8種植物類甜蛋白家族基因進化及密碼子特征分析

劉潮 韓利紅 盛巧 陶霧

摘要：類甜蛋白（thaumatin-like proteins，TLP）被歸為病程相關蛋白第5家族，在植物防御和生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用。使用Mega X、CodonW及EMBOSS網(wǎng)站在線軟件，分析8種植物（萊茵衣藻、小立碗蘚、擬南芥、水稻、谷子、高粱、小麥、玉米）類甜蛋白家族進化和密碼子使用偏性。結果表明，植物類甜蛋白主要歸為10個聚類組，其中聚類組Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ中的TLP數(shù)目相對較多;5種禾本科作物TLP家族基因主要以G和C作為第3位密碼子，密碼子具有較強的偏好性，多數(shù)類甜蛋白基因ENC值較小，GC3s值分布較集中;8個最優(yōu)密碼子第3位均為G或C結尾，禾本科植物類甜蛋白家族基因密碼子偏好G/C結尾。本研究分析了8種植物中類甜蛋白家族基因的進化特征及密碼子使用偏性，為該家族基因的分子進化以及轉(zhuǎn)基因應用提供了理論依據(jù)。

關鍵詞：類甜蛋白;系統(tǒng)進化;密碼子偏性;最優(yōu)密碼子

中圖分類號： S188? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）10-0044-08

類甜蛋白（thaumatin-like proteins，TLP）屬于病程相關蛋白第5（pathogenesis-related protein，PR5）家族，因與產(chǎn)自西非的翅果竹芋（Thaumatococcus danielli）的甜蛋白（thaumatin）氨基酸序列相似度較高而得名。TLP廣泛存在于多種動植物和微生物中[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，TLP具有抗真菌和滲透調(diào)節(jié)活性等，或作為其他抗真菌蛋白的激發(fā)子[4-7]，在植物的生長發(fā)育和抗逆過程中發(fā)揮重要作用[8-10]。不同物種基因組中密碼子的使用頻率不同，這種密碼子非均衡使用的普遍現(xiàn)象稱為密碼子使用偏性（codon usage bias）[11]。同義密碼子的選擇性使用提高了翻譯的準確性和效率，生活在相似環(huán)境條件下的物種具有相似的密碼子偏好，能夠生活在多種生境中的生物，翻譯效率降低，密碼子使用偏性對基因的表達起重要的調(diào)節(jié)作用[12]。密碼子使用偏性分析對于基因表達預測、異源表達最適宿主選擇和密碼子優(yōu)化均具有重要意義[13]。不同植物物種編碼TLP數(shù)量有很大差異，如胡蘿卜（Daucus carota）和黃瓜（Cucumis sativus）等蔬菜中有約30個，水稻（Oryza sativa）和谷子（Setaria italica）等作物中多于50個[14]。植物基因組中TLP基因數(shù)量除了與基因組大小有關外，植物在進化過程中所處的環(huán)境也對TLP數(shù)量有重要影響，當植物面臨較大的環(huán)境脅迫壓力時，對抗環(huán)境脅迫的相關基因通過基因間和基因內(nèi)重組，導致了基因數(shù)目的增加，從而使植物發(fā)生了快速的適應性進化[15]，如RLK家族近期的擴張與植物防御/抗病基因有關[16]。密碼子偏性主要受突變壓力[17]和自然選擇壓力影響[9]。突變—選擇—漂變平衡假說認為，突變的發(fā)生具有方向性，突變—選擇平衡導致持續(xù)進化的種群具有穩(wěn)態(tài)適應性突變[18]。通過基因工程等手段對基因密碼子進行有目的的改造，能大大提高外源基因在宿主中的表達水平[19]，因此密碼子偏性的研究對基因工程具有重要的應用價值。

隨著現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展，人類已進入了后基因組時代，大量植物基因組數(shù)據(jù)的公布為研究植物基因家族進化提供了可能。植物TLP家族在植物的生長發(fā)育和抵御環(huán)境脅迫中發(fā)揮了重要作用，然而，目前對不同物種中該家族基因的進化和密碼子偏性研究鮮見報道。本研究從蛋白氨基酸和基因的堿基組成出發(fā)，從不同類群的物種中選擇萊茵衣藻、小立碗蘚、擬南芥、玉米、水稻、小麥、高粱和谷子進行TLP家族進化、編碼序列（coding sequence，CDS）密碼子的組成及使用偏性分析，為TLP家族基因的開發(fā)利用和優(yōu)良抗性作物品種的培育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 基因序列獲取與鑒定

