谷胱甘肽過氧化物酶4在雷公藤內(nèi)酯酮激活結(jié)腸癌細(xì)胞鐵死亡中的作用

李慧霞 尤偉波 陳麗 王建平

結(jié)腸癌是全球范圍內(nèi)較為常見的消化道惡性腫瘤之一，極大威脅著人類的健康[1]。外科手術(shù)切除是其最佳治療手段，但多數(shù)患者診斷時(shí)已處于中晚期，失去了最佳的手術(shù)機(jī)會(huì)[2-3]。盡管放化療、分子靶向藥物、免疫檢查點(diǎn)抑制劑等治療能有效提高結(jié)腸癌的治療緩解率，但結(jié)腸癌、直腸癌的5年生存率僅為57.6%和56.9%[1]。因此，亟需探索新的抗腫瘤療法。雷公藤內(nèi)酯酮（triptoinde，TN）是從雷公藤根莖分離提取的三萜類化合物，具有廣泛的抗癌作用[4-8]；但其在結(jié)腸癌中的作用及相關(guān)機(jī)制目前尚未明確。細(xì)胞鐵死亡是一種鐵離子依賴的脂質(zhì)氧化物過載誘發(fā)的調(diào)節(jié)性死亡，研究證實(shí)多種抗癌藥物可通過激活細(xì)胞鐵死亡來發(fā)揮抗癌作用[9-10]。因此，本研究對(duì)細(xì)胞鐵死亡關(guān)鍵調(diào)控蛋白谷胱甘肽過氧化物酶 4（glutathione peroxidase 4，GPX4）在TN激活結(jié)腸癌細(xì)胞鐵死亡中的作用作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 試劑和細(xì)胞 TN（批號(hào)：38647-11-9，純度≥97%）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，GPX4抗體（批號(hào)：ab125066）、β-actin（批號(hào)：ab6276）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，陰性載體（批號(hào)：GVAP0200268）購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司，GPX4過表達(dá)載體（批號(hào)：GOSV0282718）購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司，活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：S0033S）、CCK-8（批號(hào)：C0038）、丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：S0131S）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：S0053）、Calcein AM/PI細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：C2015S）、二甲基噻唑二苯基四氮唑溴鹽[3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]溶液（批號(hào)：C0009S）均購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。本實(shí)驗(yàn)在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院完成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HCT116細(xì)胞置于含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基中，放在37℃、5% CO2、飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)；每隔1 d更換1次培養(yǎng)基。

1.2.2 細(xì)胞分組與處理 將體外培養(yǎng)的HCT116細(xì)胞分為5組，即對(duì)照組、TN組、鐵死亡抑制劑Feroptosis-1（Fer-1）+TN組、陰性載體組、GPX4過表達(dá)組。對(duì)照組細(xì)胞不作任何處理。TN組細(xì)胞加入15.0 nmol/L的TN處理48 h。Fer-1組細(xì)胞用2 μmol/L Fer-1預(yù)處理2 h后，加入15 nmol/L TN處理48 h；陰性載體組、GPX4過表達(dá)組細(xì)胞分別用 10 μl陰性載體、10 μl GPX4過表達(dá)轉(zhuǎn)染48 h后，加入15 nmol/L TN處理48 h。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 陰性載體和GPX4過表達(dá)載體由吉?jiǎng)P基因科技有限公司合成。將1×105個(gè)HCT116細(xì)胞接種于6孔板，用無(wú)雙抗、無(wú)血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染。按照說明書方法分別取10 μl陰性載體、GPX4過表達(dá)載體加入細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)。在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，經(jīng)轉(zhuǎn)染后12、24、48 h加入嘌呤霉素，獲取陰性載體和GPX4過表達(dá)表達(dá)細(xì)胞。

1.2.4 細(xì)胞存活率檢測(cè) 采用CCK-8法。HCT116細(xì)胞按0.2×103個(gè)/孔接種至96孔板中，置于培養(yǎng)箱過夜，待貼壁后加入 0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、40.0 nmol/L的TN繼續(xù)培養(yǎng) 48 h。每孔加入20 μl MTT溶液，37℃溫箱反應(yīng)2～4 h，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)562 nm處檢測(cè)吸光度（optical density，OD）值。細(xì)胞存活率=（OD 值給藥組-OD 值空白孔/OD 值對(duì)照組-OD 值空白孔）×100%。

