我國(guó)野生燕山葡萄VyUSP1基因抗逆功能的初步驗(yàn)證

高換超 許雯雯 井朋偉 程珊珊 侯小進(jìn) 李桂榮

摘要：研究我國(guó)野生葡萄燕山葡萄（Vitis yeshanesis ‘Yanshan’）VyUSP1基因在轉(zhuǎn)基因煙草不同逆境下的表達(dá)情況，選擇從供試材料中克隆所獲得的VyUSP1基因，利用重組法構(gòu)建其載體，并用農(nóng)桿菌介質(zhì)為導(dǎo)體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因煙草植株，獲得USP轉(zhuǎn)基因煙草植株，然后對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行不同逆境處理，并對(duì)該基因進(jìn)行初步的功能研究。結(jié)果表明，在不同的逆境條件下，USP轉(zhuǎn)基因煙草均具有一定的抗干旱能力，但是不具備抗寒能力。較高濃度NaCl、甘露醇、PEG-6000以及低溫處理會(huì)抑制轉(zhuǎn)基因煙草種子的萌發(fā)。而在不同濃度NaCl、甘露醇處理下，轉(zhuǎn)基因煙草植株幼苗均比野生型（WT）植株幼苗的表現(xiàn)要好;不同濃度PEG-6000處理對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草幼苗生長(zhǎng)的影響并不明顯;但在低溫處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因煙草植株幼苗全部死亡。植物在受到外界脅迫時(shí)VyUSP1基因的表達(dá)會(huì)上調(diào)，蛋白活性被激活之后，有助于提高植物的抗逆性，增強(qiáng)其環(huán)境的適應(yīng)性，因此USP對(duì)逆境脅迫存在一定的抗性。

關(guān)鍵詞：燕山葡萄;VyUSP1基因;轉(zhuǎn)基因煙草;逆境脅迫;功能驗(yàn)證

中圖分類號(hào)：S663.101 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）10-0159-07

普遍脅迫蛋白（universal stress protein，USP）是一種普遍存在于植物中的抗逆性相關(guān)蛋白，所有蛋白質(zhì)至少含有1個(gè)USP結(jié)構(gòu)域和其他催化基序，在特定的組織、器官和發(fā)育階段或在不同的脅迫條件下差異表達(dá)[1-2]。USP屬于自磷酸化絲氨酸和蘇氨酸的磷酸蛋白，可作為三磷酸鳥苷（GTP）和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的磷酸供體。

目前，在植物逆境分子生理研究中，都有克隆到USP基因的報(bào)道，在水稻、棉花、擬南芥等全基因組測(cè)序的情況下，很多物種中都發(fā)現(xiàn)并克隆到了USP基因[3-8]。USP在水稻中至少由10個(gè)基因編碼，在擬南芥中由17個(gè)基因編碼，并且都位于第5條染色體上。在亞細(xì)胞水平上，USP基因被定位存在于細(xì)胞質(zhì)中，能夠參與大量的脅迫應(yīng)答反應(yīng)[4-5]。Chou等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞受到外界環(huán)境脅迫時(shí)，該基因的表達(dá)會(huì)明顯上調(diào)，蛋白活性被激活，有助于提高其抗逆性，增強(qiáng)其適應(yīng)性[6-7]。Udawat等研究發(fā)現(xiàn)，USP在海蓬子（Salicornia brachiata）耐鹽脅迫中起著至關(guān)重要的作用;SbUSP基因主要通過(guò)清除轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞內(nèi)的活性氧，顯著提高了煙草的耐鹽性[8]。在大豆植物中，黃姍等將克隆得到的大豆GmUSP1基因?qū)ζ溥M(jìn)行不同濃度的NaCl、脫落酸（ABA）、聚乙二醇（PEG）6000脅迫處理，分析發(fā)現(xiàn)耐鹽品種和感鹽品種對(duì)脅迫誘導(dǎo)響應(yīng)時(shí)間和表達(dá)量存在差異，推測(cè)該基因可能參與逆境脅迫的應(yīng)答調(diào)控[9]。Loukehaich從番茄基因組中克隆SlUSP1基因，通過(guò)表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)該基因在植物中具有組織特異性，在鹽、高低溫、干旱及ABA逆境條件下候選基因被誘導(dǎo)[10]。趙莘對(duì)葡萄VpUSP基因的研究表明，該基因在與白粉病病菌互作過(guò)程中具有表達(dá)活性[11]。

