副波長對免疫比濁法檢測尿微量清蛋白精密度的影響

鐘富軍 ，王麗 ，唐友東 ，曾妍

1.四川省成都市青羊區(qū)第九人民醫(yī)院檢驗科，四川成都 610091；2.峨眉山市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，四川峨眉山 614200

尿微量清蛋白（mALB）是人體尿液中一種含量極少的白蛋白， 在正常人體中所含的尿微量清蛋白一般低于＜20 mg/L[1]。一旦超過20 mg/L，則表明人體腎臟功能出現(xiàn)異常。目前，隨著臨床對尿微量清蛋白的認識， 其已成為反映腎臟疾病及病變程度的重要指標[2]。 近年來，尿微量清蛋白已逐漸成為臨床實驗室的常規(guī)檢測指標之一， 且全自動化分析儀的普及也最大限度地提高了工作效率和檢測結(jié)果的精密度， 其中免疫透射比濁法因具有操作簡便、 靈敏度高、精確度高、穩(wěn)定性好、測定時間快及可應(yīng)用于儀器自動分析等優(yōu)點， 已成為尿微量清蛋白的常用檢測方法[3]。由于目前市場上的全自動化分析儀越來越多，不同產(chǎn)商所生產(chǎn)的相關(guān)儀器、試劑也不盡相同，對副波長的要求也參差不齊， 甚至有些產(chǎn)商并未給出相關(guān)副波長參數(shù)和說明， 影響臨床檢測患者尿微量清蛋白的精密度[4]。 基于此，該研究收集2020 年1月—2021 年1 月在該院住院治療的50 例患者的尿液標本， 并運用免疫比濁法檢測其尿微量清蛋白精密度過程中加入副波長后對其產(chǎn)生的影響。 旨在提高免疫透射比濁法檢測尿微量清蛋白的精密度，為患者臨床診治提供更加科學(xué)的依據(jù)。 現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

50 例患者中男 28 例，女 22 例；年齡 30～71 歲，平均（50.05±5.34）歲。所有患者和或家屬均知悉該研究內(nèi)容，且自愿參與，并簽署知情同意書。 該研究已通過醫(yī)學(xué)倫理委員會批準進行。 納入標準：高血壓、糖尿病、 腎臟疾病者； 已有尿微量白蛋白增高的患者；臨床資料完整者。 排除標準：合并有發(fā)熱、血尿、尿路感染等患者；1 個月內(nèi)有去甲腎上腺素注射史者；合并腫瘤、全身性疾病者；臨床資料缺失者。

1.2 方法

尿微量清蛋白濃度檢測：采用免疫比濁法檢測，免疫透射比濁法尿微量清蛋白（mALB）檢測試劑盒為深圳邁瑞生物醫(yī)療有限公司提供， 儀器為深圳邁瑞B(yǎng)S600 型自動生化分析儀（尿微量蛋白波長參數(shù)：主波長340 nm，副波長700 nm）。收集患者晨尿10 mL，以1 500 r/min 離心10 min，然后取其上清液分成4 份，2～8℃保存。檢測其尿微量清蛋白，并分為A（10 mg/L）、B（100 mg/L）、C（200 mg/L）、D（400 mg/L）4 組，每個濃度重復(fù)檢測5 次，連續(xù)5 d，共檢測25 次，記錄結(jié)果，取每個濃度檢測結(jié)果的平均值，計算批內(nèi)精密度和總精密度。

精密度測定： 參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）頒布的醫(yī)學(xué)實驗室精密度和準確度的驗證指南（EP15-A2），在副波長加入前后，對4 個不同濃度標本均進行連續(xù)5 d 的檢測，且每個標本每日檢測5次，記錄每次檢測結(jié)果，取其平均數(shù)。在檢測過程中，加入質(zhì)控標本， 如若在同一時間段檢測時有標本超出正常范圍，則應(yīng)停止檢測，并檢查其中問題，加以糾正，將此標本納入下一次檢測。

