丙泊酚通過JAK激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子信號(hào)通路抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥反應(yīng)及滑膜細(xì)胞凋亡

李帆，祖麗婭提?阿熱甫江，陳紅

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以慢性、對(duì)稱性、周圍性為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病，JAK激酶（JAK）-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子（STAT）信號(hào)通路主要參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活、分化以及抗病原性等生理活動(dòng)，近年來(lái)，研究表明RA的發(fā)病機(jī)制與JAKSTAT信號(hào)通路表達(dá)異常有關(guān)［1-11］。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚能夠通過調(diào)節(jié)JAK-STAT信號(hào)通路抑制大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)［12-15］，但丙泊酚對(duì)于RA的作用及對(duì)滑膜細(xì)胞凋亡的影響目前尚未有明確報(bào)道。從2018年7月至2019年7月，本研究通過建立RA大鼠模型，研究丙泊酚對(duì)RA大鼠的作用及其體內(nèi)JAK-STAT信號(hào)通路的影響，為RA的治療提供新的參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料健康Wistar大鼠36只，雄性，SPF級(jí)別，7～8周齡，體質(zhì)量（230±20）g，購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物房溫度（22±2）℃，濕度（50±10）%，自由飲食，光照周期12 h，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。酶標(biāo)儀購(gòu)自北京島津公司，雙垂直電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀、凝膠成像儀均購(gòu)自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自北京島津公司。丙泊酚購(gòu)自上海德默醫(yī)藥科技有限公司，牛Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑購(gòu)自深圳欣博盛生物科技有限公司，JAK2、STAT3和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、RIPA蛋白裂解液、腫瘤壞死因子-α（TNFα）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）及白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，ECL顯色液購(gòu)自Thermo公司。

1.2RA大鼠模型的建立及給藥36只Wistar雄性大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、甲氨蝶呤組、丙泊酚低、中、高劑量組，6只/組。采用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)法建立RA大鼠模型［16］：使用0.05 mol/L的冰醋酸將牛Ⅱ型膠原溶解，使其終濃度為2.0 g/L，4℃?zhèn)溆茫蚱渲屑尤牒? g/L滅活的結(jié)核分枝桿菌的完全弗氏佐劑，注射器乳化后采用尾部皮內(nèi)注射0.1 mg/0.1 mL的牛Ⅱ型膠原。第21天再次尾部皮內(nèi)注射0.1 mg/0.1 mL膠原進(jìn)行加強(qiáng)免疫，對(duì)照組大鼠不做特殊處理。參照文獻(xiàn)［17］標(biāo)準(zhǔn)，隔日按照以下標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評(píng)分：無(wú)紅斑或腫脹，記0分；踝關(guān)節(jié)有輕微的紅斑或1個(gè)趾的腫脹，記1分；踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和超過1個(gè)趾的腫脹，記2分；踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹，記3分；包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹，記4分。每個(gè)大鼠四肢累計(jì)積分之和為關(guān)節(jié)炎評(píng)分。評(píng)分>6分者，視為造模成功。造模完成后，丙泊酚低、中、高劑量組分別腹腔注射10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg丙泊酚［12-15］，甲氨蝶呤組腹腔注射甲氨蝶呤（7.5 mg/kg），對(duì)照組及模型組給予生理鹽水，1次/天，連續(xù)28 d，最后一次給藥24 h后，再次進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評(píng)分。

1.3大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平測(cè)定末次給藥24 h后，眼眶靜脈叢取血至不含肝素的玻璃管中，4℃靜置4 h，4℃，3 500 r/min離心10 min。取上清液，使用ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

