振動運(yùn)動對2型糖尿病大鼠骨骼肌FOXO1、GLUT4蛋白表達(dá)的影響

于玲，王晶，劉影，劉濤

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院；3.錦州醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，遼寧 錦州 121000)

2型糖尿病(diabetes mellitus，T2DM)是一種代謝性疾病，以血糖升高、胰島素抵抗、血脂紊亂為其主要表現(xiàn)。其形成原因與胰島素抵抗和胰島細(xì)胞受損有關(guān)。胰島素抵抗是指胰島素靶器官(肝臟、脂肪、骨骼肌等)對胰島素不敏感，主要體現(xiàn)在骨骼肌和脂肪組織對葡萄糖的攝取能力變?nèi)?，存儲能力降低，肝臟中葡糖糖輸出增多，致使胰腺要分泌更多的胰島素來維持機(jī)體的正常代謝。當(dāng)代償無法進(jìn)行時(shí)機(jī)體的血糖就不能恢復(fù)到正常水平，形成2型糖尿病。世界糖尿病聯(lián)盟公布的數(shù)據(jù)顯示，2019年全球糖尿病患者有4.63億人，中國糖尿病患者約為1.164億人，預(yù)計(jì)到2040年中國糖尿病患者人數(shù)將達(dá)到1.51億人，糖尿病的防治形勢更加嚴(yán)重[1]。

運(yùn)動療法作為糖尿病預(yù)防與治療的有效手段，一直以來非常受重視，如袁李佳龍[2]等研究顯示適當(dāng)游泳運(yùn)動能夠使2型糖尿病大鼠損傷的骨骼肌有所改善。張新霞[3]等研究顯示適度的中等強(qiáng)度的跑臺運(yùn)動能夠緩解糖尿病大鼠骨骼肌的病理損傷。振動運(yùn)動是通過機(jī)械振動來引起肌肉收縮的方法[4]，是一種不受患者意識支配的被動運(yùn)動方式，能夠在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到與傳統(tǒng)運(yùn)動同樣的效果，能夠增加患者對運(yùn)動的依從性。振動運(yùn)動在糖尿病預(yù)防與減輕其并發(fā)癥方面有一定的研究。有研究顯示振動運(yùn)動能夠降低血糖，改善胰島素抵抗，振動運(yùn)動聯(lián)合藥物能夠減輕二型糖尿病肝臟的損傷[5-6]。本研究主要探討振動運(yùn)動對2型糖尿病糖脂代謝、骨骼肌FOXO1和GLUT4蛋白表達(dá)，對骨骼肌病理損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

低密度脂蛋白(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)、總膽固醇(totalcholesterol，TC)、甘油三酯(tri-glyceride，TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)試劑盒(南京建成生物)；鏈脲佐菌素(Sigma公司)；BCA蛋白試劑盒(北京鼎國昌盛生物科技有限公司)；血糖儀(美國強(qiáng)生公司)；全自動生化儀(日本日立公司)；顯微鏡(日本Nikon公司)；電磁吸合式振動臺(廣州凡正電磁振動機(jī)廠)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；SD大鼠，雄性，(6～8)w，體重(200±20)g，來自錦州醫(yī)科大學(xué)動物中心。

1.2 方法

1.2.1 2型糖尿病糖模型的制備

取雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，普通飼料喂養(yǎng)正常對照組大鼠，高脂高糖飼料[7](飼料配方：66.5%基礎(chǔ)維持飼料、2.5%膽固醇、10%豬油、1%膽酸鹽、20%蔗糖)喂養(yǎng)糖尿病模型組，每組均喂養(yǎng)8 w。將鏈脲佐菌素溶解在pH值為3.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，臨用前在超凈臺中用0.22 μm無菌濾膜過濾。2型糖尿病糖組一次性腹腔注射小劑量(25 mg/kg)鏈脲佐菌素，損傷大鼠部分胰腺組織誘發(fā)2型糖尿病糖模型，72 h后測血糖，連續(xù)檢測3 d，血糖平穩(wěn)后，選取血糖值>11.1 mmol/L的大鼠為2型糖尿病模型大鼠。正常對照組給予同體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

1.2.2 分組及運(yùn)動方式[8]