1.3 精密度驗證判斷

在獲取尿微量清蛋白時， 記錄廠商聲明精密度界限， 以此作為檢測標準， 然后根據(jù)精密度測定方法， 獲取不同濃度標本在副波長加入前后的批內(nèi)精密度和總精密度，并與廠商聲明精密度界限對比。若低于廠商聲明精密度界限，則表示驗證通過，反之表示不合格， 需進一步查找原因， 同時與廠商取得聯(lián)系，共同糾正。

1.4 統(tǒng)計方法

將研究獲得數(shù)據(jù)錄入Excel 數(shù)據(jù)庫，運用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料采用頻數(shù)或率（%）表示。

2 結(jié)果

根據(jù)檢驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 產(chǎn)商聲明精密度界限為5%，在副波長添加前，4 組患者尿微量清蛋白精密度和總精密度驗證結(jié)果均高于5%； 而在副波長添加后，4 組患者尿微量清蛋白精密度和總精密度驗證結(jié)果中，A 組、B 組及C 組批內(nèi)精密度驗證結(jié)果亦高于5%， 但C 組總精密度和D 組驗證結(jié)果則低于5%。 見表 1 、表 2。

表1 副波長添加前患者尿微量清蛋白精密度驗證結(jié)果

表2 副波長添加后患者尿微量清蛋白精密度驗證結(jié)果

3 討論

白蛋白是主要的血漿蛋白， 其作為結(jié)合和轉(zhuǎn)運蛋白，結(jié)合脂肪酸、膽紅素、激素等并運輸這些物質(zhì)到全身各部位完成其重要生理功能； 其次白蛋白還具有維持血漿膠體滲透壓平衡的作用[5-6]。 正常腎小球可濾過低分子量的蛋白質(zhì)， 經(jīng)近端小管重吸收，24 h 的白蛋白排出量低于30 mg, 尿蛋白定性為陰性； 當尿白蛋白量超過300 mg/24 h, 尿蛋白定性陽性。 尿微量白蛋白是指24 h 尿液中的白蛋白為30～300 mg。 正常人24 h 內(nèi)尿白蛋白排出量很少，約為30 mg，即排出量為 20.8 μg/min。 白蛋白是尿蛋白的主要成分，約占40%～50%[7]。尿中白蛋白排泄量與腎小球濾過量成正比， 尿白蛋白排出過多主要反映腎小球損傷造成的濾過增加。 而尿微量白蛋白尿是指常規(guī)方法無法檢出，但是高于正常的白蛋白尿。尿微量白蛋白的增加是腎損害的早期指標， 其增加對各種腎臟病及高血壓、 糖尿病的早期腎損害的診斷有重要價值，是臨床診斷的標準及治療的靶目標[8]。 以往對于尿微量白蛋白的檢測多為以患者24 h 內(nèi)的尿液標本進行檢驗，但其實際效果并不理想，且因諸多因素干擾導(dǎo)致檢測結(jié)果并不準確[9]。 而近年來，以檢測清晨第一次尿或任意一次尿液中白蛋白與肌酐比值代替24 h 尿蛋白定量，可避免尿量變化對結(jié)果的影響[10]。 免疫比濁法是目前常用的用于測定抗原-抗體結(jié)合的動態(tài)檢測方法， 其原理為， 在稀釋系統(tǒng)中，抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)，稀釋成一定比例后形成復(fù)合物， 再通過聚乙二醇等聚合物作用， 從液相中析出，形成微粒，使其與反應(yīng)液混濁，并逐漸沉積于反應(yīng)液中。 最后檢測復(fù)合物中抗原含量， 若抗原量增加， 復(fù)合物量也隨之增加， 反應(yīng)液混濁度也隨之增加。 檢測反應(yīng)液渾濁度，與標準樣本比較，即可計算出樣品中抗原含量[11]。 在尿微量清蛋白檢測中，主要是通過尿液中的mALB 與試劑中特異性的mALB 抗體結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物而產(chǎn)生濁度，其濁度與mALB 的含量成正比. 通過測定特定波長的吸光度，參照校準曲線計算出mALB 的濃度[12]。