1.4各組大鼠脾臟及胸腺臟器指數(shù)頸椎脫臼處死大鼠后分離脾臟及胸腺，4℃生理鹽水灌流清洗，濾紙吸干水分后稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=甲狀腺濕重（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）×100%。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)滑膜細(xì)胞凋亡率參照文獻(xiàn)［18］方法，頸椎脫臼處死大鼠后，兩側(cè)滑膜組織在無(wú)菌條件下取出，用無(wú)Mg2+、Ca2+的D-Hank’s液沖洗3次后，制成約1 mm3的小塊。用吸管吸取數(shù)小塊組織，均勻排列在培養(yǎng)皿上，置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 h，使其貼壁。取出培養(yǎng)瓶后，加入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液4 mL，再置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每隔24 h更換1次培養(yǎng)液，待滑膜細(xì)胞長(zhǎng)出組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)90%，用胰蛋白酶消化細(xì)胞后，進(jìn)行3次傳代培養(yǎng)。用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，并以1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入適量培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，2 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入195μL Annexin V-FITC結(jié)合液，再加入5μL的Annexin V-FITC，避光孵育15 min，然后加入10μL碘化丙啶（PI）染色液，避光孵育20 min，隨后置于冰浴中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6蘇木精-伊紅（HE）染色頸椎脫臼處死大鼠后，迅速分離大鼠踝關(guān)節(jié)，放入4%中性甲醛中固定過夜，脫鈣液脫鈣處理，常規(guī)HE染色，在顯微鏡下觀察。

1.7蛋白質(zhì)印跡法取大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織，蛋白裂解液裂解后，12 000 r/min，4℃離心10 min，取上清液加入十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液，100℃水浴變性，測(cè)定蛋白總濃度，取50μg蛋白進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，經(jīng)JAK2、STAT3及GAPDH兔抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜。PBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，再次清洗3次后顯色液顯影，利用凝膠成像儀成像，對(duì)各蛋白灰度值定量分析，并以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以SPSS 19.0軟件分析所有數(shù)據(jù)，Graphpad prism 5作圖。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1丙泊酚對(duì)RA大鼠關(guān)節(jié)評(píng)分的改善作用造模完成后，與對(duì)照組比較，模型組、丙泊酚低、中、高劑量組及甲氨蝶呤大鼠關(guān)節(jié)評(píng)分顯著升高（P<0.05）；給藥結(jié)束后，與模型組比較，丙泊酚低、中、高劑量組及甲氨蝶呤組RA大鼠關(guān)節(jié)評(píng)分顯著降低（P<0.05），且丙泊酚各劑量組大鼠隨著丙泊酚劑量的增加，其關(guān)節(jié)評(píng)分顯著降低。見表1。

表1 各組大鼠造模完成后與給藥結(jié)束后關(guān)節(jié)評(píng)分比較/±s

表1 各組大鼠造模完成后與給藥結(jié)束后關(guān)節(jié)評(píng)分比較/±s

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組模型組甲氨蝶呤組丙泊酚低劑量組丙泊酚中劑量組丙泊酚高劑量組F值P值鼠數(shù)6 6 6 6 6 6造模完成后0.16±0.07 10.68±1.43①9.51±2.04①10.06±1.28①9.87±1.69①9.79±1.26①137.63 0.026給藥結(jié)束后0.24±0.18 12.68±0.67①2.51±0.64①②6.76±1.43①②4.37±0.87①②2.68±0.26①②268.91 0.014

2.2丙泊酚對(duì)RA大鼠體內(nèi)炎性因子水平的影響與對(duì)照組比較，模型組TNF-α、IL-6及IL-1β水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，丙泊酚低、中、高劑量組及甲氨蝶呤組TNF-α、IL-6及IL-1β水平均顯著降低（P<0.05），且隨著丙泊酚劑量的增加，大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6及IL-1β水平逐漸降低。見表2。

表2 各組大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6及IL-1β水平比較/（ng/L，±s）

表2 各組大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6及IL-1β水平比較/（ng/L，±s）

注：TNF-α為腫瘤壞死因子α，IL-6為白細(xì)胞介素-6，IL-1β為白細(xì)胞介素-1β。①與對(duì)照組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組模型組甲氨蝶呤組丙泊酚低劑量組丙泊酚中劑量組丙泊酚高劑量組F值P值鼠數(shù)6 6 6 6 6 6 TNF-α 15.74±1.46 32.87±1.95①14.39±1.54②26.67±1.81①②19.44±1.34①②14.79±1.36②217.06 0.031 IL-6 37.79±1.18 67.71±1.34①35.66±1.82②52.86±1.37①②45.71±2.01①②38.55±2.71②378.19 0.025 IL-1β 16.57±1.66 58.89±1.73①18.04±2.41①②43.29±1.47①②38.64±1.44①②18.72±1.26①②306.55 0.027