2021年1月通過Superfamily網(wǎng)站（http：//supfam.org/SUPERFAMILY）和基因組序列數(shù)據(jù)庫（http：//plants.ensembl.org/index.html）以thaumatin為關鍵詞搜索數(shù)據(jù)庫，獲得并下載萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、小立碗蘚（Physcomitrella patens）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（O. sativa）、谷子（S. italica）、高粱（Sorghum bicolor）、小麥（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）中TLP家族蛋白及CDS序列，使用SMART數(shù)據(jù)庫對蛋白功能域進行確認，去掉不含類甜蛋白結構域的序列。

1.2 基因家族進化分析

所有蛋白通過Clustal X比對，應用Mega X構建鄰接（neighbor-joining，NJ）系統(tǒng)發(fā)生樹。NJ進化樹采用泊松校驗，分析步長值為1 000。

1.3 基因同義密碼子偏性分析

1.3.1 密碼子組成和使用特性分析

使用CodonW軟件分析基因CDS密碼子使用偏性，分析參數(shù)：同義密碼子在第3位上相應堿基的出現(xiàn)頻率（A3s、G3s、C3s、T3s）、密碼子適應指數(shù)（codon adaptation index，CAI）、有效密碼子數(shù)（effective number of codon，ENC）、密碼子第3位的G+C含量（GC3s）和基因的G+C含量（GC）等。通過EMBOSS在線軟件對TLP家族基因同義密碼子相對使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）進行分析。使用統(tǒng)計軟件SPSS 23.0對密碼子組成和使用偏性各參數(shù)進行相關性分析。

1.3.2 ENC-plot繪圖分析

分別以GC3s和ENC為橫縱坐標，繪制ENC-plot，檢測堿基組成對密碼子偏性的影響[20]。圖中曲線表示密碼子偏性僅受堿基影響時的ENC預期值，此時ENC計算公式為ENC=2+GC3s+29/[GC3s2+（1-GC3s）2]，靠近標準曲線表示密碼子偏性主要受堿基突變影響，遠離標準曲線表示密碼子偏性主要受自然選擇影響。

1.3.3 最優(yōu)密碼子確定

選擇ENC值前后各10%作為低表達和高表達基因，分別計算2組基因中TLP基因密碼子的RSCU值。ΔRSCU=高表達組RSCU-低表達組RSCU，當ΔRSCU>0.3，且在高表達組中RSCU>1，在低表達組中RSCU<1，可確定該密碼子為最優(yōu)密碼子（optimal codon）[3，21]。

2 結果與分析

2.1 TLP家族基因數(shù)量分析

通過搜索Superfamily數(shù)據(jù)庫，鑒定到植物TLP蛋白數(shù)量分別為萊茵衣藻1個、小立碗蘚5個、擬南芥24個、水稻41個、谷子47個、高粱46個、小麥138個、玉米47個。植物TLP數(shù)量與基因組大小呈正相關，隨基因組的增大，TLP數(shù)目增加。因小麥為六倍體，其基因組較大，染色體數(shù)目較多，單位Mb染色體上的TLP蛋白較少，只有0.010 3個。雖然擬南芥中總TLP數(shù)目只有24個，但因其基因組相對較小，且染色體只有10條，單位Mb染色體上的TLP蛋白數(shù)量最多，達到0.196 9個。水稻、高粱和谷子中的染色體數(shù)目比較接近，其TLP蛋白數(shù)量也相差不是很大。

2.2 TLP家族進化分析

使用MEGA 5.0軟件通過蛋白序列對8種植物TLP家族成員進行進化分析。參考前人研究[1，15]將植物TLP家族蛋白歸為10個聚類組（圖1）。分析發(fā)現(xiàn)，水稻、谷子、小麥和玉米在全部10個聚類組中均有成員分布，高粱在除聚類組Ⅹ外的聚類組中均有成員分布，擬南芥在聚類組Ⅲ和Ⅹ中沒有成員分布（表1）。研究發(fā)現(xiàn)，各植物TLP在10個聚類組中分布很不均衡，聚類組Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ各組中的TLP數(shù)目相對較多，其中水稻、谷子、高粱、小麥、玉米5種作物聚類組Ⅴ中的成員均明顯較多，說明這些聚類組中的基因出現(xiàn)了特異性的基因擴張。聚類組Ⅴ中的OsTLP基因數(shù)量最多，該組中的一些TLPs能響應病原或環(huán)境脅迫[16]，說明這些基因可能與植物對抗脅迫有關，有待深入研究。

