常州地區(qū)5302例育齡婦女脊髓肌萎縮癥篩查結(jié)果分析

賈陳波　袁小松　張玢　陳文儀

【摘要】目的評(píng)估常州地區(qū)脊髓肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因（SMN1）缺失的攜帶率及篩查效率。方法應(yīng)用熒光定量PCR對(duì)2019年7月至2021年6月5302例育齡婦女進(jìn)行SMN1基因E7和E8的拷貝數(shù)檢測(cè)。結(jié)果113例育齡婦女SMN1基因存在雜合缺失（113/5302，2.13%），其中87例E7和E8同時(shí)缺失（87/5302，1.64%），24例E8單獨(dú)缺失（24/5302，0.45%），2例E7單獨(dú)缺失（2/5302，0.04%）;85名伴侶被召回檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2對(duì)夫婦均存在E7雜合缺失，2例孕婦接受產(chǎn)前診斷，最終確診1例SMA胎兒。結(jié)論常州地區(qū)SMN1基因雜合缺失發(fā)生率與已報(bào)道的漢族人群相近，熒光定量PCR可以用于SMA攜帶者篩查。

【關(guān)鍵詞】脊髓肌萎縮癥;SMN1蛋白;出生缺陷防治;攜帶頻率

中圖分類號(hào)：R715.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.05.007

Analysis on screening results of spinal muscular atrophy in

5302 women of childbearing age in Changzhou

JIA Chenbo， YUAN Xiaosong， ZHANG Bin， CHEN Wenyi

（Department of Medical Genetics， Changzhou Maternity and Child Health Care Hospital

Affiliated to Nanjing Medical University， Changzhou 213000， Jiangsu， China）

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the carrying rate and screening efficiency of survival motor neuron gene （SMN1） deletion in spinal muscular atrophy （SMA） in Changzhou. MethodsFluorescence quantitative PCR was used to detect the copy numbers of E7 and E8 of SMN1 gene in 5302 women of childbearing age from July 2019 to June 2021. ResultsThere were 113 cases with heterozygous deletion in those women （113/5302， 2.13%）， including 87 cases of simultaneous loss of E7 and E8 （87/5302， 1.64%）， 24 cases of single deletion of E8 （24/5302， 0.45%） and 2 cases of single deletion of E7 （2/5302， 0.04%）. 85 partners were recalled for detection， and it was found that 2 couples had E7 heterozygous deletion， 2 pregnant women underwent prenatal diagnosis， and 1 SMA fetus was diagnosed finally. ConclusionThe incidence of loss of heterozygosity of SMN1 gene in Changzhou is similar to that of the reported Han population， and fluorescent quantitative PCR can be used to screen SMA carriers.

【Key words】SMA; SMN1 protein; prevention and treatment of birth defects; carrying frequency

脊髓肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）是主要表現(xiàn)為進(jìn)行性、對(duì)稱性肌無力和肌萎縮的神經(jīng)變性的一種常見的致死性神經(jīng)肌肉遺傳病，該病臨床表現(xiàn)差異較大[1]。SMA的主要致病基因被確認(rèn)為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因（SMN1），5號(hào)染色體長(zhǎng)臂1區(qū)是其定位之處，編碼SMN蛋白，同時(shí)還有該病的修飾基因SMN2也會(huì)被克隆[2]。SMA 患兒約有95%存在著SMN1基因第7外顯子的純合性缺失，由SMN1基因點(diǎn)突變?cè)斐傻幕純杭s占5%[3～5]。常州市婦幼保健院于2019年7月開通了SMA基因篩查檢測(cè)平臺(tái)，為需要進(jìn)行出生缺陷防治的育齡人群提供一項(xiàng)選擇。本研究旨在分析近年來常州地區(qū)SMA的篩查結(jié)果，探討本地區(qū)的SMN1基因的攜帶頻率。

1對(duì)象與方法1.1對(duì)象2019年7月至2021年6月來常州市婦幼保健院進(jìn)行SMA篩查的育齡人群5302例，其中女性年齡16～49周歲，孕婦孕周4～26 W，召回的男性伴侶年齡21～43周歲。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有育齡人群及家屬均知情同意。

1.2試劑與儀器SMN1外顯子缺失檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，國(guó)械注準(zhǔn)：20153402293，上海五色石醫(yī)學(xué)研究股份有限公司），DNA核酸試劑提取盒（江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司），熒光定量PCR儀（ABI-QuantStudio5）。

1.3方法

1.3.1基因組DNA的提取使用紫色抗凝管（EDTA-K2）采集篩查對(duì)象5 mL外周靜脈血，采用DNA核酸試劑提取盒提取外周血DNA基因組，用Nano-100分光光度計(jì)測(cè)定各基因組DNA濃度，并稀釋濃度（10～20 ng/μL），OD260 nm/OD280 nm的比值范圍為1.8～2.0。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)運(yùn)用SMN1外顯子缺失檢測(cè)試劑盒對(duì)SMN1基因的拷貝數(shù)進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。以RPP40基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)基因，利用熒光定量PCR法分別對(duì)SMN1基因第7外顯子（E7）和第8外顯子（E8）進(jìn)行拷貝數(shù)相對(duì)定量?？截悢?shù)通過系統(tǒng)軟件讀取，結(jié)果無偏倚，無需矯正。反應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照品（空白對(duì)照品），陽(yáng)性對(duì)照品（缺失對(duì)照品）以及正常對(duì)照品（梯度為1∶2∶4）DNA。每個(gè)反應(yīng)體系為4.0 μL（DNA）+ 2.0 μL（反應(yīng)液）+10 μL（主反應(yīng)混合液）+1.2 μL（反應(yīng)輔助液）+去離子水（2.8 μL），總計(jì)為20 μL的反應(yīng)體系。反應(yīng)體系配置完成后，需要進(jìn)行振蕩30 s，再用轉(zhuǎn)速為2000 r/min的離心機(jī)離心10 s，再放入ABI-QuantStudio5熒光定量PCR儀。PCR擴(kuò)增反應(yīng)：95℃熱啟動(dòng)（95℃，10 min，循環(huán)數(shù)：1），變性（95℃，15 s，40個(gè)循環(huán)），退火與延伸（58℃，1 min，循環(huán)數(shù)：40），實(shí)時(shí)收集FAM通道和VIC通道的熒光信號(hào)（分別為目的基因和內(nèi)標(biāo)基因）。

