溴莫尼定對低氧誘導的PC12細胞神經(jīng)損傷的保護作用

解晨，王強，湯旎，吳月容，谷有全

缺血性腦卒中是臨床常見神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其主要病理類型為短暫性腦缺血發(fā)作、可逆性神經(jīng)功能障礙、進展性卒中、完全性卒中，已嚴重影響患者生存質(zhì)量，研究報道指出神經(jīng)保護性治療對減輕缺血性腦卒中患者后遺癥具有重要意義［1］。既往研究顯示自由基生成量增加與腦缺血缺氧性損傷密切相關(guān)［2］。因而尋找抗氧化劑防治缺血性腦卒中的發(fā)生成為研究熱點。研究表明溴莫尼定是一種高度選擇性α2腎上腺素能受體激動劑，并可減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞氧化應(yīng)激損傷進而保護神經(jīng)［3］。溴莫尼定酒石酸鹽可通過激活α-2腎上腺素能受體而保護視網(wǎng)膜缺血性損傷［4］。但溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞損傷的作用機制尚未可知。研究表明蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）信號通路激活可減輕脊髓損傷［5］。既往研究顯示PC12細胞被廣泛用于神經(jīng)細胞功能、分化、凋亡、神經(jīng)遞質(zhì)分泌等分子機制的研究，而缺氧所致的PC12細胞損傷與氧化應(yīng)激有關(guān)［6-7］。但溴莫尼定是否調(diào)控Akt/mTOR/STAT3信號通路對缺氧誘導的PC12細胞損傷發(fā)揮保護作用尚未可知。本研究于2018年5月至2019年8月擬采用缺氧誘導PC12細胞損傷，觀察并探討溴莫尼定對PC12細胞缺氧損傷的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑溴莫尼定購自上海晶都生物技術(shù)有限公司；Akt/mTOR/STAT3信號通路抑制劑雷帕霉素購自北京索萊寶科技有限公司；PC12細胞購自寧波明舟生物科技有限公司。RPMI 1640培養(yǎng)基購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；胰蛋白酶與胎牛血清購自上海栩冉生物科技有限公司；噻唑藍（MTT）購自上海澤葉生物科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）細胞凋亡試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）抗體與辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗購自美國Thermo Fisher Scientific公司；RIPA裂解液購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；BCA蛋白定量檢測試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司；兔抗鼠Akt及其磷酸化（p-Akt）、mTOR及其磷酸化（p-mTOR）、STAT3及其磷酸化（p-STAT3）抗體均購自美國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1藥物處理及實驗分組 制備細胞缺氧模型：配制三氣通氣箱，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，充入95%氮氣與5%二氧化碳混合氣體，外接傳感器以此控制含氧量，缺氧處理時間24 h［8］。細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期PC12細胞進行實驗，實驗設(shè)置五組：對照組（正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞）、缺氧組（細胞缺氧處理24 h）、分別用終濃度為0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L的溴莫尼定處理細胞24 h，隨后缺氧處理24 h，分別記作缺氧+0.25μmol/L溴莫尼定組、缺氧+0.5μmol/L溴莫尼定組、缺氧+1μmol/L溴莫尼定組［9］。采用MTT實驗檢測各組細胞活力，篩選溴莫尼定適宜濃度用于后續(xù)研究。后續(xù)實驗中為驗證溴莫尼定是否通過激活Akt/mTOR/STAT3信號通路而發(fā)揮作用，實驗分成缺氧+溴莫尼定組（用前述篩選出的適宜濃度的溴莫尼定處理細胞24 h，隨后缺氧處理24 h）、缺氧+溴莫尼定+雷帕霉素組（含有前述篩選出的適宜濃度的溴莫尼定與800 nmol/L雷帕霉素處理細胞24 h，隨后缺氧處理24 h）［10］。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖 收集對數(shù)生長期PC12細胞，0.25%胰蛋白酶消化細胞，細胞計數(shù)（5×104個/毫升），制備細胞懸液，按照每孔100μL的密度接種于96孔板，每組設(shè)置3個復孔，按照“1.2.1”處理方法進行分組，每孔加入20μL MTT溶液，置于37℃、相對濕度95%、體積分數(shù)5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），低速振蕩混勻，應(yīng)用酶標儀檢測波長為490 nm處各孔吸光度。

