhì)損害， 并且梗死灶區(qū)域?qū)?yīng)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、神經(jīng)體征與血管性癡呆患病因素有必然因果性；患者及家屬對該研究具體內(nèi)容有知情權(quán)并簽署知情同意書[8]。排除標(biāo)準(zhǔn)： 患有嚴(yán)重心、腎、肝等器質(zhì)性病變或其他惡性病變者；嚴(yán)重焦慮、躁狂、抑郁癥等心理疾病者；嚴(yán)重意識障礙，表達(dá)不清者[9]。

1.2 方法

1.2.1 問卷調(diào)查 設(shè)計環(huán)境流行病學(xué)調(diào)查表對受試者完成問卷調(diào)查答卷，調(diào)查表內(nèi)容包括人口基本資料，研究組 100 例，男 64 例，女 36 例；年齡 45~76 歲，平均（60.82±11.65）歲。 患者自愿并同意在醫(yī)生指導(dǎo)下按要求填寫調(diào)查問卷表； 采用匿名調(diào)查問卷收集資料，并遵循保密原則。 問卷包括癡呆的嚴(yán)重程度、血管相關(guān)危險因素和個人生活飲食習(xí)慣、 氣候氣溫氣壓等方面。

1.2.2 基因多態(tài)性檢測 全血標(biāo)本采集：所有患者清晨空腹未進(jìn)食水， 采用枸櫞酸鉀抗凝管抽取靜脈血5 mL， 目的是防止抽取的血液凝固和出現(xiàn)溶血現(xiàn)象影響結(jié)果，于-8℃冰箱冷凍保存，標(biāo)本收集完成后，提取DNA，儲存于低溫下備用。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增 根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）提供的 TOMM40 基因序列，PCR 設(shè)計TOMM40基因引物：正向引物：5’-AGGAAGAGATGAGAGTTGGTGTG-3’，反向引物 ：5’-CTGGAGAAGAGAAACGCTGTC-3’。根據(jù)熔解曲線圖挑選出不同基因型的樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并由上海生工生物工程股份有限公司合成基因。

1.2.4 溫度及循環(huán)設(shè)置 PCR 反應(yīng)條件 95℃預(yù)變性10 min 后進(jìn)入主循環(huán)，95℃變性 30 s，60℃退火 30 s,72℃延伸60 s，共兩個循環(huán)，退火溫度每兩個循環(huán)下降 2℃直至 55℃，95℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸60 s，共40 個循環(huán)。

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳法 將盛有20 mL TAE 的錐形瓶中加入0.3 g 瓊脂糖，酒精燈加熱1 min。等待液體變涼， 加入 2 μl EB 或 4 μl 核酸染料至錐形瓶中。 制膠板放入制膠電泳槽中，插入梳子。 將溶解的瓊脂糖倒入其中至4~6 mm。 消除氣泡。 室溫下冷卻至凝固。垂直拔出梳子避免空樣完好無損。將膠版放入電泳槽內(nèi)， 取 5 μl PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物加入 1 μl DNA loading，合計 7 μl。 將其加入樣孔中。 使用 2000TM DNA Marker 5 μl 作為對照樣本。連接電源打開電泳儀器開關(guān)。 調(diào)節(jié)電壓在80~100 V，電泳時間約20 min完成。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)室結(jié)果檢測 檢測血管癡呆患者和健康人的TOMM40 基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型、等位基因型和單倍體型分布的特征特定情況，得出結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果采用單因素和多因素非條件Logistic 分析相關(guān)性, 分析環(huán)境因素作為變量對血管性癡呆患者數(shù)據(jù)的影響值，釆用非條件Logistic 分析TOMM40基因位點(diǎn)與血管性癡呆患者數(shù)據(jù)的相關(guān)性， 分析基因-環(huán)境因素的交互作用數(shù)據(jù)結(jié)果用多因子降維法（GMDR），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血管性癡呆患者環(huán)境因素多元線性回歸分析

以環(huán)境因素為因變量，進(jìn)行多元線性回歸分析，以標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)判斷自變量對因變量的影響相關(guān)性，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)生活飲食、氣溫氣候是血管性癡呆患者的影響因素（P＜0.05）。 見表 1。

表1 血管性癡呆患者環(huán)境因素多元線性回歸分析

2.2 TOMM40 的 Logistic 回歸分析

Logistic 回歸分析顯示，TOMM40 的 rs2075650位點(diǎn)基因型分布與血管性癡呆發(fā)病風(fēng)險相關(guān)（P<0.05），見表2。

表2 TOMM40 基因型分布與血管性癡呆發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性

2.3 基因-環(huán)境因素的交互分析結(jié)果

TOMM40 基因交互作用的 GMDR 模型分析結(jié)果針對篩選的與生活習(xí)慣、 環(huán)境因素相關(guān)的因素在病例組和對照組的基因分型結(jié)果，采用GMDR 分析各 SNP 之間的交互作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)至少3 種模型與血管性癡呆的發(fā)病具有相關(guān)性（P＜0.05），見表 3。

