響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌表面活性素的發(fā)酵工藝

李光月，李雪玲，祁姣姣，朱劍鋒，賴美連，胡文鋒,,

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642；2.生物源生物技術(shù)（深圳）股份有限公司，廣東深圳 518118）

表面活性素（Surfactin）是一種分子量大小約為1.036 kDa的兩親性環(huán)狀脂肽，是由芽孢桿菌屬在對數(shù)生長期和/或穩(wěn)定生長期產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[1]。表面活性素的生物合成途徑主要受表面活性素的生物合成途徑主要受srfA操縱子編碼的非核糖體肽合成酶（NRPS）調(diào)控[2]。表面活性素具有LLDLLDL手性七肽的親水肽鏈的“頭部”，C12-C19（以C13-C15為主）的疏水性β-羥基脂肪酸的“尾部”組成，形成分子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。自1968年Arima等[3]在幾株枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)表面活性素后，經(jīng)過50多年來的研究，學(xué)者們不斷挖掘出表面活性素具有諸多獨特的優(yōu)勢，如能有效地乳化和降低水的表面張力[4]、抗細(xì)菌[5]、抗真菌[6]、抗病毒[7]、抗炎[8]以及抗癌癥[9]等。因此，表面活性素是一種具有應(yīng)用價值的微生物脂肽，在食品、石油、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和制藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。此外，表面活性素并不是一個單體，通常是混合物，具有多種同系物，這是由脂肪酸的不同碳鏈長和肽鏈的氨基酸序列的可變性所導(dǎo)致的。迄今為止，人們已經(jīng)精確地測定了十余種表面活性素同系物[10]。

目前，表面活性素還沒有實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，主要存在兩個問題：產(chǎn)量低和分離純化成本高，而進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化是解決上述問題的主要途徑之一[11]。不少研究通過優(yōu)化發(fā)酵條件，提高菌株產(chǎn)表面活性素的能力。Prado等[12]研究了碳源對Bacillus subtilisICFPC產(chǎn)表面活性素的影響，利用堿性預(yù)處理提取的半纖維素玉米芯液作為碳源，表面活性素產(chǎn)量可達(dá)到3.95 g/L。萎縮芽孢桿菌5-2a以甘露醇是唯一的碳源時，培養(yǎng)上清液的最低表面張力為25.82 mN·m-1[13]。在另一項研究中，銅綠假單胞菌NCIM 5514在以10 g/L的葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)96 h后，表面活性素產(chǎn)量為3.0 g/L[14]。本文以前期篩選獲得的表面活性素高產(chǎn)菌株枯草芽孢桿菌FHYB201030為出發(fā)菌株，通過單因素實驗、Plackett-Burman試驗設(shè)計、最陡爬坡試驗、Box-Behnken試驗設(shè)計優(yōu)化菌株FHYB201030的培養(yǎng)條件和發(fā)酵培養(yǎng)基，為枯草芽孢桿菌FHYB201030工業(yè)化生產(chǎn)表面活性素提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌FHYB201030 由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院應(yīng)用微生物實驗室提供；Surfactin 純度≥98%，Sigma公司；氯化十六烷基吡啶、溴百里酚藍(lán)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等 均為分析純，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB） 牛肉膏3 g、NaCl 5 g、蛋白胨1 g、蒸餾水1 L，pH7.0～7.2，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；SW-CJ-IF超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPH-200恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海世平實驗設(shè)備有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀日本島津公司；COSMOSIL 5C18-AR-II 色譜柱（4.6×250 mm） 日本Nacalai Tesque公司。

1.2 實驗與方法

1.2.1 表面活性素的發(fā)酵工藝 全文優(yōu)化前菌株用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為NB培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速（180 r/min）、培養(yǎng)溫度（37 ℃）、接種量（體積比為3%）、裝液量（體積比為30%）、培養(yǎng)時間（72 h）。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 碳源對表面活性素產(chǎn)量的影響 在NB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別添加不同碳源（淀粉、糊精、甘油、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、山梨醇、玉米粉、蔗糖），終濃度均為20 g/L，基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下發(fā)酵72 h，測其生物量和CPC-BTB數(shù)值，以基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下發(fā)酵的數(shù)值為對照組。