1.2.3檢測細胞中LDH、丙二醛、SOD水平 各組細胞培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞，吸取培養(yǎng)上清液，按照LDH活性檢測試劑盒檢測細胞LDH活性，采用硫代巴比妥酸法檢測細胞丙二醛含量，應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集各組對數(shù)生長期PC12細胞，0.25%胰蛋白酶消化，細胞計數(shù)（1×104個/毫升），收集細胞，預冷PBS洗滌，1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min（4℃），收集細胞沉淀置于流式管內(nèi)，加入500μL結(jié)合緩沖液懸浮細胞，每孔依次加入5μL Annexin V-FITC與5μL PI，充分混勻，室溫避光孵育20 min，應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5蛋白質(zhì)印跡法檢測Bax、Bcl-2及Akt/mTOR/STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達 收集各組細胞，加入適量蛋白裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度，取30μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），結(jié)束后將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，室溫條件下采用5%脫脂牛奶封閉2 h，孵育一抗（1∶1 000），4℃條件下孵育24 h，孵育二抗（1∶1 000），顯影，暗室內(nèi)曝光，應(yīng)用凝膠成像分析儀及ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS 21.0軟件分析，計量資料以±s表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1不同濃度溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞活力的影響對照組、缺氧組、缺氧+0.25μmol/L溴莫尼定組、缺氧+0.5μmol/L溴莫尼定組、缺氧+1μmol/L溴莫尼定組缺氧誘導的PC12細胞活力分別為（0.69±0.08）、（0.35±0.04）、（0.44±0.05）、（0.53±0.07）、（0.60±0.09）（F=34.73，P<0.001）。與對照組比較，缺氧組缺氧誘導的PC12細胞活力顯著降低（P<0.05）；相較于缺氧組，缺氧+0.25μmol/L溴莫尼定組、缺氧+0.5μmol/L溴莫尼定組、缺氧+1μmol/L溴莫尼定組PC12細胞活力顯著升高（P<0.05）。其中溴莫尼濃度為1μmol/L時作用效果最好，用于后續(xù)研究。

2.2溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞凋亡的影響相較于對照組，Hypoxia組PC12細胞凋亡率顯著增加（P<0.05），Bax蛋白表達量顯著升高（P<0.05），Bcl-2蛋白表達量顯著降低（P<0.05）；與Hy‐poxia組比較，Hypoxia+溴莫尼定組PC12細胞凋亡率顯著降低（P<0.05），Bax蛋白表達量顯著降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表達量顯著升高（P<0.05）。見圖1，2；表1。

圖1 溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞凋亡的影響 圖3 抑制蛋白激酶 B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化因子 3（STAT3）信號通路逆轉(zhuǎn)溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞凋亡的影響

表1 溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞凋亡的影響/±s

表1 溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞凋亡的影響/±s

注：Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白。①與對照組比較，P<0.05。②與缺氧組比較，P<0.05。

組別對照缺氧缺氧+溴莫尼定F值P值重復次數(shù)3 3 3凋亡率/%3.58±0.34 32.89±3.46①7.41±0.75②541.78<0.001 Bcl-2蛋白1.00±0.17 0.29±0.04①0.89±0.12②87.82<0.001 Bax 1.00±0.13 3.76±0.31①1.48±0.16②423.58<0.001

2.3溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞LDH、丙二醛、SOD水平的影響與對照組相比，缺氧組PC12細胞中LDH、丙二醛水平顯著升高（P<0.05），SOD水平顯著降低（P<0.05）；相較于缺氧組，缺氧+溴莫尼定組PC12細胞中LDH、丙二醛水平顯著降低（P<0.05），SOD水平顯著升高（P<0.05），見表2。

圖2 溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

表2 溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞LDH、丙二醛、SOD水平的影響/±s

表2 溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞LDH、丙二醛、SOD水平的影響/±s

注：LDH為乳酸脫氫酶，SOD為超氧化物歧化酶。①與對照組比較，P<0.05。②與缺氧組比較，P<0.05。

組別對照缺氧缺氧+溴莫尼定F值P值重復次數(shù)3 3 3 LDH/（U/mL）19.07±1.65 62.31±6.82①31.35±3.21②225.16<0.001丙二醛/（μmol/g）1.35±0.12 4.29±0.43①1.76±0.19②290.81<0.001 SOD/（U/mg）173.39±18.21 50.43±5.36①143.28±15.43②185.34<0.001

