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    支氣管敗血波氏桿菌PRN基因CDS區(qū)的生物信息學(xué)分析

    2022-06-12 19:03:30宋吉健王怡滌楊金錢李夢云劉志軍趙戰(zhàn)勤
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年10期
    關(guān)鍵詞:生物信息學(xué)

    宋吉健 王怡滌 楊金錢 李夢云 劉志軍 趙戰(zhàn)勤

    摘要:通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測分析支氣管敗血波氏桿菌PRN基因編碼蛋白功能及其調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果表明,支氣管敗血波氏桿菌PRN基因CDS區(qū)編碼911個氨基酸,分子式為C4 121H6 556N1 250O1 258S11,分子質(zhì)量為13 196,消光系數(shù)為95 800,其理論等電點(diǎn)為9.64,不穩(wěn)定系數(shù)為36.24,PRN蛋白的理化性質(zhì)穩(wěn)定;PRN蛋白有多個磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn);信號肽預(yù)測PRN蛋白有1個信號肽,信號肽位置在1~34;PRN蛋白為親水性蛋白,存在1個跨膜結(jié)構(gòu);預(yù)測二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲構(gòu)成,占39.08%,β-折疊占23.93%,α-螺旋占23.30%,三級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲和β-折疊構(gòu)成。上述結(jié)果提示,該蛋白具有重要生物學(xué)意義,可為進(jìn)一步開發(fā)支氣管敗血波氏桿菌亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:支氣管敗血波氏桿菌;PRN;CDS區(qū);生物信息學(xué)

    中圖分類號:S855.1+2 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號:1002-1302(2022)10-0052-06

    支氣管敗血波氏桿菌是一種引起呼吸道感染的革蘭氏陰性細(xì)菌,它是多種哺乳動物的天然病原體[1]。波氏桿菌為波氏桿菌屬,波氏桿菌屬目前包括16個已命名的菌種:百日咳波氏桿菌(Bordetella pertussis)、副百日咳波氏桿菌(B. parapertussis)、支氣管敗血波氏桿菌(B. bronchiseptica)、禽波氏桿菌(B. avium)和其余菌種,后幾種由于發(fā)現(xiàn)較晚,所以研究相對較少[2]。目前,研究較多的主要為前3種,與人類和其他哺乳動物的呼吸道感染有關(guān),因而稱為“經(jīng)典波氏桿菌”[3-4]。近年來,大量研究發(fā)現(xiàn)波氏桿菌在世界范圍內(nèi)的豬、兔、犬及貓中廣泛存在,協(xié)同感染非常嚴(yán)重,給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。目前,研究者們通過多種方法運(yùn)用基因技術(shù),研發(fā)新型的亞單位疫苗,但大多還未大批量投入生產(chǎn)。