將2型糖尿病模型大鼠隨機(jī)分成模型組、高頻(35 Hz)振動組、中頻(25 Hz)振動組和低頻(15 Hz)振動組，每組7只。各組的振幅峰峰值均為3 mm，振動運(yùn)動時(shí)間為15分鐘/次，每天早晚各運(yùn)動1次，每周運(yùn)動6 d，為期8 w。運(yùn)動方式是垂直振動，最大位移為52 mm，工作頻率0.5～600 Hz。振動臺上放置由9個(gè)長方體方格組成的自制玻璃支架，距離振動臺面1 cm，將大鼠放入方格內(nèi)，大鼠只能站立，這樣下肢就能直接接觸振動臺將振動傳到到全身。糖尿病組和振動運(yùn)動組給予高脂高糖飼料，正常對照組給與普通飼料，飲水均自由進(jìn)食。

1.2.3 樣本收集

分別于實(shí)驗(yàn)開始的第0、2、4、6、8周檢測FBG；實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，大鼠禁食12 h，用10%烏拉坦按10 mL/kg的劑量麻醉，眼眶取血，離心，留存血清用于生化指標(biāo)測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死，取大鼠小塊骨骼肌置于4%多聚甲醛溶液中固定，HE染色觀察；將剩余骨骼肌置于-80 ℃冰箱內(nèi)，備用于測定GLUT4、FOXO1和DK4蛋白表達(dá)。

1.2.4 生物化學(xué)指標(biāo)測定

氧化酶法，全自動生化分析儀檢測甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白總膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白總膽固醇(HDL-C)。

1.2.5 炎癥因子的測定

ELISA法檢測大鼠血清中炎癥因子IL-6、TNF-α含量。

1.2.6 氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)物質(zhì)

使用黃嘌呤氧化酶法測定大鼠骨骼肌中SOD 的活性；使用硫代巴比妥酸法檢測大鼠骨骼肌中MAD含量。

1.2.7 骨骼肌組織HE染色

骨骼肌組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定48 h后，70%乙醇脫水8 h，80%乙醇脫水過夜，90%乙醇脫水1次，95%乙醇脫水2次，100%乙醇脫水2次，二甲苯透明2次，浸蠟2次，將組織包埋于蠟塊中。取包好的組織塊切片，厚度為5 μm，二甲苯脫蠟，乙醇脫苯，PBS洗脫2次，蘇木精、伊紅染色；再經(jīng)不同濃度乙醇洗脫、二甲苯透明、中性樹膠封片后，用光學(xué)顯微鏡觀察各組骨骼肌組織病理學(xué)改變。

1.2.8 FOXO1、GLUT4蛋白表達(dá)檢測

Westerm blot法檢測，取部分骨骼肌組織用細(xì)胞超聲粉碎機(jī)粉碎，加入一定量的裂解液，靜止30 min，12 000 prm離心15 min，取上清液為組織總蛋白，蛋白濃度用BCA法進(jìn)行測定，根據(jù)測定的樣品蛋白濃度，校正蛋白質(zhì)上樣量，盡量保持樣品蛋白含量的均一性。每組樣品在上樣前加入不同體積的上樣緩沖液loading buffer，在沸水中煮沸5 min，使蛋白質(zhì)變性。配置分離膠與濃縮膠，插入齒梳，待濃縮膠凝固后，放入電泳槽，加入電泳緩沖液，所有樣品和蛋白標(biāo)準(zhǔn)物上樣量均為20 μL，電壓設(shè)為90 V，開始聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察Maker蛋白的分離狀況，終止電泳。用硝酸纖維素(PVDF)膜膜干法轉(zhuǎn)膜20 min，轉(zhuǎn)膜電壓100 V，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白不同的分子量對膜進(jìn)行切割，取含目標(biāo)蛋白的PVDF膜與稀釋過的一抗4 ℃雜交過夜，用 TBST 洗膜3次，與二抗4 ℃反應(yīng)2 h，再次用TBST洗膜3次，加 ECL顯色，然后置儀器暗盒中成像，最后經(jīng)凝膠自動分析成像系統(tǒng)與ImageJ 圖像分析軟件對圖印跡區(qū)帶定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 振動運(yùn)動對2型糖尿病大鼠空腹血糖影響