1.2.2.2 氮源對表面活性素產(chǎn)量的影響 在NB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別添加不同氮源（豆粕餅粉、酵母提取物、酪蛋白、棉籽餅粉、尿素、檸檬酸銨、氯化銨和硫酸銨），終濃度均為10 g/L，基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下發(fā)酵72 h，測其生物量和CPC-BTB數(shù)值，以基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下發(fā)酵的數(shù)值為對照組。

1.2.2.3 金屬離子對表面活性素產(chǎn)量的影響 在NB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別添加不同金屬離子（Cu2+、K+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、Mn2+、Zn2+），終濃度均為0.5 mmol/L，基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下發(fā)酵72 h，測其生物量和CPC-BTB數(shù)值，以基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下發(fā)酵的數(shù)值為對照組。

1.2.2.4 氨基酸對表面活性素產(chǎn)量的影響 在NB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別添加不同氨基酸（Asp、Cyc、Glu、Gly、His、Lys、Leu、Phe、Val），終濃度均為1 g/L，基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下發(fā)酵72 h，測其生物量和CPC-BTB數(shù)值，以基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下發(fā)酵的數(shù)值為對照組。

1.2.2.5 裝液量對表面活性素產(chǎn)量的影響 將對數(shù)期的菌液分別接種于不同裝液量（10%、20%、30%、40%、50%）的培養(yǎng)基中，保持其他條件不變，發(fā)酵72 h后測其生物量和CPC-BTB數(shù)值，以基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下發(fā)酵的數(shù)值為對照組。

1.2.2.6 發(fā)酵溫度對表面活性素產(chǎn)量的影響 將對數(shù)期的菌液接種于培養(yǎng)基中，分別在不同發(fā)酵溫度（27、32、37、42、47 ℃）發(fā)酵72 h，保持其他條件不變，測其生物量和CPC-BTB數(shù)值，以基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下發(fā)酵的數(shù)值為對照組。

1.2.2.7 轉(zhuǎn)速對表面活性素產(chǎn)量的影響 將對數(shù)期的菌液接種于培養(yǎng)基中，分別在不同轉(zhuǎn)速（140、160、180、200、220 r/min）的保持其他條件不變，發(fā)酵72 h后測其生物量和CPC-BTB數(shù)值，以基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下發(fā)酵的數(shù)值為對照組。

圖 1 碳源對表面活性素產(chǎn)量的影響Fig.1 Impact of carbon source on the production of surfactin

1.2.3 Plackett-Burman試驗 在單因素結(jié)果的基礎(chǔ)上篩選出對表面活性素產(chǎn)量影響較顯著的因素，使用Design-Expert.V 8.0.6進(jìn)行N=12（10個因素，1個虛擬項）的Plackett-Burman實驗設(shè)計和結(jié)果分析。以CPC-BTB數(shù)值為響應(yīng)值，每個因素取高（+1）、低（-1）兩個水平，保留1個虛擬變量用來評估實驗誤差，每個實驗重復(fù)三次，取平均值作為響應(yīng)值。各因素及水平詳見表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.2.4 最陡爬坡試驗 根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，綜合考慮各因素效應(yīng)正負(fù)和試驗成本來設(shè)計最陡爬坡試驗中各因素的步長和爬坡方向。

1.2.5 響應(yīng)面試驗 根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，以最陡爬坡試驗的最優(yōu)條件為水平中心，使用Design-Expert.V8.0.6進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken試驗設(shè)計（表2）。

1.2.6 模型的驗證 利用響應(yīng)面模型優(yōu)化的最佳條件進(jìn)行發(fā)酵實驗，比較模型預(yù)測值與實驗值，驗證模型的有效性，實驗重復(fù)3次，取平均值，并利用高效液相色譜法測定枯草芽孢桿菌分別在優(yōu)化前和優(yōu)化條件下產(chǎn)生的表面活性素的含量。

1.2.7 分析方法

1.2.7.1 生物量的測定 通過使用SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀，利用比濁法測定枯草芽孢桿菌發(fā)酵液適宜比例稀釋液的OD600 nm值，評價不同條件下枯草芽孢桿菌的生長情況。

