中藥材蛇莓標準關(guān)鍵控制指標研究

金鳳華，程慶兵，劉業(yè)飛，葉紅兵，葉玲

中藥蛇莓為薔薇科（Rosaceae）蛇莓屬（Duch‐esnea）植物蛇莓Duchesnea indica（Andr.）Focke的干燥全草。蛇莓始載于《名醫(yī)別錄》，為民間常用中草藥，《中國藥典》2020年版四部“成方制劑中本版藥典未收載的藥材和飲片”中有蛇莓的來源和名稱描述［1］。研究表明，蛇莓的主要化學成分為甾醇類、糖苷類、萜類、黃酮類等，主要應用于降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗病毒等藥理作用［2-7］。三萜類化合物齊墩果酸和熊果酸結(jié)構(gòu)相似，性質(zhì)相近，試驗表明在一般薄層色譜方法中難以分離。該研究在前期對蛇莓三萜類成分做了大量試驗研究，結(jié)合相關(guān)文獻［8-10］，采用相應的薄層分離條件，對蛇莓中的三萜類成分進行了薄層色譜鑒別研究。文獻［11-19］報道，鞣花酸是蛇莓藥材中含量較高的成分之一，且鞣花酸具有增強免疫、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等藥理作用。課題組查閱《中國植物志》《中華本草》《中藥大辭典》及近現(xiàn)代藥材標準，均有收載蛇莓，但檢驗項目單一、檢驗內(nèi)容簡單，均未收載蛇莓質(zhì)量控制關(guān)鍵性指標的檢驗項目，為提升蛇莓的質(zhì)量控制標準，課題組收集10批蛇莓中藥材（由安徽省食品藥品檢驗研究院提供），于2020年11月至2021年8月對中藥材蛇莓質(zhì)量控制的關(guān)鍵性指標分別用薄層色譜法進行定性考察及高效液相色譜法進行定量分析，為完善和提升蛇莓藥材的質(zhì)量控制標準提供科學有力的研究依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器XPE205型電子天平（Mettler-Toledo），TUBE MILL CS025型粉碎機（IKA），TLCVISUALIZ‐ER2型薄層成像系統(tǒng)（瑞士CAMAG公司），CAMAGLinomat-5型半自動點樣儀（瑞士CAMAG公司），ADC-2自動展開儀（瑞士CAMAG公司）。S120H型超聲波清洗器（德國ELMA公司），Milli-QAdvantage A10型超純水機（MILLIPORE）；U-3000型高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器（美國Thermo Fisher Sci‐entific公司）。

1.3樣品蛇莓藥材分別從福建、廣東、安徽等藥材市場收集共10批（安徽省食品藥品檢驗研究院提供，樣品編號Y1～Y10），經(jīng)合肥市食品藥品檢驗中心主任中藥師劉業(yè)飛鑒定為薔薇科（Rosaceae）植物蛇莓Duchesneaindica（Andr.）Focke的干燥全草。

2 方法與結(jié)果

2.1薄層色譜分析

2.1.1對照品溶液的配制 取齊墩果酸、熊果酸對照品，分別加無水乙醇制成0.2 g/L的溶液。

2.1.2供試品溶液的制備 精密稱取不同產(chǎn)地蛇莓粉末2 g于50 mL錐形瓶中，加三氯甲烷20 mL。超聲提取30 min，濾過，濾液揮干，殘渣加甲醇-三氯甲烷（1∶3）的混合溶液1 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.3蛇莓藥材薄層色譜分析 （1）點樣：取蛇莓供試品溶液、齊墩果酸對照品溶液、熊果酸對照品溶液各2μL，點樣于同一硅膠G薄層板上。（2）展開：點樣后浸入1%碘-二氯甲烷溶液［5］中，至過起始線迅速取出，立即用玻璃板履蓋，30 min后取下玻璃板，揮去薄層板上殘留的溶液。以環(huán)己烷-丙酮-醋酸乙酯-甲酸（9∶2∶3∶0.2）為展開劑，展開。（3）顯色：取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。觀察：分別置紫外光燈光（365 nm）和日光下檢視。（4）圖譜分析：薄層色譜圖見圖1。由圖可知，蛇莓供試品色譜與熊果酸對照品色譜在對應位置顯示相同的顏色斑點，在與齊墩果酸對照品色譜對應的位置上，無明顯的相同顏色斑點。