2.3丙泊酚對(duì)RA大鼠臟器指數(shù)的影響與對(duì)照組比較，模型組脾臟及胸腺臟器指數(shù)顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，丙泊酚低、中、高劑量組及甲氨蝶呤組大鼠脾臟及胸腺臟器指數(shù)均顯著降低（P<0.05），且隨著丙泊酚劑量的增加，大鼠脾臟及胸腺臟器指數(shù)逐漸下降，同時(shí)，丙泊酚高劑量組大鼠脾臟及胸腺臟器指數(shù)與對(duì)照組大鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

表3 各組大鼠脾臟及胸腺臟器指數(shù)比較/（%，±s）

表3 各組大鼠脾臟及胸腺臟器指數(shù)比較/（%，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組模型組甲氨蝶呤組丙泊酚低劑量組丙泊酚中劑量組丙泊酚高劑量組F值P值鼠數(shù)6 6 6 6 6 6脾臟18.26±1.52 38.64±4.68①25.51±2.39①②33.27±2.84①②28.44±1.66①②18.73±1.18②269.78 0.022胸腺8.14±0.81 14.62±1.37①10.11±0.97①②12.32±1.03①②10.67±0.81①②9.42±0.75②199.71 0.018

2.4丙泊酚對(duì)RA大鼠滑膜細(xì)胞凋亡的影響對(duì)照組、模型組、丙泊酚低、中、高劑量組及甲氨蝶呤組大鼠滑膜細(xì)胞凋亡率分別為（5.22±1.23）%、（41.85±3.97）%、（31.71±1.91）%、（24.84±1.91）%、（16.33±2.32）%、（15.62±2.52）%（F=171.93，P=0.012）。與對(duì)照組，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，丙泊酚低、中、高劑量組及甲氨蝶呤組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.05），且隨著丙泊酚劑量的增加，滑膜細(xì)胞凋亡率逐漸降低。

2.5丙泊酚對(duì)RA大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)的影響模型組大鼠較對(duì)照組表現(xiàn)出踝關(guān)節(jié)滑膜組織增生，壞死細(xì)胞脫落及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較丙泊酚低、中劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)細(xì)胞壞死及脫落明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，細(xì)胞排列相對(duì)整齊，滑膜細(xì)胞相對(duì)完整，丙泊酚高劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)偶見細(xì)胞壞死脫落，炎性浸潤(rùn)少見，細(xì)胞排列整齊，病理改變明顯緩解。

2.6丙泊酚對(duì)RA大鼠滑膜組織JAK-STAT信號(hào)通路的影響與對(duì)照組比較，模型組踝關(guān)節(jié)滑膜組織JAK2、STAT3水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，丙泊酚低、中、高劑量組及甲氨蝶呤組JAK2、STAT3水平均顯著降低（P<0.05），且丙泊酚各劑量組RA大鼠隨著丙泊酚劑量的增加，滑膜組織JAK2、STAT3水平降低。見圖1，表4。

表4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織JAK2、STAT3水平比較/±s

表4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織JAK2、STAT3水平比較/±s

注：JAK2為JAK激酶2，STAT3為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3。①與對(duì)照組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組模型組甲氨蝶呤組丙泊酚低劑量組丙泊酚中劑量組丙泊酚高劑量組F值P值鼠數(shù)6 6 6 6 6 6 JAK2 0.35±0.07 1.19±0.16①0.41±0.05①②0.76±0.04①②0.59±0.04①②0.42±0.04①②77.47 0.011 STAT3 0.22±0.08 0.99±0.05①0.37±0.06②0.73±0.07①②0.55±0.05①②0.35±0.08②93.05 0.021

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織JAK2、STAT3水平

3 討論

RA作為一種以慢性、對(duì)稱性、周圍性為主要臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性、系統(tǒng)性、自身免疫性疾病，其病因尚未明確，其主要特征是手、足小關(guān)節(jié)的多關(guān)節(jié)、對(duì)稱性、侵襲性關(guān)節(jié)炎癥，隨著疾病進(jìn)展會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能喪失。研究表明，RA主要受感染、免疫調(diào)節(jié)紊亂、內(nèi)分泌紊亂、遺傳因素及環(huán)境因素等的影響［1-3］。目前臨床常用甲氨蝶呤等免疫抑制劑、非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素等藥物進(jìn)行RA的治療，但由于這些藥物長(zhǎng)期使用存在較多不良反應(yīng)且部分病人治療效果并不理想，所以對(duì)于治療RA藥物的開發(fā)仍是目前臨床亟須解決的問題之一。