該研究結(jié)果顯示，以產(chǎn)商聲明精密度界限（5%）作對比，在副波長添加前，4 組患者尿微量清蛋白精密度和總精密度驗證結(jié)果均高于5%；而在副波長添加后，4 組患者尿微量清蛋白精密度和總精密度驗證結(jié)果中，A 組、B 組及C 組批內(nèi)精密度驗證結(jié)果亦高于 5%，但 C 組總精密度（4.54）和 D 組（3.05）驗證結(jié)果則低于5%。 在實驗過程中，副波長的添加能夠大大減少各種因素對實驗結(jié)果的干擾，例如噪聲、標本溶血、混濁等，并可減少散光影響[13]。 之后通過生化分析儀，對整個檢測過程進行全程監(jiān)測，記錄副波長加入后的標本反應(yīng)情況，及在不同濃度標本中發(fā)熱波長、吸光度值。最后記錄相關(guān)的數(shù)據(jù)，從而了解不同濃度標本在副波長加入后的精密度和總精密度[14]。 從研究結(jié)果得知，在未加入副波長前，產(chǎn)商聲明精密度界限值均顯著低于各個濃度標本的精密度和總精密度。 加入副波長后，濃度為200 mg/L 的尿微量清蛋白總精密度及濃度為400 mg/L 的尿微量清蛋白批內(nèi)精密度和總精密度的驗證結(jié)果卻較產(chǎn)商聲明精密度界限更低。 說明添加副波長后相關(guān)的干擾因素得以消除或降低，檢測值的穩(wěn)定性得以明顯改善。 但從結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)，加入副波長后，濃度為10 mg/L、100 mg/L 的尿微量清蛋白批內(nèi)精密度和總精密度， 及濃度為200 mg/L 的尿微量清蛋白批內(nèi)精密度的驗證結(jié)果仍然高于產(chǎn)商聲明精密度界限。其原因可能是在低濃度區(qū)間， 檢測值的穩(wěn)定性較差[15]。從研究結(jié)果中可以看出， 未加入副波長前和加入副波長后相比，隨著尿微量清蛋白濃度的增加，檢驗精密度值越趨于產(chǎn)商聲明精密度界限，尤其是濃度在＞200 mg/L 時。 說明副波長對濃度越高的尿微量清蛋白標本所產(chǎn)生的影響更大， 而對濃度較低的尿微量清蛋白標本所產(chǎn)生的影響較小。

目前， 國內(nèi)外對尿微量清蛋白的具體精密度界限尚無統(tǒng)一定論，而在衛(wèi)生行業(yè)也無相應(yīng)的標準，同時不同廠商對此精密度的說明也不一致， 甚至沒有具體說明， 這就導(dǎo)致對于尿微量清蛋白檢測的精密度界限存在一定爭議。 但在我國，有相關(guān)實驗提出，尿微量清蛋白精密度誤差應(yīng)在總誤差的30%以下，并提出總精密度應(yīng)低于10%，批內(nèi)精密度低于7.5%[16]。 參照此標準，結(jié)合該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，副波長加入前，與檢驗精密度值相比，C 組（200 mg/L）尿微量清蛋白批內(nèi)精密度、D 組（400 mg）尿微量清蛋白批內(nèi)精密度和總精密度檢驗結(jié)果均更低， 而加入副波長后，濃度為 100 mg/L（A 組）、200 mg/L（B 組）、400 mg/L（D 組）的尿微量清蛋白批內(nèi)精密度和總精密度均低于檢驗精密度值。 雖然部分標本精密度高于產(chǎn)商聲明精密度界限， 但卻沒有超出相關(guān)檢驗室的精密度界限[17]。 而對于高于相關(guān)檢驗室精密度界限的標本，其原因可能是由于儀器設(shè)備所致，也可能是由于標本的問題對檢測結(jié)果造成的誤差， 也不排除部分試劑精密度性能指標存在虛標的情況[8,18]。

綜上所述， 免疫透射比濁法檢測尿微量清蛋白精密度過程中加入副波長， 可顯著提高檢驗結(jié)果的精密度，對患者的臨床診斷、治療及預(yù)后均有重要意義。但在臨床檢驗工作中，不能過分依賴儀器的檢測結(jié)果，當對結(jié)果產(chǎn)生懷疑時應(yīng)結(jié)合病史、臨床其他檢查結(jié)果綜合起來進行判斷。