2.1.4薄層色譜方法學驗證

2.1.4.1溶劑優(yōu)化試驗 分別考察三氯甲烷、甲醇、無水乙醇3種溶劑的超聲提取效率。取蛇莓藥材Y4供試品溶液、齊墩果酸對照品溶液、熊果酸對照品溶液各2μL，分別點于同一硅膠G薄層板上（經(jīng)1%碘－二氯甲烷溶液預處理），以環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸（9∶2∶3∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。置紫外光燈（365 nm）下檢視?？芍?，采用溶劑三氯甲烷超聲提取效果更佳。

這里 s表示向量，其第i個元素為 si，i=1,2,...,n是個常數(shù)。而對稱矩陣B稱為模塊度矩陣，其元素為：

2.1.4.2專屬性試驗 取齊墩果酸和熊果酸對照品溶液，按（1∶1）比例混合，加無水乙醇制成含齊墩果酸0.1 g/L、熊果酸0.1 g/L的混合溶液。取蛇莓Y4供試品溶液、齊墩果酸對照品溶液、熊果酸對照品溶液、齊墩果酸熊果酸混合對照品溶液各2μL，分別點于同一硅膠G薄層板上（未經(jīng)1%碘－二氯甲烷溶液預處理）；另同法操作，點于同一硅膠G薄層板上（經(jīng)1%碘－二氯甲烷溶液預處理），以環(huán)己烷-丙酮-醋酸乙酯-甲酸（9∶2∶3∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。分別置日光和紫外光燈光（365 nm）下檢視，可知，未經(jīng)1%碘－二氯甲烷溶液預處理的薄層板，齊墩果酸、熊果酸為混合斑點，不能得到有效分離。經(jīng)1%碘－二氯甲烷溶液預處理，齊墩果酸對照品和熊果酸對照品能得到有效分離，斑點清晰可辨。

2.1.4.3穩(wěn)定性試驗 將“2.1.1”和“2.1.2”項下的熊果酸對照品溶液和供試品溶液放置24 h，按2.1.3操作，分別點樣于三個生廠商（默克化工技術(shù)有限公司，青島海洋化工廠分廠，青島邦凱高新技術(shù)材料有限公司）的硅膠G薄層板。實驗結(jié)果表明，該方法在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，在不同廠家生產(chǎn)的硅膠G薄層板上色譜斑點重現(xiàn)性良好。

2.2鞣花酸含量測定

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取鞣花酸對照品約13 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取上述溶液5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 精密稱取不同產(chǎn)地蛇莓藥材粉末（過四號篩）0.2 g，置100 mL錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱重，回流提取60 min，取出放置室溫時，再次稱重，補足甲醇重量，搖勻，用0.45μm微孔有機濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗 色譜柱：依利特C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸為流動相B，進行梯度洗脫，洗脫程序如下：0～5 min，10%～17%A；5～15 min，17%A；15～35 min，17%～25%A；35～40 min，10%A；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：254 nm；進樣量：10μL。理論板數(shù)按鞣花酸計不小于6 000。

2.2.4方法學試驗

2.2.4.1線性范圍考察 分別精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液2.0、5.0、8.0、10.0、15.0、20.0μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件依法測定峰面積積分值，分別為2.880 7、6.950 8、11.035 5、13.799 0、20.631 6、27.387 6，以峰面積積分值為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為：A=1.363V+0.149，r=1.0（n=6）。實 驗表明：濃度 為12.289 9 mg/L的鞣花酸，在所試進樣體積2.0～20.0μL范圍內(nèi)與峰面積積分值具有良好的線性關(guān)系。

2.2.4.2精密度試驗 精密吸取上述對照品溶液，重復進樣5次，按照上述色譜條件測定其峰面積積分值，其相對標準差（RSD）=0.3%，表明儀器精密度較好。

2.2.4.3重復性試驗 精密稱取同一蛇莓樣品（Y2）供試品溶液5份，每份0.2 g，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件測定鞣花酸含量，其峰面積測量值的RSD=0.3%（應≤2.0%），表明方法重復性較好。