1.2.5 死亡細(xì)胞比例檢測(cè) 采用死細(xì)胞染色法。5組HCT116細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，用PBS輕輕洗去培養(yǎng)基，加入經(jīng)檢測(cè)緩沖液稀釋1 000倍的Calcein AM/PI工作液500 μl，室溫下避光孵育30 min。使用熒光顯微鏡拍攝細(xì)胞染色情況并統(tǒng)計(jì)死亡細(xì)胞比例。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)GSH含量檢測(cè) 5組HCT116細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，用PBS輕輕洗滌1次，1 500 r/min離心5min，取細(xì)胞沉淀，加入蛋白去除試劑充分混勻；再加入液氮，37℃反復(fù)凍融2次，冰上靜置5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液。根據(jù)GSH檢測(cè)試劑盒說明書制作標(biāo)準(zhǔn)品，加樣后使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)412 nm處檢測(cè)OD值，根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的OD值作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，以對(duì)照組為參照，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)GSH相對(duì)含量。

1.2.7 細(xì)胞內(nèi)ROS含量檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。5組HCT116細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，用PBS輕輕洗滌1～2次，制備細(xì)胞懸液。加入適量10 μmol/L的二氯熒光黃雙乙酸鹽稀釋液對(duì)重懸細(xì)胞進(jìn)行染色，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，轉(zhuǎn)至流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，獲得平均熒光強(qiáng)度值，以對(duì)照組為參照，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量。

1.2.8 細(xì)胞內(nèi)MDA含量檢測(cè) 5組HCT116細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，用PBS輕輕洗滌1～2次，加入細(xì)胞裂解液充分混勻，待細(xì)胞裂解完全后，取0.1 ml裂解液，加入0.2 ml MDA檢測(cè)工作液，置于100℃金屬浴中15 min后，1 500 r/min離心5 min，取上清液。使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)532 nm處檢測(cè)OD值，以對(duì)照組為參照，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)MDA相對(duì)含量。

1.2.9 細(xì)胞GPX4蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 將上述5組細(xì)胞裂解液0.1 ml，置于4℃離心機(jī)，12 000 r/min離心15 min，取上清液。每孔20 μg總蛋白用10%聚丙烯酰胺梯度凝膠進(jìn)行電泳分離1.5～2.0 h，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜2 h，取出聚偏氟乙烯膜后用10%脫脂牛奶室溫下封閉30 min，根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量裁膜后，分別加入GPX4、β-actin一抗，4℃孵育過夜；取聚偏氟乙烯膜洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h，洗滌3次，利用電化學(xué)發(fā)光技術(shù)進(jìn)行顯影和定影，使用Image J軟件計(jì)算各個(gè)條帶的灰度值，即蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TN處理48 h后HCT116細(xì)胞存活率比較 隨著TN濃度的增加，HCT116細(xì)胞存活率逐漸下降（P＜0.05），見圖 1。TN對(duì) HCT116細(xì)胞的半抑制濃度 （half maximal inhibitory concentration，IC50）為15.37 nmol/L，故本研究選擇最接近IC50的濃度15 nmol/L為TN給藥終濃度。

圖1 不同濃度雷公藤內(nèi)酯酮處理48 h后HCT116細(xì)胞存活率比較

2.2 5組HCT116死亡細(xì)胞比例比較 5組HCT116死亡細(xì)胞比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，TN組死亡細(xì)胞比例明顯升高（P＜0.05）；與TN組比較，F(xiàn)er-1組死亡細(xì)胞比例明顯降低（P＜0.05）；與陰性載體組比較，GPX4過表達(dá)組死亡細(xì)胞比例明顯降低（P＜0.05），見圖 2（插頁(yè)）。

圖2 5組HCT116死亡細(xì)胞比例比較（a：細(xì)胞染色圖，綠色熒光所示為活細(xì)胞，紅色熒光所示為死細(xì)胞；b：柱狀圖，*P＜0.05）

2.3 5組 HCT116細(xì)胞內(nèi) GSH、ROS、MDA含量比較5組HCT116細(xì)胞內(nèi)GSH、ROS、MDA含量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與對(duì)照組比較，TN組細(xì)胞內(nèi)GSH含量明顯減少（P＜0.05），ROS、MDA含量均明顯增加（均P＜0.05）；與TN組比較，F(xiàn)er-1組細(xì)胞內(nèi)GSH含量明顯增加（P＜0.05），ROS、MDA含量均明顯減少（均P＜0.05）；與陰性載體組比較，GPX4過表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)GSH含量明顯增加（P＜0.05），ROS、MDA含量均明顯減少（均P＜0.05），見圖3。