1.3.3結(jié)果判讀首先分別計(jì)算各個(gè)梯度對(duì)照品E7反應(yīng)和E8反應(yīng)中目的基因與內(nèi)標(biāo)基因間的ΔCt值（ΔCt=Ct-Ct），再計(jì)算出正常對(duì)照品3個(gè)梯度的ΔCt值的平均值（ΔCt），之后再計(jì)算待測(cè)樣品目的基因與內(nèi)參基因Ct值之差（ΔCt），最后算出ΔΔCt（ΔΔCt=ΔCt-ΔCt）。ΔΔCt值>0.8為純合缺失;-0.5～0.5之間為雜合缺失，<-0.6時(shí)判定為未見缺失（見圖1[6]）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法重點(diǎn)隨訪SMA基因攜帶者并通知其相關(guān)信息等。采用EXCEL表記錄個(gè)人信息，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行排序整理。 圖1E7和E8未缺失、雜合缺失、純合缺失時(shí)的圖像

2結(jié)果2.1SMA攜帶者篩查結(jié)果113例育齡婦女SMN1基因存在雜合缺失（113/5302，2.13%），對(duì)這類孕婦的結(jié)果進(jìn)行復(fù)檢，真陽(yáng)性篩查效率為100%。其中87例E7和E8同時(shí)缺失（87/5302，1.64%），24例E8單獨(dú)缺失（24/5302，0.45%），2例E7單獨(dú)缺失（2/5302，0.04%），5302例育齡婦女中有89例孕婦被確認(rèn)為攜帶者（89/5302，1.68%），具體缺失類型見表1和表2。

2.2SMA攜帶者產(chǎn)前診斷結(jié)果85名伴侶被召回檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2對(duì)夫婦均存在E7雜合缺失，2例孕婦接受產(chǎn)前診斷，最終確診1例SMA胎兒。確診胎兒的羊水結(jié)果顯示為E7純合缺失，E8雜合缺失，利用MLPA方法分別對(duì)胎兒父親（見圖2）、胎兒母親（見圖3）以及胎兒羊水（見圖4）進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證，兩種方法結(jié)果一致。

3討論脊髓肌萎縮癥是常發(fā)于兒童的一種常染色體隱性遺傳病，多伴有致死性，攜帶者頻率為1/35～1/50，發(fā)病率為1/10 000～1/15 000[7]?；加蠸MA1型是最常見也是最嚴(yán)重的亞型，在6個(gè)月前發(fā)病，從未學(xué)會(huì)獨(dú)立坐著，在無呼吸支持的背景下，極少有能在生命的前兩年存活下來的[8]。因此，進(jìn)行SMA攜帶者人群篩查是目前針對(duì)這類疾病最行之有效的方法之一。

本研究對(duì)常州地區(qū)5302名育齡婦女進(jìn)行了SMA攜帶者篩查，篩查出89例為攜帶者，成功阻斷了1例SMA新生兒患兒的出生，并確定了本地區(qū)的攜帶頻率為1∶59。另外本研究對(duì)這些攜帶者進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果一致，真陽(yáng)性篩查效率為100%。需要產(chǎn)前診斷的2例均進(jìn)行了多種方法驗(yàn)證，結(jié)果相符。目前SMA攜帶者篩查在以色列、美國(guó)[9]、中國(guó)臺(tái)灣省[10]等國(guó)家及地區(qū)都已經(jīng)進(jìn)入臨床常規(guī)篩查，這些篩查結(jié)果表明人群和種族的差異會(huì)帶來SMA攜帶者頻率之間的差異。近幾年上海（90/4719，1∶52）[11]、廣西（61/4931，1∶61）[12]、陜西（123/6609，1∶54）[13]及云南地區(qū)（62/3049，1∶49）[14]分別報(bào)道了所在地區(qū)的SMA篩查結(jié)果，除廣西地區(qū)外其他地區(qū)結(jié)果均與本研究相接近（廣西地區(qū)分析原因可能是樣本量不足，隨著樣本量的增加頻率會(huì)接近上述其他地區(qū)），另外江蘇南京地區(qū)[15]最近剛報(bào)道了所在地區(qū)的篩查攜帶頻率為1∶58，與我院所報(bào)道的數(shù)據(jù)相接近。

我國(guó)是人口大國(guó)，因此導(dǎo)致SMA攜帶者也有巨大的數(shù)目，由于潛在的傳遞致病基因，此類人群會(huì)有生育SMA患兒的風(fēng)險(xiǎn);其次SMA疾病臨床癥狀嚴(yán)重，病死率高，加重家庭負(fù)擔(dān);降低SMA發(fā)病率的有效途徑就是進(jìn)行SMA篩查。另外還需要建立完善的疾病預(yù)防體系，最終讓本國(guó)人群SMA的發(fā)病率降至最低。參考文獻(xiàn)[1] LUNN M R，WANG C H.Spinal muscular atrophy[J].Lancet，2008，371（9630）：2120-2133.

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（收稿日期：2021-09-07修回日期：2021-12-31）

（編輯：潘明志）