2.3 TLP家族密碼子偏性分析

2.3.1 8種植物TLP家族基因密碼子使用參數(shù)分析

為全面了解植物TLP家族基因密碼子使用性，對8種植物的同義密碼子在第3位上相應堿基的出現(xiàn)頻率、CAI、ENC、GC3s等參數(shù)進行分析（表2）。分析密碼子第3位的核苷酸發(fā)現(xiàn)，小立碗蘚和擬南芥對A、T、C、G 4種核苷酸的使用比例相當，第3位密碼子偏性不是很明顯，但5種禾本科作物種C3s和G3s數(shù)值明顯高于T3s和A3s，主要以C和G作為第3位密碼子， 其中以C作為第3位密碼子的概率比G要高一些。8種植物TLP家族基因GC含量也不相同，擬南芥TLP家族基因GC含量為49.8%，小立碗蘚為53.8%，而5種禾本科作物均不低于66%。各物種中GC3s與GC含量類似，5種禾本科作物中均較高，且均高于82%，水稻中甚至達到88.5%。

CAI用于衡量基因與高表達基因密碼子使用的接近程度，該值越高表示基因表達水平越高，反之，表達水平越低。擬南芥和小立碗蘚TLP家族基因CAI值分別為25.2%和26.3%，萊茵衣藻的TLP家族基因CAI值為33.5%，5種禾本科作物TLP家族基因CAI值均不低于27.4%，高粱TLP家族基因CAI值高達29.6%。ENC值反映基因編碼對密碼子選擇性強弱[18]，ENC值越小表示該基因表達潛力越高，基因?qū)γ艽a子的使用偏性越強[20]。小立碗蘚和擬南芥TLP家族95%的基因ENC值均高于50，說明其TLP家族基因密碼子使用偏性較弱，多數(shù)屬于低表達基因，而水稻、谷子、高粱、小麥和玉米TLP家族95%的基因ENC值均介于33～40之間，平均值介于35～39之間，說明這些TLP基因密碼子使用偏性較強，具有較高的表達潛力，可能在植物生長或抵御逆境過程中發(fā)揮作用。

2.3.2 有效密碼子數(shù)與同義密碼子第3位GC含量關聯(lián)分析

GC3s分布反映了植物所受的選擇壓力，GC3s分布越分散，代表密碼子使用偏性主要受堿基突變壓力影響，GC3s分布越集中，代表密碼子使用偏性主要受自然選擇壓力影響[3，22]。ENC-GC3s關聯(lián)分析中，基因分布越靠近標準曲線，表示密碼子使用偏性受到較小的自然選擇壓力影響，反之表示基因受到選擇壓力或其他因素的影響越大[23]。萊茵衣藻只有1個TLP基因，其ENC值為37.51，GC3s值為86.3%（圖2），與本研究中其他植物大部分基因集中在同一位置。小立碗蘚有5個TLP基因，其中3個分布位置非常接近標準曲線（圖2），說明在小立碗蘚中TLP基因受自然選擇壓力影響較小。擬南芥基因分布于標準曲線下方，但GC3s分布較廣泛（圖2），說明擬南芥TLP基因受到突變選擇和自然選擇的雙重影響。值得注意的是，水稻、小麥、高粱、谷子、玉米幾種主要作物中大多數(shù)TLP基因ENC值較小，GC3s值分布較集中，且位于標準曲線下方，說明這些物種中TLP基因主要受到自然選擇壓力的影響。

2.3.3 類甜蛋白家族基因同義密碼子相對使用度分析

若RSCU>1，密碼子出現(xiàn)的頻率比其他同義密碼子高，反之，出現(xiàn)頻率低。TLP基因RSCU值分析表明，不同植物物種氨基酸密碼子RSCU值不同，5種單子葉禾本科作物RSCU值一致性較高，TLP家族基因25個RSCU>1的氨基酸密碼子均以G或C結尾，擬南芥作為雙子葉植物的代表與單子葉植物密碼子RSCU值趨勢多數(shù)截然相反（表3）。如編碼丙氨酸的密碼子，擬南芥偏好GCT，而其他7種植物偏好GCG或GCC;編碼半胱氨酸的密碼子，擬南芥偏好TGT，而其他7種植物偏好TGC。

