麥角酸二乙基酰胺人工抗原的制備與初步應(yīng)用

伍麗賢，袁強(qiáng)，梁飛敏，曹斯婷

·論著·

麥角酸二乙基酰胺人工抗原的制備與初步應(yīng)用

伍麗賢，袁強(qiáng)，梁飛敏，曹斯婷

通過化學(xué)方法制備麥角酸二乙基酰胺人工抗原并初步應(yīng)用到膠體金試劑條上。利用碳二亞胺法把化學(xué)修飾后的麥角酸二乙基酰胺與載體蛋白連接成為完全抗原，使用質(zhì)譜法和紫外全波長掃描法驗(yàn)證制備效果，并作為包被原應(yīng)用于膠體金檢測試劑條上。經(jīng)過 330 例臨床樣本測試、60 種常用藥物交叉反應(yīng)測試、尿 pH 和尿比重干擾測試，該抗原能與麥角酸二乙基酰胺抗體在膠體金試劑條上表現(xiàn)出良好的特異性與敏感性。其靈敏度在 10 ng/ml，特異性為99.06%，敏感性為100%，可在 5 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場尿液快速檢測。該方法制備的麥角酸二乙基酰胺人工抗原可用于麥角酸二乙基酰胺膠體金免疫檢測方法中。

麥角酸二乙基酰胺； 人工抗原； 膠體金免疫層析法； 現(xiàn)場快速檢測

麥角酸二乙基酰胺（lysergic acid diethylamine，LSD），又稱麥角二乙酰胺，化學(xué)名 9,10-二去氫-N,N-二乙基-6-甲基麥角靈-8β-酰胺，是世界上最強(qiáng)烈的致幻劑之一[1]，口服 10 μg 即可產(chǎn)生精神作用[2]，服食超過 200 μg 可引致猝死[3-4]，屬于國家管制的精神藥物。1938 年，LSD 由瑞士化學(xué)家阿爾伯特·霍夫曼首次制備。因其具有強(qiáng)大的精神活性，20 世紀(jì) 50 年代曾作為治療情緒障礙及成癮心理治療輔助劑，60 ～ 80 年代經(jīng)黑市流入美國地區(qū)，成為當(dāng)?shù)刈盍餍械亩酒分籟5-8]。2021年美國國家藥物濫用研究所公布數(shù)據(jù)顯示在美國 12 歲以上人群中約有 710 萬人在過去一年曾濫用過致幻劑[9]。自 2016 年起新型毒品LSD 在中國悄悄興起，國內(nèi)警方已破獲數(shù)十起 LSD 走私案件。這些被浸跡過 LSD 的藥紙帶有郵票和紋身花紋，特別受國內(nèi) 00 后青年吸毒者歡迎，所以也被稱之為“郵票”。