表3 TOMM40 基因-環(huán)境因素交互分析

3 討論

該研究結(jié)果顯示， 以標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)判斷自變量對因變量的影響，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)生活飲食、氣溫氣候是血管性癡呆患者的影響因素（P＜0.05）。相關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，中年患者在外用餐機(jī)會較多，生活飲食可能與職業(yè)壓力和社交有關(guān)。 同時由于北方天氣寒冷飲食習(xí)慣相比南方天氣影響血管癡呆性疾病的相關(guān)性增加[10]。 證實(shí)血管癡呆性疾病與患者的生活飲食習(xí)慣和當(dāng)?shù)氐臍鉁貧夂虻挠绊懼芮嘘P(guān)聯(lián)。

TOMM40 基因是線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)酶40 基因，該基因定位于19ql3.2，是外膜轉(zhuǎn)移酶(TOM)形成的聚合體，同樣是蛋白進(jìn)入線粒體入口的重要通道，最終形成的亞基基因因子，TOMM40 基因參與蛋白質(zhì)導(dǎo)入線粒體的機(jī)制和原理過程不可缺少。 已證實(shí)線粒體為細(xì)胞的活性提供了能量物質(zhì)， 線粒體的功能可以復(fù)制和表達(dá)DNA， 同時調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)的基因。TOMM40 表達(dá)異常將導(dǎo)致線粒體功能障礙， 組織中央自由基增多，造成腦組織損傷。目前國內(nèi)外大量研究結(jié)果表明， 晚期阿爾茨海默病的發(fā)病因素與TOMM40 基因的 rs2075650 位點(diǎn) poly-T 重復(fù)序列的長度具有密切的相關(guān)性[11-13]，與該研究結(jié)果一致。以往有研究報道證實(shí)，TOMM40 基因rs2075650 位點(diǎn)多態(tài)性研究結(jié)果與腦梗死的發(fā)生呈正相關(guān)性（OR=0.391，P＜0.05）。 與該研究結(jié)果一致，該文研究結(jié)果呈正相關(guān)（OR=0.687，P＜0.05）。提示以上位點(diǎn)可能改變基因功能， 并最終影響血管性癡呆的發(fā)生與發(fā)展。TOMM40 基因的表達(dá)異常結(jié)果，可以直接影響到線粒體蛋白質(zhì)的輸入輸出功能， 從而引起細(xì)胞核編碼蛋白質(zhì)向線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)作用受到阻礙， 無法正常工作，使其不能正常進(jìn)入線粒體內(nèi)，導(dǎo)致線粒體無法發(fā)揮正常作用，最終引發(fā)線粒體的功能出現(xiàn)障礙，無法正常工作，從而線粒體會產(chǎn)生更多的氧自由基，如此反復(fù)最終形成了惡性循環(huán)， 反復(fù)發(fā)作進(jìn)而影響腦組織的正常生理功能[14-16]。 相關(guān)學(xué)者對TOMM40 多態(tài)性與LOAD 的關(guān)系研究對我國北方漢族人群中得到證實(shí)結(jié)論， 方法是分別檢測了是 rs2075650、rs157580 和 rs11556503 個 SNP 位點(diǎn)，中國漢族人群的LOAD 發(fā)病機(jī)制中TOMM40 基因多態(tài)性密切相關(guān)起到十分重要的作用[17-18]。TOMM40 基因交互作用的GMDR 模型分析結(jié)果針對篩選的與生活習(xí)慣、環(huán)境因素相關(guān)的因素在病例組和對照組的基因分型結(jié)果， 采用GMDR 分析了各 SNP 之間的交互作用關(guān)系，認(rèn)為血管性癡呆的發(fā)病至少有3 種LOAD 具有密切相關(guān)（P＜0.05），血管性癡呆患者的發(fā)病因素中Logistic 回歸模型結(jié)合GMDR 模型能夠全面分析基因和基因-環(huán)境之間的相互作用，起到十分重要的作用。 該研究同樣采用GMDR 分析了各 SNP 之間的交互作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)至少3 種模型與血管性癡呆的發(fā)病具有相關(guān)性（P＜0.05）。

綜上所述，為防范、早期診斷及及早治療人類血管性癡呆這類復(fù)雜的疾病， 未來需要研究者不斷改善GMDR 模型研究方法，探索新的研究方法，希望通過加大樣本量增加到人群隊列中， 研究得出血管性癡呆疾病的影響因素與基因和基因-環(huán)境因素息息相關(guān)，從而發(fā)現(xiàn)基因、基因和環(huán)境等多種因素因子與血管性癡呆疾病之間的相互關(guān)聯(lián)性， 為下一步研究提供可靠依據(jù)。