我國(guó)是葡萄屬植物的重要起源地之一，具有豐富的野生葡萄屬種質(zhì)資源，對(duì)野生葡萄資源抗逆機(jī)制的研究有重要意義，但關(guān)于葡萄USP基因在抗逆性方面的研究較少。本研究以我國(guó)野生燕山葡萄（Vitis yeshanensis ‘Yanshan’）為材料，克隆獲得VyUSP1基因，轉(zhuǎn)基因獲得USP煙草植株，然后對(duì)轉(zhuǎn)VyUSP1基因煙草植株進(jìn)行不同逆境處理，對(duì)該基因抗逆功能開展研究，有助于探討燕山葡萄中VyUSP1基因的功能，以期為燕山葡萄資源的利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為中國(guó)野生燕山葡萄、本氏煙草（Nicotiana benthamiana）。

試驗(yàn)地點(diǎn)為河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室;試驗(yàn)時(shí)間為2020年3—12月。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 燕山葡萄VyUSP1基因在煙草中的功能研究

1.2.1.1 構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-VyUSP1，將其導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101。

（1）步驟1：VyUSP1基因的克隆。

總RNA的提取。采用Trizol方法提取葡萄葉片總RNA;取RNA 1 μg，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，利用核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)其純度及濃度。

相關(guān)基因片段的擴(kuò)增?；驍U(kuò)增體系體積為50 μL：分別加入2 μL模板、引物和dNTP;0.4 μL LA酶;5 μL 10×LA Buffer，最后加入ddH2O補(bǔ)齊50 μL。PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性 30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，變性至延伸步驟循環(huán)30次;72 ℃再次延伸10 min，16 ℃保持10 min，4 ℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。連接pMD18-T體系總體積為10 μL：擴(kuò)增產(chǎn)物7.5 μL、pMD18-T 0.5 μL、10×T4 ligase Buffer 1 μL、T4 ligase 1 μL。需16 ℃連接2～5 h。轉(zhuǎn)化流程：大腸桿菌DH5α感受態(tài)放在冰上4～5 min使其完全溶解之后將連接pMD18-T的連接液加入到感受態(tài)管中，靜置30 min，42 ℃水浴2 min，取出后立即放冰上2 min。在無(wú)菌操作臺(tái)中向感受態(tài)管中加入400 μL液體LB培養(yǎng)基，標(biāo)記封口后放于37 ℃搖床上，160～200 r/min振蕩1 h。取出后12 000 r/min離心2 min，去除部分上清液，剩余菌液吸打均勻，涂在LB固體培養(yǎng)基上，標(biāo)記封口后在37 ℃條件下倒置培養(yǎng)14 h。

（2）步驟2：構(gòu)建VyUSP1基因表達(dá)載體。

用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SmaⅠ酶切重組載體pBI121-G，分別回收目的片段和表達(dá)載體片段，用ExnaseⅡ 37 ℃連接30 min后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，得到的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取后轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101中即可。酶切連接體系總體積為 40 μL：pB121-G 10 μL、BSA 4 μL、1×T Buffer 4 μL、XbaⅠ 1 μL、SmaⅠ 1 μL、ddH2O補(bǔ)齊至 40 μL。此體系37 ℃連接2 h。酶切連接體系總體積為40 μL：載體片段與擴(kuò)增片段、ExnaseⅡ各0.5 μL、5×CEⅡBuffer 5 μL，ddH2O補(bǔ)齊至40 μL。37 ℃連接30 min。

