海南五指山豬VRTN基因的檢測分析

晁 哲，邢漫萍，黃麗麗，孫瑞萍，劉海隆，王 峰

（1.海南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，海南 ?？?571100；2.海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室，海南 ?？?571100）

哺乳動物的脊椎分為頸椎、胸椎、腰椎、薦椎和尾椎共5個部分，人的脊椎數(shù)目和肋骨數(shù)目是固定的，豬、牛、羊等家畜的多脊椎和多肋骨現(xiàn)象比較常見[1]。豬的脊椎數(shù)變異主要發(fā)生在胸椎和腰椎，頸椎、薦椎和尾椎數(shù)目相對固定。中國地方豬種的胸腰椎總數(shù)一般為19～20根，西方商業(yè)豬種的胸腰椎總數(shù)為21～23根[2]。脊椎數(shù)是影響豬生產(chǎn)性能的重要因素，與其相關的性狀主要有體長、胴體長、肋骨數(shù)和產(chǎn)肉量等。對于肉用商品豬，增加脊椎數(shù)有利于提高產(chǎn)肉量、擴大養(yǎng)殖經(jīng)濟效益；對于實驗動物小型豬，減少脊椎數(shù)有利于降低體重體尺、提升試驗操作的便利性。因此，開展豬多脊椎遺傳機理研究，把脊椎數(shù)作為主要的選育指標對于我國地方豬保護與開發(fā)利用具有重要意義。

椎骨發(fā)育相關基因（vertebrate development associated, VRTN）是哺乳動物脊椎生長發(fā)育的關鍵基因之一[3]。豬VRTN基因位于第7號染色體上，包含2個外顯子和1個內(nèi)含子，在其內(nèi)含子中存在一個291 bp的插入突變，該突變已被證實與豬胸椎數(shù)、胴體長、肋骨數(shù)等多個性狀表型變異相關[4-5]。本研究一方面通過基因測序鑒定五指山豬VRTN基因的變異情況，另一方面通過PCR擴增檢測五指山豬VRTN基因中是否存在291 bp的插入突變，為五指山豬肉用品系和實驗動物品系的選育提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2021年9月15日至11月15日在海南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所進行。

1.2 試驗材料

87頭五指山豬和7頭大白豬來自海南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所永發(fā)科研基地，采集耳組織后利用基因組提取試劑盒提取DNA，-20 ℃保存。

1.3 引物合成

根據(jù)NCBI中提供的豬VRTN基因組序列（Gene ID: 100157734），使用Primer Premier 5.0軟件設計5對引物擴增五指山豬和大白豬的VRTN基因序列，通過序列比對尋找基因中的SNP位點；VRTN基因內(nèi)含子中插入突變（插入片段291 bp左右）的檢測引物參照Yang等[4]發(fā)表的文章，引物信息詳見表1。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 PCR擴增

PCR反應體系為25 μL：其中模板DNA 1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，滅菌去離子水9.5 μL。PCR反應程序為：94 ℃變性4 min；94 ℃變性40 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸50～90 s（由片段長度決定），共36個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.5 電泳檢測

通過2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測。

2 結果與分析

2.1 豬VRTN基因序列分析

使用5對特異性引物擴增豬VRTN基因后，獲得5個VRTN基因擴增片段，長度分別為631、1 122、1 251、773和1 136 bp（圖1），擴增片段包含VRTN基因全部外顯子和部分內(nèi)含子，擴增后的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。通過比對五指山豬和大白豬的VRTN基因序列，在該基因第2外顯子中共發(fā)現(xiàn)10個單堿基突變位點（表2），其中+2 445處的A/G突變位于3′非翻譯區(qū)、其它9個突變位于編碼區(qū)。+1 331處的A/G突變、+1 730處的A/G突變和+1 769處的C/T突變屬于錯義突變，其它6個編碼區(qū)的突變均是同義突變。

圖1 豬VRTN基因PCR擴增片段電泳結果

表2 五指山豬與大白豬VRTN基因序列比對結果

2.2 五指山豬VRTN基因內(nèi)含子291 bp插入突變檢測

使用VRTN-F/VRTN-R引物擴增VRTN基因目的片段，不含291 bp插入突變的純合子擴增條帶為120 bp，含有291 bp插入突變的純合子擴增條帶為411 bp，含有291 bp插入突變的雜合子擴增條帶為120 bp和411 bp。在檢測的87頭五指山豬中，85頭不含291 bp插入突變，2頭是有291 bp 插入突變的雜合子，未發(fā)現(xiàn)291 bp插入突變的純合子（圖2）。