    支氣管敗血波氏桿菌pertactin(PRN)是一種外膜蛋白,從細(xì)菌表面突起的長線型蛋白非常適合促進(jìn)細(xì)胞間的黏附,由92 ku PRN前體蛋白分解產(chǎn)生,表觀分子量在支氣管敗血桿菌中為68 ku,在百日咳桿菌中為69 ku,在副百日咳桿菌中為70 ku[6]。大量研究表明,缺失PRN的Bb菌株不能引起豬的發(fā)病,且豬群保護(hù)率與PRN為線性關(guān)系,表明PRN作為支氣管敗血波氏桿菌的主要保護(hù)性抗原[7]。因此,本研究通過生物信息學(xué)分析深入研究該基因,以期為進(jìn)一步研發(fā)波氏桿菌新型疫苗的研發(fā)提供參考。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    NCBI數(shù)據(jù)庫公布的支氣管敗血波氏桿菌PRN基因(GenBank No:AJ245927)序列共含911 個氨基酸,序列如下:MNMSLSRIVKAAPLRRTTLAMALGALGAAPAAYADWNNQSIIKAGERQHGIHIKQSDGAGVRTATGTTIKVSGRQAQGVLLENPAAELRFQNGSVTSSGQLFDEGVRRFLGTVTVKAGKLVADHATLANVSDTRDDDGIALYVAGEQAQASIADSTLQGAGGVRVERGANVTVQRSTIVDGGLHIGTLQPLQPEDLPPSRVVLGDTSVTAVPASGAPAAVSVFGANELTVDGGHITGGRAAGVAAMDGAIVHLQRATIRRGDAPAGGAVPGGAVPGGFGPLLDGWYGVDVSDSTVDLAQSIVEAPQLGAAIRAGRGARVTVSGGSLSAPHGNVIETGGGARRFPPPASPLSITLQAGARAQGRALLYRVLPEPVKLTLAGGAQGQGDIVATELPPIPGASSGPLDVALASQARWTGATRAVDSLSIDNATWVMTDNSNVGLRLSDGSVDFQQPEGRFKVLMVDTLGSGLFRMNVFDLGLSDKLVVMRDSGQHRLWVRNSGSEPSNTMLLVQTPRGSTFTLNKDGKVDIGTYRYRLNGNGQWSLVGKPPPKPPQPGPQPGPQPPQPPQPPQPPQRQPEPPQPPGRELSNVNTGGVGLSTLWYESNLSKRLGELRLNPDGGWGRGFQRQQLDNRGRRFDQKVGFELGDHVVGGRWHLGGLGYTRGDRGFTGDGGGHTDSVHVGGYTYINSGFYLDTLRSRLENDFKVGSDGYVKGKYRTHGVGSLEGRRFHDGWFLEPQELVFRVGGGSYRNGLRVRDEGGSSVLGRLGLEVGKRIELGGRQVQPYIKSVLQEFDGGTVRTNGIHRTELRGTRELGLGMLGRGHSLYSYEYSKGPKLMPWTFHGYRYSW。

    1.2 方法

    利用ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測分析PRN蛋白的親水性、等電點(diǎn)、半衰期、穩(wěn)定性等理化性質(zhì),利用Net Phos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)使用YinOYang 1.2 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/)和NetNGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/.)PRN蛋白綜合分析磷酸化和N、O這2種糖基化;利用PSORTb version 3.0.2 (http://www.psort.org/psortb/results.pl)和LocTree3(https://rostlab.org/owiki/index.php/Loctree3)分析PRN的亞細(xì)胞定位和預(yù)測。對PRN蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析使用NCBI的CDD程序(https://www. ncbi. nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi);用TMHMM軟件(http://www. cbs.dtu. dk/services/TMHMM/)和使用SignalIP 5.0(http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)對PRN氨基酸序列進(jìn)行跨膜區(qū)和信號肽預(yù)測分析;利用NPS@中SOPMA(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSAHLP/npsahlp_secpredsopma.html)分析軟件對PRN蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析;PRN蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測在 SWISS-MODEL程序進(jìn)行(https://swissmodel.expasy.org/)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 理化性質(zhì)分析

    利用ExPASy-ProtParam 對PRN蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果表明,PRN 蛋白包含911 個氨基酸,其中,Ala(14.3%)、Gly(14.3%)和Leu(88%)出現(xiàn)頻率較高,帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)(Asp+Glu)有75個,頻率為8.2%;帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)有89個,頻率為9.8%(表1)。PRN蛋白分子式為C4 121H6 556N1 250O1 258S11,分子質(zhì)量為13 196,消光系數(shù)為95 800 L/(mol·cm),其理論等電點(diǎn)(pI)為9.64;其不穩(wěn)定系數(shù)為36.24(<40),屬于穩(wěn)定類蛋白質(zhì);親水性平均系數(shù)(GRAVY)為-0.201,為親水性蛋白。預(yù)測在哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞(體外)中的半衰期為30 h,在酵母(體內(nèi))中的半衰期>20 h,在大腸桿菌(體內(nèi))中的半衰期>10 h。

    2.3 疏水性分析

    利用Protscale中Kyte & Doolittle 對PRN 蛋白的疏水性進(jìn)行預(yù)測(window size=9),由圖1可知,該蛋白最大疏水性區(qū)域為23、875位氨基酸區(qū)域,均為1.989;在589、591位氨基酸區(qū)域為最小疏水區(qū),均為-2.767。平均疏水指數(shù)(GRAVY)為-0.201,即為親水性蛋白。