LSD 在口服 24 小時(shí)內(nèi)有 13% 代謝為 2-氧代-3-羥基-LSD（O-H-LSD），1% 以原藥形式排到尿液中。由于 O-H-LSD 由細(xì)胞色素 P450 酶形成，不具有藥理學(xué)活性，檢測仍以樣本中的 LSD 原藥形式作為 LSD 濫用標(biāo)志物[10-12]。LSD 是最難檢測的毒品之一，原因是當(dāng)生物樣本中的 LSD 暴露于光、熱和堿性條件下，極其容易水解[13]。目前尿液中 LSD 的檢測方法以 GC-MS/MS 和LC-MS/MS 為主，這種方法雖然靈敏度高，但樣本需要經(jīng)過復(fù)雜的前處理并且需要配合大型儀器，所以此類方法只適合于實(shí)驗(yàn)室[14-16]。膠體金免疫層析法使用膠體金顆粒作為示蹤劑，利用免疫學(xué)中抗原抗體能特異性結(jié)合的原理，在層析過程中形成肉眼可見條帶的一種免疫學(xué)檢測方法，它具有檢測速度快，可肉眼觀測結(jié)果，操作簡便的特點(diǎn)，非常適合現(xiàn)場快速篩查及路邊執(zhí)法[17]。國內(nèi)外關(guān)于膠體金免疫層析法檢測尿液中 LSD 的報(bào)道較少，本文用化學(xué)方法制備 LSD 半抗原，并連接于牛血清白蛋白（BSA）得到 LSD 完全抗原，并將其作為包被原應(yīng)用于 LSD 膠體金免疫層析試劑中，建立了 LSD 膠體金免疫層析半定量分析方法，可實(shí)現(xiàn) 5 min 現(xiàn)場快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備 XYZ 大平臺(tái)三維感應(yīng)劃膜噴金儀 HM3260 購自上海金標(biāo)生物科技有限公司；HGS510-1 噴金標(biāo)機(jī)購自杭州峰航科技有限公司；MCE 1202S-2CCN-0 精密電子天平購自德國Sartorius公司；C-MAG HS7 數(shù)顯加熱恒溫磁力攪拌器購自德國 IKA 公司；Milli-Q Advantage A10 超純水儀購自美國 Millipore 公司；傅立葉變換紅外光譜儀Traffinity-1S、液相三重四級(jí)桿色譜質(zhì)譜儀 LCMS-8045 和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 GCMS-7890A-5975C 均購自日本島津公司；氣相色譜儀 Clarus 680 購自美國 PerkinElmer 公司；ST16R 高速冷凍離心機(jī)和 Nanodrop 2000C 微量紫外-可見分光光度計(jì)均購自美國 Thermo Fisher 公司。

1.1.2 主要試劑與耗材 麥角酸二乙酰胺及其同系物等標(biāo)準(zhǔn)品為Cerilliant公司產(chǎn)品；麥角酸二乙基酰胺單克隆抗體為美國Eastcoast Bio 公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白為美國Sigma 公司產(chǎn)品；羊抗鼠 IgG購自隆基生物；100 nm 金溶膠溶液為廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純；硝酸纖維素膜購自Sartorius 公司；金標(biāo)結(jié)合墊、樣品墊、吸水紙及 PVC 底板購自上海杰一生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 半抗原的制備 稱取麥角酸二乙基酰胺 323 mg（1 mmol）溶于 16 ml 乙腈，甲酸酸化至pH 5.0，分批加入 12 ml 新制 2 mol/L KMnO4溶液，每次 4 ml，室溫下密封攪拌反應(yīng) 15 h。過濾取濾液調(diào)pH 至 7.0。用乙酸乙酯洗滌上述濾液 3 次，每次 7 ml。無水硫酸鈉干燥有機(jī)相后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到紅棕色油狀物，為中間產(chǎn)物 A（295 mg）。

中間產(chǎn)物 A 加入 K2CO3414 mg，TBAB 23 mg，KI 23 mg，4-溴丁酸乙酯 295 mg，12 ml (C2H5)3N，氦氣保護(hù)下于 50 ℃攪拌反應(yīng) 20 h。待溫度降至室溫后加入 20 ml 水，用乙酸乙酯洗滌上述產(chǎn)物3 次，每次 7 ml，無水硫酸鈉干燥有機(jī)相后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到黃色油狀物，為化合物 B（234 mg）。

化合物 B 加入 95% 乙醇 12 ml 和飽和 LiOH 6 ml，40 ℃攪拌反應(yīng) 4 h；冰浴下邊攪拌邊加入去離子水 10 ml，用 1 mol/L HCl 酸化至pH 3.0，用乙酸乙酯洗滌上述產(chǎn)物 3 次，每次 7 ml，無水硫酸鈉干燥有機(jī)相后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到173 mg 黃色油狀物，制備路線如圖 1。

1.2.2 全抗原的制備 使用碳二亞胺法把 LSD 半抗原與 BSA 連接。取 0.05 mmol（19 mg）LSD 半抗原溶于 1 ml N,N-二甲基酰胺（DMF）中，分別加入 19 mg EDC和 19 mg NHS，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4 h，反應(yīng)液置于 1.5 ml 離心管 10 000 r/min 離心 10 min，取上清液備用。