1.2.7.2 CPC-BTB比色法 CPC-BTB比色法測定表面活性素的相對含量[15-16]，配制0.2 mmol/L CPC（氯化十六烷基吡啶）和0.2 mmol/L BTB（溴百里酚藍(lán)）后，等體積混合在0.1 mol/L PBS（磷酸緩沖溶液，NaH2PO4/Na2HPO4，pH8.0）中，制備成CPC-BTB溶液。在酶標(biāo)板內(nèi)分別加入25 μL不同濃度表面活性素標(biāo)準(zhǔn)品（50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 μg/mL），待標(biāo)品加完后，用100 μL的排槍快速加入100 μL CPC-BTB溶液/孔，25 ℃下反應(yīng)5 min，使用酶標(biāo)儀測定其OD600。用標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷其產(chǎn)量。

測定表面活性素的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性決定系數(shù)R2=0.98425，具有一定的線性關(guān)系，可作為一種判定表面活性素相對含量的指標(biāo)。

1.2.7.3 高效液相色譜法 發(fā)酵液先經(jīng)離心，然后采用0.22 μm微孔濾膜過濾，最后注入HPLC中進(jìn)行測定，檢測采用紫外檢測器，色譜柱：COSMOSIL 5C18-AR-II（4.6×250 mm，日本Nacalai Tesque公司）；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長：205 nm；流速：0.84 mL/min；溶劑：水（含0.1% TFA）:乙睛（含0.1% TFA）=90:10。

測定表面活性素的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性決定系數(shù)R2=0.9972，相關(guān)性良好，可用此方法測定樣品中表面活性素的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)3次，取平均值。數(shù)據(jù)采用Origin-Pro 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，Design-Expert 8.0.6進(jìn)行Box-Behnken試驗設(shè)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 碳源對表面活性素產(chǎn)量的影響 據(jù)報道，不同碳源不僅會影響菌株所產(chǎn)生的生物表面活性劑的產(chǎn)量，還會對由特定微生物菌株合成的生物表面活性劑的同系物造成影響[17]。由圖1可知，碳源不同，枯草芽孢桿菌FHYB201030的生物量和表面活性素產(chǎn)量相差較大。其中，以乳糖、甘油、麥芽糖為碳源時，枯草芽孢桿菌FHYB201030的生物量較高，分別為5.01、4.04和4.11；以乳糖、山梨醇、麥芽糖為碳源時，枯草芽孢桿菌FHYB201030產(chǎn)表面活性素量較高，分別為0.22、0.21和0.20；以乳糖為碳源時，枯草芽孢桿菌FHYB201030的生物量（5.01）和表面活性素的產(chǎn)量（CPC-BTB值為0.22）都達(dá)到最高值。選擇的碳源為乳糖、麥芽糖以及山梨醇。

2.1.2 氮源對表面活性素產(chǎn)量的影響 氮源是微生物生產(chǎn)表面活性素所需的第二重要營養(yǎng)素，不同的無機(jī)和有機(jī)氮源會影響表面活性素的合成，比如酵母提取物、硝酸銨、硫酸銨、尿素蛋白、硝酸鈉和麥芽提取物等[18]。根據(jù)圖2的結(jié)果，氮源的種類很大程度影響著菌株的生物量和表面活性素的產(chǎn)量[19]。當(dāng)以豆粕餅粉和棉籽餅粉為氮源時，生物量達(dá)到4.25和4.08，而酵母提取物、酪蛋白作氮源時，表面活性素產(chǎn)量較高，CPC-BTB值分別為0.18和0.19。相對而言，有機(jī)氮源對該菌株的生物量和表面活性素產(chǎn)量影響更大，最終選擇酵母提取物和酪蛋白作為氮源進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗。

圖 2 氮源對表面活性素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on the yield of surfactin

圖 3 金屬離子對表面活性素產(chǎn)量的影響Fig.3 Influence of metal ions on the production of surfactin