    2.3 跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽預(yù)測

    利用TMHMM軟件對PRN氨基酸序列進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測分析,跨膜區(qū)位于17~34氨基酸之間,由圖2可知,與使用Protscale中Kyte & Doolittle分析的最大疏水區(qū)域第23位氨基酸的位置相一致。對序列跨膜區(qū)預(yù)測是十分必要的。通常,膜蛋白不能在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá),如果對序列進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測發(fā)現(xiàn)序列中存在跨膜區(qū),則在后續(xù)需要選擇真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá);如果想利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá),需要對跨膜區(qū)序列進(jìn)行刪除。利用SingaIP 41軟件分析發(fā)現(xiàn)有一個信號肽,由圖3可知,信號肽類型為SP(Sec/SPI);信號肽位置為1~34;信號肽序列為MNMSLSRIVKAAPLRRTTLAMALGALGAAPAAYA。通過預(yù)測跨膜區(qū)和信號肽,可進(jìn)行原核表達(dá)時去除其信號肽, 對PRN進(jìn)行克隆表達(dá), 為進(jìn)一步開發(fā)亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

    2.4 PRN蛋白磷酸化、糖基化位點(diǎn)

    利用Net Phos 3.1、YinOYang 1.2 Server和NetNGlyc 1.0 Server蛋白綜合分析磷酸化和糖基化位點(diǎn),由圖4可知,磷酸化位點(diǎn)較多;糖基化分析結(jié)果(圖5)表明,與N-連接的糖基化有6個,在2、38、92、129、170、428,與O-連接的糖基化18個(圖6),在68、72、151、172、207、209、214、221、291、320、322、415、418、506、617、631、902、910,其中,序列位置214和631嚴(yán)重糖基化。

    2.5 PRN亞細(xì)胞定位分析

    利用PSORTb version 3.0.2和LocTree3分析PRN的亞細(xì)胞定位。PRN的亞細(xì)胞定位分?jǐn)?shù)分別為細(xì)胞質(zhì)0.00、細(xì)胞質(zhì)膜0.00、周質(zhì)0.00、外膜1000、細(xì)胞外0.00。定位分?jǐn)?shù)顯示,PRN定位在細(xì)菌的細(xì)胞外膜中,利用LocTree 3分析PRN的亞細(xì)胞定位。由圖7可知,PRN定位在細(xì)胞外膜中,亞細(xì)胞定位分?jǐn)?shù)為0.95,精確度為98%?;谏鲜?種在線軟件的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明,PRN 定位在細(xì)胞外膜中。

    2.6 蛋白結(jié)構(gòu)

    通過NCBI的CDD 程序分析發(fā)現(xiàn),PRN蛋白存在2個保守域結(jié)構(gòu),分別命名為TIGR01414和cd01343,TIGR01414是主要在病原體中發(fā)現(xiàn)并與毒力相關(guān),參與細(xì)胞黏附,在氨基酸458~911間包含1個保守的C端結(jié)構(gòu)域,自動轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域的長度約為 400 個氨基酸,包括富含芳香族氨基酸的 OMP 信號,還是cl36898超家族唯一成員。cd01343位于氨基酸317~559間,是革蘭氏陰性菌 V 型分泌系統(tǒng)的自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。cd01343是超家族cl00185的成員。PRN蛋白由16股平行的β螺旋氨基酸結(jié)構(gòu)組成,呈“V”形橫截面,是迄今為止已知的最大的β螺旋蛋白之一。

    使用SOPMA分析軟件對PRN蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,由圖8可知,PRN蛋白二級結(jié)構(gòu)中主要以α-螺旋、β-折疊、延伸鏈和無規(guī)則卷曲構(gòu)成,分別占23.30%、13.61%、23.93%和39.08%。運(yùn)用SWISS-MODEL軟件完成PRN蛋白三級結(jié)構(gòu)模型的構(gòu)建(圖9)。觀察到較多的無規(guī)則卷曲和α-螺旋,與二級預(yù)測結(jié)果相一致。但GMQE評價模型可靠性得分為0.42,表明該模型可信度一般。