50 mg BSA 溶于 4 ℃預(yù)冷的 4 ml 0.05 mol/L pH 7.4 PBS 中，緩慢滴入上述上清液 0.8 ml，4 ℃反應(yīng) 4 h，0.01 mol/ml pH 7.4 PBS 透析48 h，分裝后凍干備用。

1.2.3 LSD 全抗原的鑒定 采用紫外光譜法鑒定LSD 全抗原制備效果。在 200 ～ 800 nm 范圍內(nèi)，分子中價(jià)電子經(jīng)紫外光或可見光激發(fā)，吸收能量后從低能級(jí)躍遷到高能級(jí)，形成特征吸收光譜，其吸收強(qiáng)度和波長由分子所含生色團(tuán)和助色團(tuán)以及共軛情況決定[18-20]。BSA 在 280 nm 處有一個(gè)特征吸收峰，因此，可對(duì)比同一濃度下的 BSA 與 LSD 全抗原在 280 nm 處紫外光譜特征吸收峰，若 LSD 全抗原在 280 nm 峰值發(fā)生平移或疊加，可初步判斷 LSD 半抗原已偶聯(lián)到 BSA 上[21]。

圖1 LSD 半抗原制備路線圖

Figure 1 Synthetic route of LSD hapten

1.2.4 LSD 膠體金免疫層析試劑條性能評(píng)價(jià)

1.2.4.1 試劑條的組裝 PVC 底板貼上 NC 膜后，LSD 全抗原用 0.01 mol/L pH 7.4 PBS 稀釋至0.2 mg/ml，用劃膜噴金儀噴于 NC 膜 T 線位置，羊抗鼠IgG 稀釋至0.4 mg/ml，噴于 NC 膜C 線位置，50 ℃烘干 24 h。NC 膜 T 線端依次貼上膠體金標(biāo)記 LSD 抗體的噴金結(jié)合墊、樣品墊，NC 膜 C 線端貼上吸水墊，裁切成 4.0 mm的試劑條。

1.2.4.2 靈敏度及同系物 cutoff 值的確定 用 LSD 試劑條對(duì)陰性尿液及不同濃度的 LSD 尿液進(jìn)行檢測，加樣 5 min 后觀察 T 線和 C 線位置是否出現(xiàn)紫紅色線，若觀察到 T 線和 C 線均出現(xiàn)紫紅色線，結(jié)果為陰性，若只有 C 線顯色，T 線不顯色，結(jié)果為陽性，陽性的最低檢出限為該試劑條的cutoff 值。

在陰性尿液中分別加入 LSD 代謝物 2-氧代- 3-羥基-LSD（O-H-LSD）及麥角酸 N,N-甲基丙胺（LAMPA）配置成不同濃度的尿液，用 LSD 試劑條對(duì)每個(gè)濃度尿液進(jìn)行檢測，加樣 5 min 后記錄結(jié)果，確定試劑條的 O-H-LSD 及LAMPA 檢測cutoff 值。

1.2.4.3 抗交叉能力測試 對(duì) 60 種常見藥物（100 μg/ml）進(jìn)行檢測，測試其抗藥物干擾能力。

1.2.4.4 尿液pH 值測試 把陰性尿液、–50% cutoff 及 +50% cutoff 的陽性尿液分別用 0.1 mol/mlNaOH 和 0.1 mol/ml HCl 溶液調(diào)pH 至 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，用 LSD 試劑條分別對(duì)以上尿液進(jìn)行檢測，每個(gè)尿樣做 10 次重復(fù)測試，檢測其抗尿液pH 干擾能力。

1.2.4.5 尿液比重測試 把 15 份不同尿液比重 SG（范圍 1.003 ～ 1.040）的尿樣分別配制成–50% cutoff 及 +50% cutoff 的陽性尿液，用 LSD 試劑條分別對(duì)以上陰性尿液及配置的–50% cutoff 及 +50% cutoff 的陽性尿液進(jìn)行檢測，每個(gè)尿樣做10 次重復(fù)測試，檢測其抗尿比重干擾能力。