圖3 5組HCT116細(xì)胞內(nèi)GSH、ROS、MDA含量比較

2.4 5組HCT116細(xì)胞GPX4蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，TN組細(xì)胞GPX4蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與TN組比較，F(xiàn)er-1組細(xì)胞GPX4蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與陰性載體組比較，GPX4過表達(dá)組細(xì)胞GPX4蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），見圖4。

圖4 5組HCT116細(xì)胞GPX4蛋白表達(dá)水平比較（a：電泳圖；b：柱狀圖，*P＜0.05）

3 討論

TN屬于三萜類化合物，具有極強(qiáng)的抗癌活性。體外內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，TN能明顯抑制胃癌、胰腺癌、肺癌等實(shí)體腫瘤細(xì)胞增殖[4-8]。Xiang等[4]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于高侵襲、未分化的胃癌細(xì)胞，TN的IC50為5.1～11.1 nmol/L，而對(duì)正常胃細(xì)胞株 GES-1的 IC50為 20.2 nmol/L。Wang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，TN對(duì)食管癌細(xì)胞株HONE-1的IC50為23.56 nmol/L，而5～500 nmol/L的TN對(duì)正常食管細(xì)胞株NP-69無(wú)細(xì)胞毒性。Zhang等[6]也研究證實(shí)，TN對(duì)多種胰腺癌細(xì)胞的IC50為10 nmol/L，對(duì)正常胰腺細(xì)胞株HSF的IC50＞50 nmol/L。本研究結(jié)果顯示，TN對(duì)HCT116細(xì)胞的IC50為15.37 nmol/L，提示TN對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞具有明顯細(xì)胞毒性作用，能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。

細(xì)胞鐵死亡是由鐵離子依賴的脂質(zhì)過氧化物異常堆積導(dǎo)致的一種新型細(xì)胞死亡方式[9]，特征性表現(xiàn)為脂質(zhì)過氧化物及ROS過量蓄積；在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為細(xì)胞縮小，線粒體嵴消失或減少、線粒體內(nèi)外膜濃縮；在分子水平上表現(xiàn)為GPX4活性減弱、GSH耗竭、脂質(zhì)氧化物無(wú)法被還原。在二價(jià)鐵離子的催化下，脂質(zhì)氧化物被氧化，從而產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷性死亡。然而，多種腫瘤細(xì)胞能夠適應(yīng)性維持細(xì)胞內(nèi)過氧化脂質(zhì)代謝平衡，保護(hù)細(xì)胞免受鐵死亡損害。其中GPX4是降低脂質(zhì)過氧化物含量的一種重要酶類，能催化脂質(zhì)過氧化物還原，降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物含量，抑制細(xì)胞鐵死亡[11-12]。研究表明，GPX4抑制劑能誘發(fā)癌細(xì)胞鐵死亡，發(fā)揮抗癌作用[9]。Hou等[13]研究表明，二甲雙胍通過降低GPX4表達(dá)來激活細(xì)胞鐵死亡，從而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。Gao等[14]研究發(fā)現(xiàn)，布洛芬能降低GPX4表達(dá)，從而發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤的作用。Zhang等[15]研究表明，GPX4抑制劑RSL3能明顯增加順鉑的化療敏感性。本研究結(jié)果顯示，TN能增加HCT116細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA含量，同時(shí)降低GSH含量；TN+Fer-1組細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA含量較TN組均明顯減少，而GSH含量明顯增加，這說明TN能激活HCT116細(xì)胞鐵死亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TN能抑制GPX4表達(dá)，并被Fer-1部分逆轉(zhuǎn)；經(jīng)GPX4過表達(dá)后，TN誘導(dǎo)的ROS、MDA含量均明顯減少，GSH含量明顯增加，這說明GPX4參與TN激活HCT116細(xì)胞鐵死亡的過程?？梢?，TN具有抗結(jié)腸癌的作用，而GPX4是TN抗癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)，通過調(diào)控TN激活癌細(xì)胞鐵死亡作用。

綜上所述，TN通過抑制GPX4激活結(jié)腸癌細(xì)胞鐵死亡，從而抑制癌細(xì)胞增殖。