（3）步驟3：利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤法轉(zhuǎn)化本氏煙草。

轉(zhuǎn)化流程：從無(wú)菌試管苗上分別剪取煙草葉片，切成0.5 cm×0.5 cm的葉塊，MS培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng) 3 d;挑取單菌落，接種于含卡那霉素（Kan） 60 μg/mL、慶大霉素（Gent） 30 μg/mL 的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜;取 200 μL 新鮮菌液接種于20 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，4 ℃、5 000 r/min 離心5 min;收集沉淀，并用MS液體培養(yǎng)基重懸沉淀，并置于28 ℃恒溫?fù)u床，200 r/min培育2 h（D600 nm=0.5）;將預(yù)培養(yǎng)的葉片浸入準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌菌液中培養(yǎng)5 min，取出葉片，置于無(wú)菌濾紙上，除去葉盤表面多余的農(nóng)桿菌菌液;將上述葉盤轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基，25 ℃黑暗條件下共培養(yǎng)2 d;將共培養(yǎng)后的葉片轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.3 mg/L 萘乙酸（NAA）+25 mg/L 潮霉素（HygB）+500 mg/L 羧芐西林（Carb），25 ℃ 培養(yǎng);待芽長(zhǎng)到1.5 cm左右時(shí)，切下轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基MS+0.3 mg/L NAA+25 mg/L HygB+500 mg/L Carb中，進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.2.1.2 種子逆境脅迫處理

用NaCl、PEG-6000、甘露醇溶液和不同溫度處理轉(zhuǎn)基因煙草植株與野生型煙草植株T2種子。NaCl處理：0、150、300 mmol/L NaCl;干旱處理：0、150、300 mmol/L甘露醇;高滲透處理：對(duì)照、15%、30% PEG-6000;低溫處理：4、-10、-20 ℃處理。然后分別在0～15 d統(tǒng)計(jì)種子的發(fā)芽率。發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%。

1.2.1.3 幼苗逆境脅迫處理

用NaCl、PEG-6000、甘露醇溶液和不同溫度處理轉(zhuǎn)基因煙草植株與野生型（WT）煙草植株幼苗。NaCl處理：0、150、300 mmol/L NaCl;干旱處理：0、150、300 mmol/L甘露醇;高滲透處理：對(duì)照、15%、30% PEG-6000;低溫處理：4、-10 ℃處理。統(tǒng)計(jì)存活率，存活率=存活幼苗數(shù)/幼苗總數(shù)×100%。

1.2.2 燕山葡萄VyUSP1啟動(dòng)子功能驗(yàn)證 （1）構(gòu)建燕山葡萄VyUSP1基因啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體（所用載體為pBI121）。（2）利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草。（3）轉(zhuǎn)基因煙草植株幼苗的組織器官表達(dá)分析及對(duì)不同脅迫的響應(yīng);對(duì)根、莖、葉進(jìn)行β葡萄糖苷酸酶（GUS）染色：幼苗分別用150 mmol/L NaCl、15% PEG-6000、150 mmol/L甘露醇進(jìn)行GUS染色。（4）用GUS染色法驗(yàn)證轉(zhuǎn)VyUSP1基因煙草植株成苗對(duì)滲透脅迫的響應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 USP啟動(dòng)子GUS染色

不同濃度NaCl處理的轉(zhuǎn)基因煙草2、4、8、12、24 h 5個(gè)時(shí)間段中2、8、24 h均被染色，而WT幼苗均無(wú)染色表現(xiàn);轉(zhuǎn)基因煙草植株在甘露醇和PEG-6000不同濃度處理中的2、8 h條件下，觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株葉片均被染色;在4 ℃處理中轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片在2、4、8、12、24 h 5個(gè)時(shí)間段的染色情況與WT煙草幼苗的染色情況均無(wú)明顯變化。根據(jù)以上情況綜合分析表明，在NaCl處理中轉(zhuǎn)基因植株葉片的染色情況表現(xiàn)比較明顯，而其他處理中轉(zhuǎn)基因植株葉片染色情況相對(duì)微弱。

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草種子在不同逆境處理下的發(fā)芽率

2.2.1 不同濃度NaCl處理對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草種子發(fā)芽率的影響 由圖1、表1可以看出，種子播種在添加不同濃度NaCl的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)0～15 d后，未添加NaCl處理的轉(zhuǎn)基因煙草種子和WT種子發(fā)芽率均為100.0%。150 mmol/L NaCl處理3 d后的轉(zhuǎn)基因煙草種子發(fā)芽率達(dá)到100%，處理7 d后的轉(zhuǎn)基因煙草種子發(fā)芽率達(dá)到41%，處理15 d后的轉(zhuǎn)基因煙草種子發(fā)芽率為33.3%。而300 mmol/L NaCl處理后的轉(zhuǎn)基因煙草種子發(fā)芽率從3 d到15 d變化幅度較大，從20.0%降到了0。綜上所述，轉(zhuǎn)VyUSP1基因煙草種子在150 mmol/L NaCl處理下，時(shí)間越長(zhǎng)發(fā)芽率越低;隨著處理的NaCl濃度升高，轉(zhuǎn)VyUSP1基因煙草種子發(fā)芽率也降低，說(shuō)明鹽脅迫濃度過(guò)高或者時(shí)間過(guò)長(zhǎng)均對(duì)轉(zhuǎn)VyUSP1基因煙草種子發(fā)芽不利。