1.2.4.6 性能的臨床評(píng)價(jià) 對(duì) 330 例經(jīng) LC-MS/MS 確證的臨床尿液樣本進(jìn)行測試，測試其敏感性與特異性。

2 結(jié)果

2.1 LSD 半抗原的鑒定

LSD 半抗原經(jīng) ESI-MS 分析（圖 2），結(jié)構(gòu)為 4-((9R)-N-乙基-7-甲基-4,6,6a,7,8,9-六氫吲哚[4,3- fg]喹啉-9-甲酰胺)丁酸。

2.2 LSD 全抗原的鑒定

LSD 半抗原、全抗原和 BSA 在 0.5 mg/ml 濃度下的紫外光譜掃描圖如圖 3 所示，可見 LSD 半抗原、LSD 完全抗原和 BSA 的最大吸收峰值分別在288 nm、282 nm、280 nm，與 BSA 紫外曲線相比，LSD 完全抗原的最大吸收峰發(fā)生往右上方紅移并帶有增色效應(yīng)，所以可初步判斷 LSD 半抗原已成功連到 BSA 上。

2.3 LSD 試劑條性能鑒定

2.3.1 試劑條的靈敏度測試結(jié)果 LSD 膠體金試劑條采用的是競爭性免疫層析法，陰性尿液中分別配置成如圖 4 所示濃度的 LSD 陽性尿液，用試劑條進(jìn)行檢測，5 min 肉眼觀察結(jié)果。當(dāng) LSD 濃度為 10 ng/ml 時(shí)，試劑條 T 線剛好消失，因此可定義該濃度為試劑條的陽性 cutoff 值，檢測 +50% cutoff（5 ng/ml）濃度為陽性結(jié)果，檢測 –50% cutoff（15 ng/ml）濃度T 線有微弱顯色，為陰性結(jié)果。

同理檢出代謝物 O-H-LSD 和同系物 LAMPA 的cutoff 值分別為2000 ng/ml 和 20 ng/ml（圖 5）。

2.3.2 試劑條的抗藥物干擾測試結(jié)果 LSD 試劑條檢測 60 種常用藥物，結(jié)果如表 1所示，均沒有交叉情況，特異性良好。

2.3.3 試劑條的抗尿液 pH 干擾結(jié)果 LSD 試劑條檢測 pH 4.0 ～ 9.0 尿液，檢測結(jié)果未受尿液 pH 值干擾，未出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果。

2.3.4 試劑條的抗尿液比重干擾結(jié)果 LSD 試劑條檢測尿比重 1.003 ～ 1.040 的尿液，檢測結(jié)果未受尿液比重值干擾，未出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果。

2.3.5 試劑條性能的臨床評(píng)價(jià)結(jié)果 檢測 330 例來自圣地亞哥研發(fā)中心收集的經(jīng)定性定量確認(rèn)的尿液樣本（表 2），LSD 試劑條的特異性為99.06%，敏感性為100%，有 2 例臨界值樣本，這兩例樣本其 LSD 濃度分別為 8.093 ng/ml、9.214 ng/ml，濃度處于檢測 cutoff 值附近，是曾經(jīng)少量服食過LSD 的吸毒人員樣本。

圖2 4-((9R)-N-乙基-7-甲基-4,6,6A,7,8,9-六氫吲哚[4,3-FG]喹啉-9-甲酰胺)丁酸 ESI-MS 分析

Figure 2 4-((9R)-N-ethyl-7-methyl-4,6,6A,7,8,9-hexahydroindolo[4,3-FG]quinoline-9-carboxamido)butanoic acid ESI-MS analysis

圖3 LSD 半抗原、全抗原和 BSA 紫外光譜圖[1：LSD 半抗原峰值（288，2.42）；2：LSD 完全抗原峰值（282，0.564）；3：BSA 峰值（280，0.292）]

Figure 3 Ultraviolet spectra of LSD hapten, complete antigen and BSA [1: Peak of LSD hapten (288, 2.42); 2: Peak of LSD complete antigen (282, 0.564); 3: Peak of BSA (280, 0.292)]