與正常組(4.38±0.097)比較，模型組大鼠(19.4±0.913)空腹血糖明顯升高，振動運(yùn)動8 w后，振動運(yùn)動組血糖均下降，高頻率振動組(15.7±2.79)和中頻振動組(16.6±1.72)空腹血糖下降明顯，說明振動運(yùn)動能夠降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖，見圖1。

圖1 不同運(yùn)動時(shí)間大鼠血糖的變化

2.2 振動運(yùn)動對2型糖尿病大鼠體重、TG、TC、LDL-C、HDL-C的影響

與正常組比較，模型組TG、TC、LDL-C均升高(P<0.05)，HDL-C下降(P<0.05)；振動運(yùn)動8 w后與模型組比較，高頻振動組和中頻振動運(yùn)動組大鼠TG、TC、LDL-C均降低，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但高頻振動運(yùn)動組降低更加明顯。低頻振動運(yùn)動組TG、TC、LDL-C檢測結(jié)果與模型組比較同樣降低但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與模型組比較高頻率振動組和中頻振動運(yùn)動組大鼠HDL-C升高，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高頻振動運(yùn)動組顯著升高，低頻運(yùn)動組與模型組比較HDL-C升高，結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；2型糖尿病模型大鼠8 w后明顯消瘦，出現(xiàn)典型的“三多一少”癥狀，與正常對照組比較體重明顯下降(P<0.05)，各振動運(yùn)動組與模型組比較體重明顯增加(P<0.05)，見表1。

2.3 振動運(yùn)動對2型糖尿病大鼠IL-6、TNF-α的影響

與正常對照組比較，8 w后模型組IL-6、TNF-α均升高(P<0.05)，說明在2型糖尿病發(fā)展過程中存在炎癥損傷。振動運(yùn)動8 w后，與模型組比較，高頻振動組和中頻振動組IL-6、TNF-α均降低，結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高頻振動組明顯改善2型糖尿病的炎癥損傷。低頻振動組與模型組比較IL-6、TNF-α均降低，結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2。

表1 振動運(yùn)動對體重、TG、TC、LDL-C、HDL-C的影響

表2 振動運(yùn)動對IL-6、TNF-α的影響

2.4 振動運(yùn)動對2型糖尿病大鼠SOD 、MAD、的影響

與正常對照組比較，8 w后2型糖尿病模型組MAD升高明顯(P<0.05)，SOD下降明顯(P<0.05)，說明2型糖尿病進(jìn)展過程中出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)。振動運(yùn)動8 w后，與模型組比較，高頻振動組和中頻振動組大鼠MAD降低，SOD升高，說明高頻振動能夠降低2型糖尿病的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕對骨骼肌的損傷。結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低頻振動組MAD、SOD沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表3。

2.5 振動運(yùn)動對2型糖尿病大鼠骨骼肌的影響

正常組骨骼肌肌纖維排列正常，肌細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核均位于細(xì)胞邊緣，肌纖維周期性橫紋排列規(guī)律；2型糖尿病模型組大鼠骨骼肌部分肌纖維變形彎曲，肌細(xì)胞排列疏松，肌細(xì)胞核溶解、固縮；高頻率振動組大鼠骨骼肌細(xì)胞排列較為緊密，肌纖維周期性橫紋排列較為規(guī)律，見圖2。

表3 振動運(yùn)動對2型糖尿病大鼠SOD、MAD的影響

圖2 振動運(yùn)動對2型糖尿病大鼠骨骼肌的影響

2.6 免疫印跡結(jié)果

Western blot法結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠骨骼肌FOXO1、PDK4蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，GLUT4蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)；8 w振動運(yùn)動結(jié)束后，與模型組比較，高頻振動組和中頻振動組大鼠FOXO1、PDK4蛋白表達(dá)均降低，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中以高頻振動組下降顯著，在振動運(yùn)動組GLUT4表達(dá)升高，高頻振動組和中頻振動組結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中高頻振動組升高明顯，見圖3。

A：正常組；B：L糖尿病模型組；C：高頻率振動運(yùn)動組；D：中頻率振動運(yùn)動組；E：低頻率振動運(yùn)動組。*與正常組比較(P<0.05)；#與模型組比較(P<0.05)