2.2.2 不同濃度甘露醇處理對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草種子發(fā)芽率的影響

由圖2、表2可以看出，種子播種在添加不同濃度甘露醇的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)0～15 d后，未添加甘露醇處理的轉(zhuǎn)基因煙草種子和WT種子發(fā)芽率均為100%。150 mmol/L甘露醇處理3 d后的轉(zhuǎn)基因煙草種子發(fā)芽率達(dá)到100.0%，處理7 d后達(dá)到95.6%，處理15 d后為62.2%。而 150 mmol/L 甘露醇處理WT種子0～15 d后發(fā)芽率較低。300 mmol/L 甘露醇處理轉(zhuǎn)基因煙草種子0～15 d后發(fā)芽率均低于150 mmol/L處理，說(shuō)明較高甘露醇含量處理會(huì)抑制轉(zhuǎn)基因煙草種子的萌發(fā)。

2.2.3 不同濃度PEG-6000處理對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草種子發(fā)芽率的影響

由表3可以看出，種子播種在添加不同濃度PEG-6000的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)0～15 d后，未添加PEG-6000處理的轉(zhuǎn)基因煙草種子和WT種子發(fā)芽率均為100%。15% PEG-6000處理3 d后的轉(zhuǎn)基因煙草種子發(fā)芽率達(dá)到100%，處理7 d后達(dá)到26.7%，處理15 d后為20.0%。而15% PEG-6000處理WT種子0～15 d后發(fā)芽率較低30% PEG-6000處理轉(zhuǎn)基因煙草種子發(fā)芽率均為0，說(shuō)明較高PEG-6000含量處理會(huì)抑制轉(zhuǎn)基因煙草種子的萌發(fā)。

2.2.4 低溫處理對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草種子發(fā)芽率的影響

由圖3、表4可以看出，種子播種在MS培養(yǎng)基上，低溫培養(yǎng)0～15 d后，未低溫處理的轉(zhuǎn)基因煙草種子和WT種子發(fā)芽率均為100%。-10 ℃處理 3 d 后的轉(zhuǎn)基因煙草種子發(fā)芽率為33.3%，處理7 d后下降為26.7%，處理15 d為0%。而-10 ℃處理WT種子0～15 d后發(fā)芽率均高于轉(zhuǎn)基因煙草種子發(fā)芽率。-20 ℃條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因煙草和WT種子發(fā)芽率均為0，說(shuō)明溫度低會(huì)抑制轉(zhuǎn)基因煙草種子的萌發(fā)。

2.3 不同逆境處理對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草幼苗生長(zhǎng)的影響

2.3.1 不同濃度NaCl處理對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草幼苗生長(zhǎng)的影響

由圖4可以看出，在150 mmol/L NaCl處理下WT植株幼苗和轉(zhuǎn)基因植株幼苗的生長(zhǎng)狀況均出現(xiàn)了走向衰弱的趨勢(shì)，但是轉(zhuǎn)基因植株幼苗的生長(zhǎng)勢(shì)較旺盛，其綜合情況要比WT植株幼苗的好;在300 mmol/L NaCl處理下WT植株幼苗株型矮小，生長(zhǎng)勢(shì)弱且葉片狹小而轉(zhuǎn)基因煙草幼苗在這3個(gè)方面的狀況均優(yōu)于WT幼苗的狀況，但兩者均有繼續(xù)生長(zhǎng)的趨勢(shì)。

2.3.2 不同濃度甘露醇處理對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草幼苗生長(zhǎng)的影響

由圖5可以看出，在150、300 mmol/L甘露醇2個(gè)處理中，轉(zhuǎn)基因煙草植株幼苗的生長(zhǎng)狀況比WT植株幼苗的表現(xiàn)要好。