圖2 五指山豬VRTN基因插入突變電泳檢測結果

3 討論

五指山豬是中國特有的小型豬種，是重要的產(chǎn)肉動物和醫(yī)學實驗動物，在生產(chǎn)和科研上都具有重要價值[6]。五指山豬的生長發(fā)育與大白豬等現(xiàn)代家豬有較大差異，對照明顯，且表型獨特。主要表現(xiàn)在：①五指山豬的體型與現(xiàn)代家豬相反，前軀寬大（種公豬更明顯），后軀較小，后腿比例（后腿重量占胴體重量的百分比）明顯低于現(xiàn)代家豬；②五指山豬的體重輕，成年豬（按2年計算）體重50～75 kg，遠低于現(xiàn)代家豬。③五指山豬的飼料轉(zhuǎn)化率低，料重比超過5，生長發(fā)育慢于現(xiàn)代家豬。因此，五指山豬是研究豬生長發(fā)育機制的理想實驗動物。

脊椎數(shù)目影響豬體型生長發(fā)育，屬于高遺傳力性狀。Mikawa等[7]使用大白豬等多個豬資源群體為參考，在第1號和第7號染色體上定位到2個影響豬脊椎數(shù)目的數(shù)量性狀位點（QTL, quantitative trait loci），進一步精細定位發(fā)現(xiàn)1號染色體上的NR6A1基因和7號染色體上的VRTN基因都是影響豬脊椎數(shù)變異的重要候選基因。由于NR6A1基因的有利等位基因在西方商業(yè)群體中經(jīng)過高度人工選擇已經(jīng)固定，所以VRTN基因受到更多的關注[8]。隨著研究的深入，豬VRTN基因內(nèi)含子中的1個插入突變（插入片段291 bp左右）被發(fā)現(xiàn)與胸腰椎數(shù)變異相關，并逐步在中外多個豬種中得到驗證[9]。在中國地方豬種中，VRTN基因內(nèi)含子中291 bp插入突變比例較低，相反在大白豬、長白豬、杜洛克豬等西方商業(yè)豬種中，該位點插入突變比例很高，這與西方商業(yè)豬種的胸腰椎數(shù)目多、肋骨數(shù)多、體型較長相一致。

我們前期屠宰測定發(fā)現(xiàn)，五指山豬胸椎13～15個、腰椎5～6個、肋骨數(shù)為14～15根，均低于大白豬等多數(shù)中外豬種。結合本次檢測結果，絕大部分五指山豬的VRTN基因內(nèi)含子中都不含有291 bp插入突變，進一步驗證該插入突變對脊椎數(shù)變異存在影響。從五指山豬與大白豬VRTN基因中10處突變位點的序列比較結果可以看出，大白豬VRTN基因純合度較高，10處突變位點中有5處是單一基因型，相反，五指山豬中的這10處突變位點的基因型均呈現(xiàn)多態(tài)或偏態(tài)。值得注意的是，五指山豬中有3個錯義突變，+1 331處的A/G突變導致天冬酰胺變?yōu)榻z氨酸、+1 730處的A/G突變導致天冬氨酸變?yōu)楦拾彼帷?1 769處的C/T突變導致蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼?，這3個錯義突變是否是五指山豬特有的還需進一步驗證。

綜上所述，可以通過對VRTN基因型的選擇增加或減少胸椎數(shù)量，達到增加或降低體重體尺的目標，在五指山豬肉用開發(fā)或?qū)嶒瀯游锱嘤?，VRTN基因可以作為一種有效的分子標記，對脊椎數(shù)和體長相關性狀的選育有重要的應用價值。

4 結論

五指山豬外顯子中存在10處堿基突變位點，其中9個位于編碼區(qū)、1個位于3′非翻譯區(qū)，突變位點中有3個錯義突變，分別是+1 331處的A/G突變、+1 730處的A/G突變和+1 769處的C/T突變；此外，五指山豬VRTN基因內(nèi)含子中含有291 bp左右的插入突變，但頻率極低。