近年來(lái)研究表明，丙泊酚具有顯著的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)抑制作用，能夠顯著抑制膿毒癥大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷，同時(shí)，具有調(diào)節(jié)JAKSTAT信號(hào)通路，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡、抑制肺癌細(xì)胞炎癥因子水平等藥理作用［12-15］，但丙泊酚對(duì)于RA的作用及對(duì)滑膜細(xì)胞凋亡的影響目前尚不明確。血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平在RA的發(fā)病機(jī)制中，TNF-α、IL-6及IL-1β起著關(guān)鍵性作用。成骨細(xì)胞受到刺激后，會(huì)促進(jìn)機(jī)體TNF-α、IL-6及IL-1β水平的升高，并刺激炎性因子的釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)并加重自身免疫性損傷，胸腺及臟器指數(shù)則能夠反應(yīng)機(jī)體自身免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱，滑膜細(xì)胞凋亡數(shù)則直接反映了機(jī)體關(guān)節(jié)的損傷程度［1-3］。本研究通過使用牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)建立RA大鼠模型，考察連續(xù)28 d給予不同劑量的丙泊酚對(duì)RA大鼠的作用。結(jié)果表明：與模型組相比，丙泊酚低、中、高劑量組RA大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分、體內(nèi)TNF-α、IL-6及IL-1β水平、胸腺及臟器指數(shù)、滑膜細(xì)胞凋亡率均顯著降低，提示丙泊酚能夠呈劑量依賴性地緩解RA大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度，防止大鼠RA進(jìn)一步加重，降低RA大鼠關(guān)節(jié)評(píng)分，同時(shí)降低炎性因子水平、臟器指數(shù)，抑制滑膜細(xì)胞凋亡，延緩疾病進(jìn)展，改善大鼠RA疾病預(yù)后，抑制疾病進(jìn)一步加重，進(jìn)而改善RA大鼠的疾病進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸，促進(jìn)RA大鼠關(guān)節(jié)功能的恢復(fù)。組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，丙泊酚能夠呈劑量依賴性地顯著改善RA大鼠踝關(guān)節(jié)病理組織學(xué)變化，提示丙泊酚能夠顯著改善RA大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)狀態(tài)，促進(jìn)大鼠踝關(guān)節(jié)功能恢復(fù)。

JAK-STAT信號(hào)通路主要參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活及抗病原性等生理活動(dòng)［19-20］。研究表明，JAKSTAT信號(hào)通路的異常激活可以誘發(fā)自身免疫疾病及炎癥的發(fā)生［7-11］。近年來(lái)研究表明，RA的發(fā)病機(jī)制與JAK-STAT信號(hào)通路表達(dá)異常密切相關(guān)，且抑制大鼠體內(nèi)JAK-STAT信號(hào)通路的表達(dá)，能夠顯著改善大鼠RA的疾病狀態(tài)及相關(guān)指標(biāo)［4-6］。本研究結(jié)果表明，給予RA大鼠不同劑量的丙泊酚后，丙泊酚低、中、高劑量組大鼠組織JAK2、STAT3水平均顯著降低，提示丙泊酚能夠呈劑量依賴性地降低RA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織JAK2、STAT3水平，進(jìn)而抑制大鼠滑膜組織JAK-STAT信號(hào)通路的過表達(dá)，從而推測(cè)丙泊酚可能通過調(diào)節(jié)RA大鼠體內(nèi)的JAK-STAT信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)其體內(nèi)的炎性因子水平，改善大鼠的關(guān)節(jié)評(píng)分及臟器指數(shù)，降低滑膜細(xì)胞凋亡率。但由于時(shí)間及資金有限，對(duì)于丙泊酚對(duì)RA大鼠的靶向基因調(diào)控機(jī)制及丙泊酚在臨床中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，需要在今后的研究中繼續(xù)進(jìn)行深入探討。

綜上所述，丙泊酚能夠抑制RA大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)及滑膜細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)RA大鼠體內(nèi)JAK-STAT信號(hào)通路有關(guān)。