2.3.3 不同濃度PEG-6000處理對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草幼苗生長(zhǎng)的影響

由圖6可以看出，30% PEG-6000處理轉(zhuǎn)基因煙草植株幼苗和WT植株幼苗均無(wú)生長(zhǎng)跡象，并且在15%濃度處理下兩者差異不明顯。

2.3.4 不同低溫處理對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草幼苗生長(zhǎng)的影響

由圖7可以看出，在4 ℃處理下，轉(zhuǎn)基因煙草幼苗的生長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于WT幼苗，在-10 ℃低溫下，轉(zhuǎn)基因煙草幼苗和WT幼苗全部死亡。

3 討論與結(jié)論

應(yīng)激蛋白是一種普遍存在于植物中的抗性相關(guān)蛋白，一般存在于細(xì)胞質(zhì)中，在植物受到外界脅迫時(shí)表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)植物的抗逆性。葡萄容易受到鹽堿、干旱等逆境危害，危害嚴(yán)重的會(huì)給葡萄生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。發(fā)掘葡萄種質(zhì)的抗逆性基因，提高葡萄新品種的抗逆性是解決此問(wèn)題的有效途徑之一。本試驗(yàn)主要研究了我國(guó)野生葡萄燕山葡萄VyUSP1基因在轉(zhuǎn)基因煙草不同逆境下的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VyUSP1基因比較抗鹽和耐旱。陳瑩等研究發(fā)現(xiàn)，高羊茅（Festuca arundinacea Schreb）逆境脅迫蛋白基因FaUSP的超量表達(dá)可以增強(qiáng)菊苣的抗旱能力，推測(cè)該基因與抗旱性相關(guān)[12]。劉峻玲等研究青杄（Picea wilsonii）PwUSP1基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)在干旱和鹽脅迫條件下，PwUSP1通過(guò)增強(qiáng)植物的活性氧（ROS）清除能力及抑制膜脂氧化損傷來(lái)提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性[13]。本試驗(yàn)研究結(jié)果均與這些研究結(jié)果一致，植物在受到外界逆境刺激后，通過(guò)系列信號(hào)分子調(diào)節(jié)相關(guān)抗逆基因和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而改變自身表觀形態(tài)和生理生化水平來(lái)適應(yīng)逆境[14-15]。在感覺到外部逆境刺激后，植物將外源信號(hào)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)下游信號(hào)通路，包括激活蛋白激酶或磷酸酶，刺激下游靶蛋白，以及植物激素的生物合成，以控制植物的生長(zhǎng)發(fā)育[16-17]。特別是這些復(fù)雜信號(hào)交叉網(wǎng)絡(luò)精確地調(diào)節(jié)了脅迫反應(yīng)基因的表達(dá)，并保護(hù)植物免受外部脅迫[15，18-20]。

本試驗(yàn)以我國(guó)野生燕山葡萄為材料，克隆獲得VyUSP1基因，利用重組法構(gòu)建其載體，并用農(nóng)桿菌介質(zhì)為導(dǎo)體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因煙草植株，獲得USP轉(zhuǎn)基因煙草植株。然后對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行不同逆境處理，探究該基因的抗逆性。研究結(jié)果表明，在不同的逆境條件下，USP轉(zhuǎn)基因煙草均具有一定的抗干旱能力，但是不具備抗寒能力。較高濃度NaCl、甘露醇、PEG-6000以及低溫處理會(huì)抑制轉(zhuǎn)基因煙草種子的萌發(fā)。而在不同濃度NaCl、甘露醇處理下，轉(zhuǎn)基因煙草植株幼苗均比WT植株幼苗的表現(xiàn)要好;不同濃度PEG-6000處理對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草幼苗生長(zhǎng)的影響并不明顯;但在低溫處理的條件下，轉(zhuǎn)基因煙草植株幼苗全部死亡。綜上所述，USP轉(zhuǎn)基因植株對(duì)逆境有一定的抗性，植物在受到外界脅迫時(shí)VyUSP1基因的表達(dá)上調(diào)，蛋白活性被激活，有助于提高植物的抗逆性，增強(qiáng)其環(huán)境適應(yīng)性。

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