2.1.3 金屬離子對表面活性素產(chǎn)量的影響 不同的金屬離子可能會通過復(fù)雜的過程（包括細(xì)胞生長增強(qiáng)，氮利用受到影響以及其他可能未知的機(jī)制）明顯影響表面活性素的產(chǎn)量，例如Mg2+、K+、Mn2+和Fe2+這4種金屬離子在表面活性素的合成中尤為重要[20]。根據(jù)圖3的結(jié)果，除了Fe3+，其他金屬離子對枯草芽孢桿菌FHYB201030的生長具有不同程度的抑制作用；除了Zn2+之外，其他金屬離子對表面活性素產(chǎn)量都有一定的促進(jìn)作用，其中，Mn2+對提高表面活性素產(chǎn)量的影響最顯著，CPC-BTB值達(dá)到0.14，因此選擇添加Mn2+進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.1.4 氨基酸對表面活性素產(chǎn)量的影響 多項研究表明，氨基酸的添加會影響脂肪酸的生物合成，進(jìn)而影響表面活性素的生物合成[21]。比如，枯草芽孢桿菌發(fā)酵81 h后，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加Glu，其脂肽產(chǎn)量提高了6倍[22]。圖4結(jié)果顯示，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同氨基酸會對菌株的生長和表面活性素產(chǎn)量有一定的影響。當(dāng)添加組氨酸（His）和亮氨酸（Leu）到培養(yǎng)基中時，菌株的生物量（1.97和1.99）高于其他氨基酸的添加，但是表面活性素的產(chǎn)量（CPC-BTB值為0.09和0.08）偏低。表面活性素分子中含有四種氨基酸，分別是亮氨酸（Leu）、谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）和纈氨酸（Val），除了Leu，額外添加Glu、Asp和Val均能提高表面活性素的產(chǎn)量，其中額外添加Asp和Glu比添加其他氨基酸更能促進(jìn)菌株合成表面活性素，CPC-BTB值分別達(dá)到0.14和0.13，推測的原因是Leu會促使菌體內(nèi)物質(zhì)代謝和能量代謝更多流向菌體的生長。鑒于以下三點原因，綜合考慮，選擇添加Glu進(jìn)行后續(xù)試驗：a.天冬氨酸的酸性比谷氨酸強(qiáng)，不利于培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)；b.谷氨酸的水溶性比天冬氨酸的高，更利于細(xì)菌的利用；c.天冬氨酸可以通過谷氨酸轉(zhuǎn)化而來。

圖 4 氨基酸對表面活性素產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of amino acids on the production of surfactin

2.1.5 裝液量對表面活性素產(chǎn)量的影響 在搖瓶培養(yǎng)條件下，可以通過改變搖床轉(zhuǎn)速或裝液量來調(diào)節(jié)溶氧量。有研究表明，當(dāng)轉(zhuǎn)速為250 r/min時，產(chǎn)表面活性素最佳的裝液量為20%，但如果裝液量大于20%時，則會在培養(yǎng)基上限制氧氣，將導(dǎo)致生物量和生物表面活性劑在250 r/min時的減少[23]。結(jié)果如圖5所示，在裝液量為10%時，生物量的數(shù)值（1.37）最高，枯草芽孢桿菌為好氧菌，裝液量大會致使溶氧不足，從而抑制菌體呼吸，導(dǎo)致生物量低；而當(dāng)裝液量為30%時，產(chǎn)生的表面活性素量最高，CPC-BTB數(shù)值達(dá)到0.1。過低（發(fā)酵后期營養(yǎng)供給不足）和過高（溶氧量低）的裝液量都會影響表面活性素的合成。選擇的裝液量為30%。

2.1.6 發(fā)酵溫度對表面活性素產(chǎn)量的影響 溫度對菌體代謝的影響主要是通過影響酶的活性，改變菌體代謝方向或影響代謝的速率，從而影響菌體的生長和代謝產(chǎn)物的含量。實驗結(jié)果如圖6所示，當(dāng)溫度為47 ℃時，菌體的生物量（1.46）和表面活性素產(chǎn)量（CPC-BTB值為0.14）較高，27 ℃的低溫導(dǎo)致菌體生長過慢，降低發(fā)酵產(chǎn)量。多數(shù)報道的表面活性素生產(chǎn)的適宜溫度為25～37 ℃[24]，湯穎秀[25]的研究發(fā)現(xiàn)，30 ℃為菌體生產(chǎn)表面活性素最佳溫度，產(chǎn)量達(dá)到0.89 mg/mL。選擇的溫度為47 ℃。

圖 5 裝液量對表面活性素產(chǎn)量的影響Fig.5 Influence of liquid loading on the output of surfactin

圖 6 發(fā)酵溫度對表面活性素產(chǎn)量的影響Fig.6 Influence of fermentation temperature on the yield of surfactin