圖4 LSD 靈敏度測試結(jié)果

Figure 4 Sensitivity test result of LSD reagent strip

圖5 LSD 同系物的檢出結(jié)果（A：O-H-LSD 不同濃度檢測結(jié)果；B：LAMPA 不同濃度檢測結(jié)果）

Figure 5 Test results of LSD homologues (A: Test results of different concentration of O-H-LSD; B: Test results of different concentration of LAMPA)

表1 60種常用藥物干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Table 1 Results of cross experiments on commonly used drugs

藥名Drugs結(jié)果Result藥名Drugs結(jié)果Result藥名Drugs結(jié)果Result 阿司匹林 Aspirin-氯雷他定 Loratadine-嗎啡 Morphine- 對(duì)乙酰氨基酚 Acetaminophen-左炔諾孕酮 Levonorgestrel-鹽酸搖頭丸 MDMA- 多潘立酮 Domperidone-鹽酸偽麻黃堿Pseudoephedrine hydrochloride-鹽酸甲基安非他命Methamphetamine hydrochloride- 布洛芬 Ibuprofen-氨茶堿 Aminophylline-甲基苯丙胺 Methylamphetamine- 卡馬西平 Carbamazepine-孟魯司特 Montelukast-咖啡因 Caffeine- 拉莫三嗪 Lamotrigine-福爾可定 Pholcodine-克拉霉素 Clarithromycin- 加巴噴丁 Gabapentin-磷酸可待因 Codeine phosphate-地紅霉素 Dirithromycin- 氯硝西泮 Clonazepam-乙酰可待因 Acetyl codeine-阿昔洛韋 Acyclovir- 鹽酸氯丙嗪Chlorpromazine hydrochloride-那可丁 Narcotine-利福平 Rifampicin- 氟哌啶醇 Haloperidol-氫溴酸右美沙芬Dextromethorphan hydrobromide-酮康唑 Ketoconazole- 奮乃靜 Perphenazine-鹽酸麻黃堿 Ephedrine hydrochloride-左氧氟沙星 Levofloxacin- 帕利哌酮 Paliperidone-鹽酸普魯卡因 Procaine hydrochloride-環(huán)丙沙星 Ciprofloxacin- 利培酮 Risperidone-鹽酸可卡因 Cocaine hydrochloride-青霉素V鉀 Penicillin V potassium- 鹽酸哌替啶 Pethidine hydrochloride-鹽酸利多卡因 Lidocaine hydrochloride-氨芐西林 Ampicillin- 罌粟堿 Papaverine 氯胺酮 Ketamine-阿莫西林 Amoxicillin- 美沙酮 Adanon-硝西泮 Nitrazepam-四環(huán)素 Tetracycline- 萘磺酸右丙氧芬Naphthalene sulfonate dextropropoxyphene-奧沙西泮 Oxazepam-頭孢克洛 Cefaclor- 鹽酸曲馬多 Tramadol hydrochloride-巴比妥 Barbital-頭孢拉定 Cefradine- 氨酚羥考酮 Oxycodone-鹽酸納洛酮 Naloxone hydrochloride-氫氯噻嗪 Hydrochlorothiazide- 安非他命 Amphetamine-鹽酸納曲酮 Naltrexone hydrochloride-頭孢氨芐 Cefalexin-

表2 臨床樣本測試結(jié)果

Table 2 Test results of clinical sample

LSD 膠體金試劑條Colloidal gold reagent strip of LSDLC-MS/MS總數(shù)Total results 陽性 Positive陰性 Negative 陽性 Positive120 2122 陰性 Negative 0208208 總數(shù) Total results120210330

