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    肝細(xì)胞癌的細(xì)胞分裂周期基因20表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系及對預(yù)后的影響

    2022-06-11 07:42:34宋應(yīng)周孟松峰
    安徽醫(yī)藥 2022年6期
    關(guān)鍵詞:研究

    宋應(yīng)周,孟松峰

    肝細(xì)胞癌在全球肝臟惡性腫瘤中發(fā)病率呈上升趨勢,已成為癌癥死亡的第二大誘因[1]。乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒慢性感染、肝硬化、酒精性肝病和黃曲霉毒素等造成了肝細(xì)胞癌的高發(fā)病率[2-4]。然而,促進(jìn)肝癌發(fā)病機制仍不清楚。在肝細(xì)胞癌發(fā)生過程中,細(xì)胞周期檢查點的改變可能與癌癥形成密切相關(guān)[5]。細(xì)胞分裂周期基因20(CDC20)是細(xì)胞周期檢查點的調(diào)節(jié)劑,與細(xì)胞周期后期中復(fù)合物/環(huán)體相互作用的調(diào)節(jié)蛋白和有絲分裂相關(guān)[6]。CDC20可與APC結(jié)合并在有絲分裂和G1期激活細(xì)胞周期蛋白的泛素化活性,促進(jìn)細(xì)胞增殖[7]。CDC20可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制惡性轉(zhuǎn)化[8]。研究表明,多種癌癥中CDC20的高表達(dá),與腫瘤的增殖、侵襲及不良預(yù)后有關(guān)[9-12]。然而,CDC20在肝細(xì)胞癌中的研究較少,該研究通過檢測肝細(xì)胞癌組織中CDC20的水平,分析CDC20的表達(dá)與病人臨床病理特征的關(guān)系及對預(yù)后的影響,為肝細(xì)胞癌的預(yù)后判斷提供參考。

    1 資料與方法

    1.1一般資料收集2016年5月至2017年12月在商丘市第三人民醫(yī)院行手術(shù)治療的肝細(xì)胞癌病人146例,男115例,女31例,年齡范圍為38~62歲,收集病人的臨床資料。收集手術(shù)切除的肝細(xì)胞癌組織及對應(yīng)的癌旁組織,放置于?80℃超低溫冰箱中。術(shù)后采用電話的方式定期隨訪,最短隨訪時間5個月,最長隨訪時間36個月,隨訪截止日期為2020年12月1日,146例的臨床資料及隨訪資料完整。該研究經(jīng)商丘市第三人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(20160412),病人或其近親屬同意并簽署知情同意書。

    1.2研究方法

    1.2.1實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRTPCR) qRT-PCR檢測肝細(xì)胞癌組織中CDC20mRNA的表達(dá)。組織中的總RNA根據(jù)Trizol試劑盒進(jìn)行提取。提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA(cD‐NA),進(jìn)行實時熒光定量PCR。CDC20正向引物序列5′-TCGAAGTCACTCGGTAGCGT-3′,反向引物序列5′-GATCCTGCATACTGCTTGCA-3′;U6正向引物序 列5′-GGCCTCATCCTCATCATGGCAGUAG-3′,反向引物序列5′-AGCCAGATGCCTAGCGACGTGC‐GC-3′??偡磻?yīng)體系為20μL,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,40個循環(huán)。以管家基因U6 mRNA水平作為內(nèi)參照,采用2?ΔΔCt法計算CDC20 mRNA的相對表達(dá)水平。

    1.2.2蛋白質(zhì)印跡法 蛋白質(zhì)印跡法檢測肝細(xì)胞癌組織中CDC20的表達(dá)。取組織中的總蛋白,根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒取30μg的蛋白,行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),將電泳凝膠上的蛋白濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,PVDF膜放置含有1%BSA的盒子中,孵育2 h、之后經(jīng)過一抗孵育(1∶1 000稀釋,4℃過夜)、TBST洗滌3次、二抗孵育(1∶4 000稀釋,室溫1 h)、TBST洗滌3次后,在PVDF膜上滴加適量化學(xué)發(fā)光顯色液,在凝膠成像系統(tǒng)中拍照,根據(jù)灰度值估測CDC20蛋白表達(dá)水平。

    1.2.3免疫組織化學(xué)實驗 免疫組織化學(xué)檢測肝細(xì)胞癌組織中CDC20的表達(dá)。切制冷凍切片,經(jīng)過脫蠟和梯度乙醇水化處理后,利用PV6000法染色,加入3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶。置于修復(fù)液中,加熱行抗原進(jìn)行修復(fù),然后放置室溫自然冷卻。經(jīng)封閉后,滴加一抗(1∶200),置于4℃冰箱孵育過夜。利用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗,滴加相應(yīng)種屬二抗(1∶400),室溫下孵育60 min,并用PBS進(jìn)行3遍沖洗。滴加新鮮配制的顯色液,利用蘇木素染料復(fù)染,中性樹膠封固,最后置于顯微鏡下觀察。染色強度評分:強陽性、中等陽性、弱陽性和陰性評分分別為3分、2分、1分和0分,陽性細(xì)胞數(shù)的評分:>75%~100%、>50%~75%、>25%~50%、5%~25%和<5%評分分別為4分、3分、2分、1分和0分,染色強度評分和陽性細(xì)胞數(shù)的評分的乘積即為總分,0~7分為低水平,8~12分為高水平。