2.3.4 最優(yōu)密碼子分析

通過對高表達和低表達組密碼子RSCU值進行比較，發(fā)現(xiàn)8個最優(yōu)密碼子分別編碼丙氨酸（Ala，GCG）、谷氨酸（Gly，GGG）、組氨酸（His，CAC）、脯胺酸（Pro，CCC和CCG）、精氨酸（Arg，CGG）、 色氨酸（Ser，TCG）、 蘇氨酸（Thr，ACG）（表3）。其中6個密碼子第3位為G，2個密碼子為C，表明所分析的植物，尤其禾本科作物優(yōu)先使用G或C結尾的密碼子。

3 討論

類甜蛋白在植物的發(fā)育和對抗脅迫過程中發(fā)揮作用[7-8，24-25]，該家族基因數(shù)目的多少除了與基因組大小有關外，植物面臨的環(huán)境脅迫壓力往往也影響了基因的擴張[1]。本研究中萊茵衣藻和小立碗蘚編碼了相對更少量的TLP家族基因，其次是小麥和玉米，而小麥的基因組在進化過程中均曾多次發(fā)生染色體加倍現(xiàn)象[26]，玉米很可能是一種異源四倍體起源的生物[27]。生物的生存策略有2種，一種是通過快速增加個體，從而提高下一代的個體數(shù)量，另一種是通過發(fā)展抵抗脅迫的防御系統(tǒng)，提高單個個體的存活概率。植物TLP家族基因在植物的防御反應中發(fā)揮作用，而一些禾本科作物可能通過增加TLP家族基因數(shù)目增強防御能力，提高后代存活概率，因此含有較多的TLP家族基因。

在長期的進化過程中，為了適應環(huán)境和應對脅迫，植物對編碼特定蛋白氨基酸的密碼子使用出現(xiàn)偏性，使用頻率最高的密碼子稱為最優(yōu)密碼子[28]。

8種植物TLP家族基因密碼子使用偏性有很大不同。擬南芥和小立碗蘚TLP家族基因GC含量和GC3s值相對較低，而5種禾本科作物這2類參數(shù)均較高。5種禾本科作物主要以G或C作為第3位密碼子首選。雙子葉植物偏愛A/T結尾的密碼子，單子葉植物偏愛G/C結尾的密碼子[22，29]，較高的GC3s值表示基因表達受DNA甲基化或基因改變影響，加速了基因的進化[30]。本研究結果與前人研究一致，禾本科植物TLP家族基因偏愛GC結尾的密碼子，可能是因為單、雙子葉植物受植物早期進化選擇影響，TLP家族基因密碼子使用偏性具有種屬特異性。禾本科作物基因GC含量和GC3s影響了基因密碼子的偏性，高表達基因偏愛使用G/C結尾的密碼子，是選擇性驅(qū)動了密碼子的偏性[31]。本研究通過ΔRSCU法共鑒定了8個最優(yōu)密碼子，其中6個密碼子以G結尾，2個以C結尾，這可能與8種植物TLP家族基因較高的GC含量有一定關系[32]。但在其他植物的某些基因中也有相反的結果，如在小麥[23]、水稻[33]和玉米[34]中，基因組GC含量較高，最優(yōu)密碼子中富含AT?；蛎艽a子偏性參數(shù)ENC、RSCU和最優(yōu)密碼子分析均表明，5種禾本科作物TLP基因偏好G/C結尾的密碼子。ENC與GC3s關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，小立碗蘚TLP家族基因受正向選擇壓力較小，擬南芥受到突變和正向選擇壓力雙重影響，而5種禾本科植物TLP家族基因密碼子具有較高的GC3s值，并遠離標準曲線，主要受正向選擇壓力影響，進一步說明正向選擇作用在禾本科作物TLP家族基因進化過程中發(fā)揮了顯著作用。由于密碼子偏性對基因的表達有較大影響，因此開展基因異源表達研究時，須要結合密碼子偏性進行設計，否則可能無法獲得準確的表達量信息，甚至影響表達產(chǎn)物的獲得。

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