    3 討論

    目前,支氣管敗血波氏桿菌主要在豬、犬、兔等動物群體間感染非常嚴(yán)重,長期以來危害被低估[8]。尤其在豬群中與副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌等協(xié)同感染嚴(yán)重,死亡率很高,給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失[9]。雖然Bb主要是佐劑滅活苗已在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用,但免疫效果普遍較差,豬群對于支氣管敗血波氏桿菌的攜帶十分嚴(yán)重[10]。此外,大量抗生素的使用加劇了細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生[11]。相關(guān)研究表明,使用豬支氣管敗血波氏桿菌某些表面毒力因子及相關(guān)分泌蛋白作為亞單位疫苗,對于豬波氏桿菌病感染具有一定的免疫保護(hù)作用[12]。研究人員發(fā)現(xiàn),除去N端信號肽的PRN基因,在大腸桿菌中實現(xiàn)了各段基因的高效表達(dá)[13]。結(jié)果表明,蛋白片段氨基酸序列保守、表達(dá)量高、純化方便,可作為亞單位疫苗進(jìn)行開發(fā)。本研究通過生物信息學(xué)軟件對PRN分析,它編碼由911個氨基酸組成、理論等電點(diǎn)為9.64的親水性蛋白,根據(jù)結(jié)構(gòu)與生物特性預(yù)測結(jié)果分析,PRN包含2個RⅠ(GGXXP)n和 RⅡ(PQP)n 重復(fù)氨基酸序列,研究發(fā)現(xiàn)RⅠ區(qū)可能與細(xì)菌的黏附功能有關(guān),RⅡ為主要的保護(hù)性抗原表位[14]。PRN還具有逃避宿主細(xì)胞的免疫保護(hù)作用,對巨噬細(xì)胞可能有一定的毒性[15]。

    趙戰(zhàn)勤等曾克隆表達(dá)出PRN及其不同區(qū)域的氨基酸多肽,通過小鼠免疫保護(hù)試驗證明了PRN的N端強(qiáng)于C端,且RⅡ區(qū)域強(qiáng)于RⅠ區(qū)域[16],但其僅在小鼠模型進(jìn)行了免疫保護(hù)試驗,未在豬群進(jìn)一步驗證,無法確定是否對豬也具有較好的免疫保護(hù)性。此外,在設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時會出現(xiàn)擴(kuò)增不出目的條帶的現(xiàn)象,或者克隆出PRN基因片段在測序時也會出現(xiàn)不同的問題,這可能是波氏桿菌基因GC含量過高,尤其PRN基因GC含量高達(dá)716%。有研究發(fā)現(xiàn)在擴(kuò)增PRN基因時加入少量的二甲基亞砜(DMSO)或betaine[17],使其氫鍵斷裂有利于雙鏈解開,因此對該基因還需要進(jìn)一步研究。最近科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)不表達(dá)PRN基因的陰性菌株越來越多,一些重要基因(包括毒力相關(guān)基因或調(diào)節(jié)基因)上的單核苷酸多態(tài)性(SNP)可能幫助機(jī)體在疫苗選擇壓力下存活[15],這也是為什么最近幾年百日咳波氏桿菌、副百日咳波氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌在全球廣泛傳播,從未消退,研發(fā)新型疫苗刻不容緩。其次,在進(jìn)行同源性分析時,發(fā)現(xiàn)禽波氏桿菌(B. avium)基因中沒有PRN基因,這也可以證明禽波氏桿菌與百日咳波氏桿菌、副百日咳波氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌不屬于同一個群。而且發(fā)現(xiàn)支氣管敗血波氏桿菌在一個支上,PRN基因同源性較高,可為研究新型疫苗的研發(fā)提供一個新思路。李洪廣等發(fā)現(xiàn)兔支氣管敗血波氏桿菌缺失PRN基因可以使毒力下降,突變株產(chǎn)生了較好的免疫原性,進(jìn)行減毒活疫苗的研發(fā)也是一種新思路[18]。

    本研究通過對編碼的PRN蛋白進(jìn)行了較全面的生物信息學(xué)分析,預(yù)測分析了該蛋白的氨基酸同源性、理化性質(zhì)、生物學(xué)特性及功能,研究其信號肽和功能域,預(yù)測該蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu),可為進(jìn)一步研究其功能、調(diào)節(jié)機(jī)制及相關(guān)支氣管敗血波氏桿菌疫苗提供借鑒。

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