    1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0軟件行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示,組間比較采用配對t檢驗;計數(shù)資料以例(%)表示,組間比較采用χ2檢驗,多組間的兩兩比較檢驗水準(zhǔn)α=0.016;采用Kaplan-Meier法繪制疾病無進(jìn)展生存率和總生存率曲線,log-rank檢驗比較不同組間的生存率。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1qRT-PCR檢測肝細(xì)胞癌組織中CDC20mRNA的表達(dá)CDC20 mRNA在肝細(xì)胞癌組織表達(dá)水平(2.33±0.67)高于對應(yīng)的癌旁組織(0.97±0.29)(t=5.95,P<0.001)。

    2.2蛋白質(zhì)印跡法檢測肝細(xì)胞癌組織中CDC20的表達(dá)CDC20蛋白在肝細(xì)胞癌組織中相對表達(dá)水平(0.91±0.05)高于對應(yīng)的癌旁組織(0.14±0.05)(t=34.30,P<0.001)。

    2.3免疫組織化學(xué)檢測肝細(xì)胞癌組織中CDC20的表達(dá)CDC20在肝細(xì)胞癌陽性表達(dá)率(77.4%,113/146)高于對應(yīng)癌旁組織(8.2%,12/146),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=142.69,P<0.001)。見圖1(僅展示3例病人的結(jié)果)。

    圖1 細(xì)胞分裂周期基因 20(CDC20)在3例肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)×200)

    2.4CDC20表達(dá)與病人臨床病理特征的關(guān)系CDC20的表達(dá)與病人的腫瘤長徑、被膜侵犯、脈管侵犯、腫瘤多發(fā)、分化程度和TNM分期有關(guān)(P<0.05),見表1。

    表1 細(xì)胞分裂周期基因20(CDC20)表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌病人臨床病理特征的關(guān)系/例(%)

    2.5CDC20表達(dá)對病人術(shù)后生存率的影響CDC20高水平組總生存率為(61.7%)和疾病無進(jìn)展生存率(50.0%)均低于CDC20低水平組(87.2%、69.8%)(log-rankχ2=14.19,P<0.001;log-rankχ2=9.61,P=0.005)。

    3 討論

    肝細(xì)胞癌是常見的惡性腫瘤,在過去的20年中,觀察到與肝細(xì)胞癌相關(guān)的年死亡率顯著增加[13-14]。此外,根據(jù)美國國立癌癥研究所“監(jiān)測、流行病學(xué)和結(jié)果數(shù)據(jù)庫”SEER注冊機構(gòu)項目研究,到2030年肝細(xì)胞癌的發(fā)病率將繼續(xù)上升[15]。準(zhǔn)確估計預(yù)后,在肝細(xì)胞癌治療中起著至關(guān)重要的作用。尋找預(yù)測肝細(xì)胞癌預(yù)后的生物標(biāo)志物具有重要的臨床價值。許多CDC20底物都參與有絲分裂過程,包括細(xì)胞周期蛋白B1、細(xì)胞周期蛋白A、分離酶抑制蛋白(Securin)、雙能蛋白(Geminin)和周期素依賴激酶抑制劑p21(P21)[16]。最近,越來越多的研究顯示CDC20在人類癌癥中起致癌作用,在多種人類腫瘤中觀察到CDC20的過度表達(dá),與生存率降低有關(guān)[17]。

    CDC20在結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌和胃癌中的表達(dá)均增加[9-12],在該研究中,肝細(xì)胞癌組織中CDC20 mRNA和蛋白質(zhì)水平均高于癌旁組織,提示CDC20促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。目前多項研究顯示,CDC20高水平參與多種腫瘤的進(jìn)展,例如Kim等[12]研究顯示,CDC20在腸化生、低度不典型增生、高度不典型增生和早期胃癌中的表達(dá)明顯高于正常黏膜,且在高度不典型增生中的表達(dá)水平最高,且CDC20過表達(dá)與胃癌病人的年齡、腸道組織學(xué)、較低的腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移階段以及較長的無復(fù)發(fā)生存期和癌癥特異性生存期相關(guān)。CDC20與前列腺癌的惡性進(jìn)展相關(guān),CDC20高水平病人更具侵略性的臨床病理特征和不良預(yù)后[11]。Li等[18]證明了膀胱尿路上皮癌病例中CDC20升高,而CDC20高水平與病人的無復(fù)發(fā)生存期較短和總體生存期較差相關(guān)。該研究中,CDC20在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平與腫瘤長徑、被膜侵犯、脈管侵犯、腫瘤多發(fā)、分化程度和TNM分期有關(guān),說明在腫瘤長徑、被膜侵犯、脈管侵犯、腫瘤多發(fā)分化程度低和TNM晚期的病人中CDC20的表達(dá)水平更高。提示CDC20可能與肝細(xì)胞癌的增殖與侵襲有關(guān),CDC20高水平的肝細(xì)胞癌病人具有較強的增殖活性和更強的侵襲能力,與肝細(xì)胞癌的發(fā)展密切相關(guān)。在該研究中,CDC20高水平病人的術(shù)后3年總生存率和疾病無進(jìn)展生存率均較低,提示CDC20有可能成為評價肝細(xì)胞癌預(yù)后的有效標(biāo)志物。CDC20促進(jìn)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展,其失活可能對治療肝細(xì)胞癌有一定療效。目前已發(fā)現(xiàn)幾種CDC20抑制劑,例如類毒素-抗毒素混合物酯酶、pro-TAME和2-[芐基-(2-硝基-苯磺?;?氨基]-N-羥基-3-甲基-N-丙基-丁酰胺[19-20]。對CDC20抑制劑的研究可能有助于闡明CDC20在人類癌癥中的作用機制,這也是后期該研究的方向之一。

    綜上所述,CDC20在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平增加,可能參與腫瘤的增殖和侵襲。CDC20高水平預(yù)示病人的預(yù)后不良,有望成為判斷肝細(xì)胞癌預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。

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