2.1.7 轉(zhuǎn)速對表面活性素產(chǎn)量的影響 對于枯草芽孢桿菌這種好氧菌而言，搖床轉(zhuǎn)速主要通過影響發(fā)酵過程中的溶氧量來調(diào)節(jié)菌體的代謝過程[26]。轉(zhuǎn)速對表面活性素產(chǎn)量的影響見圖7，整體上，轉(zhuǎn)速對該菌株的代謝影響不是很明顯?；旧细淖冝D(zhuǎn)速對生物量幾乎沒影響，但是對表面活性素產(chǎn)量有一定的影響，其中，當(dāng)轉(zhuǎn)速為200 r/min時，菌體產(chǎn)生的表面活性素的量最大，CPC-BTB值達(dá)到了0.11。轉(zhuǎn)速從140升至200 r/min過程中，氧氣和培養(yǎng)基的接觸面積和接觸時間增大，提高溶氧量，促進(jìn)了菌體代謝產(chǎn)物的合成。當(dāng)轉(zhuǎn)速從200升至250 r/min時，表面活性素產(chǎn)量反而降低，推測是因為溶解氧太多，影響代謝過程中關(guān)鍵酶的活性，反而抑制表面活性素的形成。選擇的轉(zhuǎn)速是200 r/min。

圖 7 轉(zhuǎn)速對表面活性素產(chǎn)量的影響Fig.7 Influence of speed on the production of surfactin

2.2 Plackett-Burman 試驗結(jié)果

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，確定研究因素和水平后，按照表1對發(fā)酵條件中10種因素進(jìn)行考察，以篩選出對表面活性素產(chǎn)量影響顯著的因素作進(jìn)一步優(yōu)化。Plackett-Burman實驗結(jié)果及方差分析如表3和表4所示。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Plackett-Burman design and results

從表4可知，PB試驗的模型P值為0.0113，小于0.05，失擬項的P值為0.3807，大于0.05，表明該模型具有統(tǒng)計學(xué)意義。從各個因素的P值可知，溫度、乳糖和Glu對CPC-BTB值影響極顯著（P值＜0.01），其余7種因素對CPC-BTB值影響不顯著（P值＞0.05）。根據(jù)表4的各因素預(yù)估系數(shù)可知，乳糖對CPC-BTB值表現(xiàn)為正效應(yīng)，溫度和Glu表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)。因此，根據(jù)P值和因素的正負(fù)效應(yīng)進(jìn)行下一步的最陡爬坡試驗。

表4 Plackett-Burman試驗方差分析Table 4 Analysis of variance in Plackett-Burman test

2.3 最陡爬坡試驗結(jié)果

根據(jù)因素的正負(fù)效應(yīng)和實際情況確定爬坡試驗中各因素的爬坡方向和步長，具體設(shè)計及結(jié)果詳見表5。由表5可知，第2組實驗的CPC-BTB值最高，為0.34，故以此為CCD實驗的水平中心。

表5 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Experimental design and results of steepest ascent method

2.4 響應(yīng)面試驗

根據(jù)PB試驗和最陡爬坡試驗結(jié)果，以CPC-BTB值為響應(yīng)值，以（乳糖20 g/L、溫度32 ℃、Glu 2.0 g/L）為中心點，對BBD試驗設(shè)計的結(jié)果建立回歸模型并進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6～表 7。方差分析結(jié)果顯示，所選擇的回歸模型的P＜0.0001，R2=0.9927，校正相關(guān)系數(shù)為0.9834，表明該模型對試驗結(jié)果影響極顯著，可信度很高；而失擬項P=0.2089＞0.05，失擬項不顯著，該回歸模型的擬合度很高，可以充分說明試驗因子與響應(yīng)變量之間的函數(shù)關(guān)系。由P值可得出，因素A、C、AC、BC、A2、B2、C2對CPC-BTB值影響極顯著（P＜0.01），其余因素對CPC-BTB值影響均不顯著（P＞0.05）；說明單因素作用和交互作用對CPC-BTB數(shù)值均有顯著的影響。CPC-BTB值（Y）對乳糖、溫度、Glu的多元二次回歸方程為：Y=0.52-0.075A+0.00875B-0.056C+0.0025AB-0.038AC+0.02BC-0.078A2-0.021B2-0.056C2。通過方程可知，二次項系數(shù)為負(fù)值，表明方程具有最大值。

表6 Box-Behnken試驗設(shè)及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken test