2.2.4.4穩(wěn)定性試驗 分別吸取上述Y2供試品溶液10μL，配置后立即注入液相色譜儀，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣，測定鞣花酸含量，考察其峰面積RSD為0.19%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4.5準確度試驗 精密稱取同一蛇莓樣品（Y2）6份，每份稱取0.1 g，至100 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入對照品溶液25 mL，精密加入甲醇25 mL，精密稱定，回流提取60 min，取出放置室溫時再次稱重，補足甲醇重量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，按“2.2.3”項下色譜條件測定鞣花酸含量，計算平均回收率為99.21%，RSD為1.8%。

2.2.4.6樣品測定結(jié)果 精密稱取上述10批蛇莓樣品各兩份，每份0.2 g，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件測定鞣花酸含量，測定了10批樣品中鞣花酸的含量，結(jié)果見表1。

參照《安徽省中藥材標準》起草工作技術(shù)指引要求，設(shè)定含量測定限度公式如下：

式中μ為含量測定限值，xˉ為蛇莓樣本平均數(shù)，t為置信水平為99%的檢驗值，s為樣本的標準偏差，n為樣本批數(shù)，MU為不確定度。

從表1可以看出收集到的樣品含量差異較大，為了保證藥材質(zhì)量，結(jié)合限度計算公式，擬定含量測定限值為2.0 mg/g。

表1 蛇莓樣品中鞣花酸含量測定結(jié)果值

3 討論

3.1定性鑒別與分析課題組在薄層色譜鑒別實驗中，比較了三氯甲烷、無水乙醇、甲醇3種溶劑的提取效果，發(fā)現(xiàn)以三氯甲烷為溶劑，超聲提取的樣品成分多且相應薄層色譜的斑點清晰；采用了多種展開劑如二甲苯-丙酮-乙醇-氨水（50∶50∶10∶1）氨水預飽和、環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（10∶3∶0.5）、環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸（9∶2∶1∶0.2）等，經(jīng)試驗論證環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯-甲酸（9∶2∶3∶0.2）展開效果較好。因熊果酸和齊墩果酸為同分異構(gòu)體，且常同存在于同一藥材中，一般的薄層色譜方法不能將二者分離。有報道稱蛇莓藥材薄層色譜中，與齊墩果酸對照品相應的位置上，顯示相同顏色的斑點，經(jīng)課題組試驗發(fā)現(xiàn)，蛇莓藥材薄層色譜中，若不用1%碘－二氯甲烷溶液預處理，在與齊墩果酸對照品斑點相應的位置上，確實顯示相同顏色的“斑點”，其實該“斑點”實為熊果酸與齊墩果酸的混合斑點，用1%碘－二氯甲烷溶液預處理后，熊果酸與齊墩果酸分離，從薄層色譜圖中可見，蛇莓是與熊果酸對照品相應的位置上，顯示相同顏色的斑點，而非齊墩果酸。該發(fā)現(xiàn)對鑒別蛇莓藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣意義重大。

3.2含量測定探討與研究課題組在溶解鞣花酸對照品時，發(fā)現(xiàn)鞣花酸在乙醇、低濃度甲醇中的溶解度較低，可在甲醇中溶解。樣品提取時選用了95%乙醇、三氯甲烷、甲醇3種溶劑進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鞣花酸在甲醇中提取效果最佳；課題組查閱相關(guān)文獻［20］，結(jié)合試驗摸索，采用了兩種提取方式—加熱回流、超聲，結(jié)果表明，回流提取效果較好；加熱回流時間是經(jīng)相同實驗條件下分別采用0.5 h、1.0 h、1.5 h等多個時間點回流提取確定的，試驗發(fā)現(xiàn)回流提取1.0 h效率最高。這10批蛇莓藥材分別產(chǎn)于安徽、廣東、遼寧等地，各地所產(chǎn)蛇莓中鞣花酸含量差別甚大，最大含量與最小含量約相差6倍，不同產(chǎn)地蛇莓主成分含量的研究，對蛇莓藥材種植基地的選取有指導性意義。