2.4溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞Akt/mTOR/STAT3信號通路的影響與對照組相比，缺氧組PC12細胞中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05）；相對于缺氧組，缺氧+溴莫尼定組PC12細胞中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）。見表3。

表3 溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞Akt/mTOR/STAT3信號通路的影響/±s

表3 溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞Akt/mTOR/STAT3信號通路的影響/±s

注：Akt為蛋白激酶B，mTOR為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，STAT3為信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化因子3，p-Akt為磷酸化的蛋白激酶B，p-mTOR為磷酸化的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，p-STAT3為磷酸化的信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化因子3。①與對照組比較，P<0.05。②與缺氧組比較，P<0.05。

組別對照缺氧缺氧+溴莫尼定F值P值重復次數(shù)3 3 3 Akt 1.00±0.12 0.39±0.04①0.79±0.09②107.59<0.001 p-Akt 1.00±0.13 0.29±0.05①0.90±0.09②145.02<0.001 mTOR 1.00±0.14 0.34±0.05①0.85±0.13②82.87<0.001 p-mTOR 1.00±0.16 0.29±0.04①0.86±0.09②108.178<0.001 STAT3 1.00±0.11 0.42±0.06①0.89±0.11②92.17<0.001 p-STAT3 1.00±0.15 0.28±0.04①0.92±0.09②130.58<0.001

2.5抑制Akt/mTOR/STAT3信號通路逆轉(zhuǎn)溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞增殖和凋亡的影響實驗結(jié)果顯示，與缺氧+溴莫尼定組相比，缺氧+溴莫尼定+雷帕霉素組缺氧誘導的PC12細胞活力顯著降低（P<0.05），細胞凋亡率顯著升高（P<0.05），Bax蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），見圖3，4；表4。

表4 抑制Akt/mTOR/STAT3信號通路逆轉(zhuǎn)溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞增殖和凋亡的影響/±s

表4 抑制Akt/mTOR/STAT3信號通路逆轉(zhuǎn)溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞增殖和凋亡的影響/±s

注：Akt為蛋白激酶B，mTOR為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，STAT3為信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化因子3，Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白。

組別缺氧+溴莫尼定缺氧+溴莫尼定+雷帕霉素t值P值重復次數(shù)3 3細胞活力0.61±0.08 0.40±0.05 6.68<0.001凋亡率/%7.49±0.72 26.75±2.36 23.42<0.001 Bcl-2蛋白1.00±0.13 0.38±0.07 12.60<0.001 Bax 1.00±0.15 2.37±0.21 15.93<0.001

圖4 抑制蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）信號通路逆轉(zhuǎn)溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

2.6抑制Akt/mTOR/STAT3信號通路逆轉(zhuǎn)溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞LDH、丙二醛、SOD水平的影響相較于缺氧+溴莫尼定組，缺氧+溴莫尼定+雷帕霉素組缺氧誘導的PC12細胞中LDH、丙二醛水平顯著升高（P<0.05），SOD水平顯著降低（P<0.05），見表5。

表5 抑制Akt/mTOR/STAT3信號通路逆轉(zhuǎn)溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞LDH、丙二醛、SOD水平的影響/±s

表5 抑制Akt/mTOR/STAT3信號通路逆轉(zhuǎn)溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞LDH、丙二醛、SOD水平的影響/±s

注：Akt為蛋白激酶B，mTOR為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，STAT3為信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化因子3，LDH為乳酸脫氫酶，SOD為超氧化物歧化酶。

組別缺氧+溴莫尼定缺氧+溴莫尼定+雷帕霉素t值P值重復次數(shù)3 3 LDH/（U/mL）30.14±2.73 52.83±6.04 10.27<0.001丙二醛/（μmol/g）1.75±0.16 3.71±0.42 13.08<0.001 SOD/（U/mg）145.33±14.87 68.29±6.76 13.97<0.001

3 討論

大腦耗氧量占總耗氧量的23%左右，中樞神經(jīng)系統(tǒng)對缺氧較為敏感，一旦處于缺氧狀態(tài)大腦最易受到缺氧損傷［11］。PC12細胞來源于大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細胞，其細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能與神經(jīng)元細胞相似，部分藥物可通過抗炎、抗氧化對缺氧誘導的PC12細胞發(fā)揮保護作用［12］。因此本研究主要探討溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞增殖、凋亡及氧化應(yīng)激的影響，并探究其可能作用機制。