表7 Box-Behnken試驗方差分析Table 7 Analysis of variance in Box-Behnken test

3D圖形和等高線圖表示，圖的顏色從藍(lán)色到紅色的變化表示提取質(zhì)量CPC-BTB值從低到高的變化，變化的越快表示坡度越大，即對試驗結(jié)果的印象更為顯著，響應(yīng)面等高線圖可以直觀地反映各因素對響應(yīng)值的影響，以便找出最佳發(fā)酵參數(shù)以及各參數(shù)之間的相互作用，等高線中的最小橢圓的中心點即是CPC-BTB值的最高點。根據(jù)回歸方程繪出的各因素相互作用的3D圖形和等高線圖見圖8～圖10。

根據(jù)圖8結(jié)果顯示，溫度和乳糖的交互作用對響應(yīng)值CPC-BTB值的影響，從響應(yīng)曲面看，二者曲面均有一定的弧度，溫度曲面大于乳糖曲面，表明溫度對CPC-BTB值的影響略顯著于乳糖。從等高線看，該形狀明顯趨于圓，表明溫度和乳糖之間的交互作用較弱。圖9為當(dāng)乳糖取0水平時，溫度和谷氨酸的交互作用對CPC-BTB響應(yīng)值的影響。二者曲面均較為陡斜，當(dāng)溫度一定時，CPC-BTB值隨谷氨酸增加呈現(xiàn)先增后減的變化；同理，當(dāng)谷氨酸一定時，CPC-BTB值隨溫度增加呈現(xiàn)先增后減的變化；而等高線形狀也趨于橢圓，說明兩者的交互作用對CPCBTB值顯著。在圖10顯示的谷氨酸和乳糖交互作用中，拋物線圖呈開口朝下，等高線圖橢圓狀明顯，說明兩者的交互作用對CPC-BTB值顯著。綜上所述，3個因素對CPC-BTB值的影響顯著性順序為：溫度＞谷氨酸＞乳糖，與方差分析的結(jié)果保持一致。

圖 8 溫度和乳糖的交互作用對CPC-BTB值的影響Fig.8 Effects of temperature and lactose interaction on CPCBTB values

圖 9 溫度和谷氨酸的交互作用對CPC-BTB值的影響Fig.9 Effect of temperature and glutamic acid interaction on CPC-BTB value

圖 10 谷氨酸和乳糖的交互作用對CPC-BTB值的影響Fig.10 Effect of interaction between glutamate and lactose on CPC-BTB value

通過Design-Expert.V8.0.6軟件分析，得出最優(yōu)發(fā)酵條件為：乳糖25 g/L、酪蛋白10 g/L、牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、Mn2+0.5 mmol/L、Glu 2.5 g/L；溫度40 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min、裝液量30%（體積比）。

2.5 驗證試驗

為了驗證模型的準(zhǔn)確性，根據(jù)預(yù)測最優(yōu)條件（乳糖25 g/L、酪蛋白10 g/L、牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、Mn2+0.5 mmol/L、Glu 2.5 g/L；溫度40 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min、裝液量30%（體積比））進(jìn)行3次重復(fù)試驗，測定的CPC-BTB值為0.5195（SD=0.0036），實際值與預(yù)測值結(jié)果接近，說明構(gòu)建的模型可靠，能夠準(zhǔn)確預(yù)測真實值。

3 結(jié)論

以CPC-BTB數(shù)值為評價指標(biāo)，以枯草芽孢桿菌FHYB201030為試驗菌株，通過單因素實驗和Plackett-Burman試驗，篩選出3個顯著影響菌株產(chǎn)表面活性素含量的因素，分別為溫度、乳糖和Glu；利用最陡爬坡設(shè)計逼近產(chǎn)表面活性素最大區(qū)域，確定中心組合試驗的中心位點，方便進(jìn)行下一步的BBD設(shè)計試驗；進(jìn)行Box-Behnken因子設(shè)計，優(yōu)化產(chǎn)表面活性素的發(fā)酵條件，優(yōu)化后獲得的最佳培養(yǎng)基配方：乳糖20 g/L、酪蛋白10 g/L、牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、Mn2+0.5 mmol/L、Glu 2 g/L；最佳發(fā)酵條件為：溫度40 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min、裝液量30%。在該發(fā)酵條件下，實測CPC-BTB值為0.5195，與預(yù)測值的0.51714接近，最終表面活性素的產(chǎn)量基本維持在0.48 mg/mL，比優(yōu)化前（0.35 mg /mL）提高34.56%。最終得到的最優(yōu)發(fā)酵條件為菌株FHYB201030合成表面活性素的規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。