3 討論

抗原抗體材料是構(gòu)建免疫層析試劑的關(guān)鍵，半抗原分子結(jié)構(gòu)中修飾位點(diǎn)的選擇與連接臂長度的設(shè)計(jì)是影響人工抗原性能的重要因素。LSD 分子量為 267，需經(jīng)化學(xué)修飾接上連接臂才能與大分子載體結(jié)合，用于免疫檢測方法上。有報(bào)道指出，連接臂接入位點(diǎn)的不同會(huì)令半抗原的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，所合成的完全抗原會(huì)暴露出不同的抗原決定簇，因此其與抗體結(jié)合的親和力和特異性也是大不相同的[22]。LSD 左側(cè)的雜環(huán)結(jié)構(gòu)為 LSD 的特征結(jié)構(gòu)，是較強(qiáng)的抗原決定簇。本研究保留此特征結(jié)構(gòu)，先把 LSD 上二乙酰胺脫去乙基，再接入末端帶有羧基的四碳脂肪族碳鏈連接臂，連接臂的分子量小而結(jié)構(gòu)簡單，有效降低因連接臂帶來的非特異性結(jié)合，并可充分暴露而不被載體蛋白遮擋，從而使 LSD 抗原能更好地與 LSD 抗體結(jié)合[23]。

連接臂的碳鏈長度一般多為 3 ～ 6 個(gè)，使用不同碳鏈長度的連接臂可影響人工抗原的穩(wěn)定性。本研究中使用 4 個(gè)碳的連接臂會(huì)比 6 個(gè)碳連接臂的 LSD 抗原在 4 ℃環(huán)境下溶液的穩(wěn)定性以及其在 NC 膜上固定干燥后的穩(wěn)定性更好。原因分析有二：一是當(dāng)其連接臂較長時(shí)，氫鍵、疏水作用或其他作用力使連接臂折疊而導(dǎo)致半抗原包裹到載體蛋白中，部分抗原決定簇被載體蛋白遮擋而導(dǎo)致抗原部分失效的現(xiàn)象[24]；二是連接臂的增長會(huì)顯著增加半抗原的偶聯(lián)率[25]。蛋白載體表面連有大量半抗原時(shí)，表面的疏水作用增強(qiáng)使 LSD 抗原在保存溶液或包被稀釋液中容易發(fā)生沉淀析出，從而影響其穩(wěn)定性。所以在半抗原的修飾設(shè)計(jì)時(shí)，連接臂的碳鏈長度也是一個(gè)關(guān)鍵的考慮因素。

本研究制備的 LSD 人工抗原成功應(yīng)用于 LSD 免疫膠體金尿液試劑上，結(jié)合《中華人民共和國禁毒法》和《戒毒條例》可為緝毒禁毒工作提供快速、準(zhǔn)確的判斷依據(jù)，便于管理機(jī)構(gòu)對(duì)吸毒和戒毒人員的長期跟蹤及管理。

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Synthesis and application of artificial lysergic acid diethylamine antigen

WU Li-xian, YUAN Qiang, LIANG Fei-min, CAO Si-ting

We aim to synthesize an artificial lysergic acid diethylamine (LSD) antigen by chemical method and apply it to colloidal gold reagent strip.Carbodimide method was used to link chemically modified lysergic acid diethylamine with carrier protein to form complete antigen. The synthesis effectwas verified by electrospray mass spectrometry and UV full-wavelength scanning, and the complete lysergic acid diethylamine antigen was used as a coating on the reagent strip for colloidal gold detection.Data of 330 clinical sample tests and 60 common drug cross-reaction tests, anti-urine pH and anti-urine specific gravity interference tests revealed that the antigen could show good specificity and sensitivity with LSD antibody on colloidal gold reagent strip.The artificial antigen synthesized by this chemical method can be used in the colloidal gold immunoassay of LSD, which can enable rapid point-of-care testing of urine samples within 5 minutes, with the sensitivity of 10 ng/ml, the specificity of 99.06% and the sensitivity of 100%.

lysergic acid diethylamine; artificial antigen; colloidal gold immunochromatography; point-of-care test

National Local Joint Engineering Laboratory for Self Inspection Rapid Diagnosis, Guangzhou Wondfo Biotech Co., Ltd, Guangzhou 510663, China

WU Li-xian, Email: lillian7040@126.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2022.03.003

510663 廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司自檢型快速診斷國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室

伍麗賢，Email：lillian7040@126.com

2021-12-02