溴莫尼定屬于α2腎上腺素能受體激動劑，研究表明溴莫尼定對神經(jīng)細胞具有一定保護作用，但關(guān)于其具體作用機制尚未闡明［13］。研究報道指出溴莫尼定可通過減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡而減緩小鼠視神經(jīng)損傷［14］。相關(guān)研究表明溴莫尼定可抑制細胞凋亡相關(guān)蛋白活化從而減少細胞凋亡［15］。本研究結(jié)果顯示，缺氧處理后PC12細胞活力顯著降低，不同濃度的溴莫尼定處理后細胞活力顯著升高，提示溴莫尼定可促進缺氧誘導的PC12細胞存活。細胞凋亡與PC12細胞缺氧損傷密切相關(guān)，研究表明Bax表達升高可促進細胞色素C（CytC）釋放而激活caspase-3從而促進細胞凋亡，而Bcl-2表達升高可抑制CytC釋放從而抑制細胞凋亡［16］。本研究結(jié)果顯示缺氧處理后PC12細胞凋亡率顯著升高，Bax蛋白表達量增加，而Bcl-2蛋白表達量減少，但溴莫尼定處理后細胞凋亡率顯著降低，Bax蛋白表達量減少，而Bcl-2蛋白表達量增加，提示缺氧可誘導PC12細胞凋亡，而溴莫尼定可抑制缺氧誘導的PC12細胞凋亡，其作用機制可能通過調(diào)控細胞凋亡相關(guān)蛋白表達而發(fā)揮作用。SOD屬于抗氧化酶類并可通過清除自由基及減少過氧化物的生成而發(fā)揮抗氧化損傷的作用，細胞缺氧損傷發(fā)生時細胞透性增加導致LDH從細胞質(zhì)溢出，丙二醛屬于脂質(zhì)過氧化物并可反應(yīng)細胞損傷程度［17］。本研究結(jié)果顯示缺氧處理后PC12細胞中SOD水平顯著降低，而溴莫尼定可抑制缺氧誘導的PC12細胞中SOD水平的降低，提示溴莫尼定可能通過促進PC12細胞生成SOD而清除氧自由基。本研究結(jié)果顯示缺氧處理后PC12細胞中丙二醛、LDH水平顯著升高，而溴莫尼定抑制缺氧誘導的PC12細胞丙二醛、LDH水平升高，提示溴莫尼定可能通過以降低丙二醛、LDH水平而維持細胞膜完整性。本研究證實溴莫尼定對缺氧損傷的PC12細胞具有保護作用。

Akt/mTOR信號通路激活可減輕心肌細胞氧化損傷［18］。研究表明mTOR是Akt下游的靶點基因，STAT3是mTOR下游的靶點基因，Akt通過磷酸化下游靶蛋白可影響炎癥、氧化應(yīng)激等生物學過程，促進其信號通路的激活可減輕炎癥、氧化應(yīng)激進而減輕腦缺血再灌注損傷及腦損傷引起的急性肺損傷［19-20］。本研究結(jié)果顯示缺氧處理后PC12細胞中Akt/mTOR/STAT3信 號 通路 相 關(guān)蛋 白Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、STAT3、p-STAT3的表達水平均顯著降低，而溴莫尼定可顯著提高Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、STAT3、p-STAT3的表達水平，推測溴莫尼定可能通過激活Akt/mTOR/STAT3信號通路而保護缺氧誘導的PC12細胞損傷。本研究結(jié)果顯示抑制Akt/mTOR/STAT3信號通路可逆轉(zhuǎn)溴莫尼定對缺氧誘導的PC12細胞增殖、凋亡及LDH、丙二醛、SOD水平的影響，分析原因可能為Akt/mTOR/STAT3信號通路激活后可能抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)從而抑制細胞凋亡。提示溴莫尼定可通過激活Akt/mTOR/STAT3信號通路而促進缺氧誘導的PC12細胞增殖，抑制細胞凋亡及減輕氧化損傷從而保護神經(jīng)細胞。

綜上所述，溴莫尼定可促進PC12細胞缺氧損傷導致的氧自由基的清除，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，保護缺氧損傷神經(jīng)細胞，其作用機制與激活Akt/mTOR/STAT3信號通路有關(guān)。