3 討 論

糖尿病是內(nèi)分泌代謝性疾病，以血糖升高為主要特征，后期可產(chǎn)生眼、腎、神經(jīng)、心臟和血管等多系統(tǒng)損害。鑒于糖尿病并發(fā)癥對機(jī)體的嚴(yán)重?fù)p害，糖尿病的治療應(yīng)在早期進(jìn)行干預(yù)。在糖尿病的病程中骨骼肌功能的損害受到越來越多的關(guān)注。振動運(yùn)動是一種通過機(jī)械振動引起直立者下肢骨骼肌振動的運(yùn)動方式。其原理是在振動下，每個(gè)肌肉細(xì)胞被激活，進(jìn)行持續(xù)的收縮；整個(gè)肌肉收縮更快，使動作變得更靈敏；振動運(yùn)動針對提高下肢的力量、耐力更為有效。

本研究采用了為期8 w的振動運(yùn)動干預(yù)方法，使大鼠保持直立，下肢直接接觸振動臺表面實(shí)現(xiàn)全身振動。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較模型組大鼠體重下降，逐漸消瘦，精神萎靡，糖脂代謝紊亂嚴(yán)重；振動運(yùn)動組大鼠體重降低較小，糖脂代謝紊亂改善。與模型組相比，高頻率和中頻率振動組能夠顯著降低血糖和血脂，低頻率振動組則無明顯效果。

2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制與慢性炎癥和免疫系統(tǒng)的激活相關(guān)聯(lián)[9]，脂肪組織、肝臟、肌肉和胰腺本身就是2型糖尿病的炎癥部位，容易產(chǎn)生大量促炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6等，并有巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的浸潤，免疫細(xì)胞群從對抗炎癥向促進(jìn)炎癥發(fā)展轉(zhuǎn)變?？寡庄煼ㄔ?型糖尿病的預(yù)防和治療中占有一席之地。本研究結(jié)果顯示高頻和中頻振動運(yùn)動后血清中的TNF-α、IL- 6明顯下降，說明這種運(yùn)動方式能夠降低2型糖尿病大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

大量的研究結(jié)果表明2型糖尿病的發(fā)展與機(jī)體的氧化應(yīng)激相關(guān)[10-11]。超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化金屬酶，它能夠通過催化作用使超氧陰離子自由基歧化清除，能夠有效的調(diào)節(jié)機(jī)體氧化和抗氧化的平衡。MDA為過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，能夠直接反應(yīng)血漿中氧自由基量的變化。因此SOD 和 MAD 的含量可以反映機(jī)體氧化應(yīng)激的強(qiáng)烈程度。本研究結(jié)果表明，在模型組大鼠血清中 MDA含量升高，SOD活性下降，反映出在2型糖尿病發(fā)展時(shí)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[12]。高頻和中頻振動運(yùn)動后，SOD活性升高，MDA的含量明顯下降。說明振動運(yùn)動能夠緩解骨骼肌的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

FOXO1是叉頭框O類蛋白家族一類重要的轉(zhuǎn)錄因子[13]。FOXO1廣泛存在真核生物中，其活性受到基因表達(dá)水平、蛋白質(zhì)之間的相互作用、翻譯后的修飾等多方面的調(diào)控[14]。大量研究表明 FOXO1在2型糖尿病的胰島素抵抗、糖脂代謝等過程中起到重要作用[15]。PDK4是 FOXO1的下游靶基因，能夠調(diào)控糖酵解和糖異生途徑。2型糖尿病狀態(tài)骨骼肌中 FOXO1、PDK4蛋白表達(dá)均增加，過表達(dá)的后果是葡萄糖氧化受到限制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示振動運(yùn)動能夠降低FOXO1、PDK4蛋白表達(dá)，緩解骨骼肌的病理損傷。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究重點(diǎn)考察振動運(yùn)動對2型糖尿病大鼠骨骼肌的影響，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看高頻振動運(yùn)動能夠降低大鼠的空腹血糖，改善高血脂狀態(tài)，減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)和骨骼肌的氧化應(yīng)激，降低FOXO1、PDK4蛋白表達(dá)，延緩2型糖尿病骨骼肌的損傷。從而為2型糖尿病臨床預(yù)防與治療提供理論依據(jù)。