金邊紅苞鳳梨葉片的超微觀察和AbGLK1 的克隆與表達(dá)分析

毛美琴, 薛彥斌, 胡豪, 周徐子鑫, 馬均

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，成都 611130)

紅苞鳳梨(Ananas comosusvar.bracteatus)為鳳梨科(Bromeliaceae)鳳梨屬多年生地生性常綠草本,原產(chǎn)于南美洲，株型優(yōu)美，果實(shí)紅艷，是重要的熱帶觀賞植物[1]。金邊紅苞鳳梨(A. comosusvar.bracteatus‘Chiyan’)是經(jīng)長期栽培而選育出的葉色嵌合品種，葉片中央為綠色，邊緣為白色，綠白條紋嵌合的葉色特征使得金邊紅苞鳳梨葉果兼賞，延長了觀賞期，提高了觀賞價(jià)值。除了觀賞價(jià)值，葉片的綠白嵌合特征在植物光合作用機(jī)理、激素生理、核-質(zhì)基因組相互作用、遺傳育種等理論研究和實(shí)際應(yīng)用中均具有無可替代的價(jià)值[2]。我們的前期研究表明，金邊紅苞鳳梨葉片邊緣白化組織的光合色素含量近趨于0，均極顯著低于綠色組織[3]。徒手切片顯微觀察發(fā)現(xiàn)，金邊紅苞鳳梨葉片邊緣白化組織的葉肉細(xì)胞為無色透明狀，未見明顯的葉綠體分布[4]。葉綠體的發(fā)育異常會導(dǎo)致植物發(fā)生葉色突變[5]。花葉矢竹(Pseudosasa japonicaf.akebonosuji)白葉質(zhì)體類囊體片層垛疊程度低，曝光成熟后降解成小囊泡，使葉綠體形成障礙，是葉色變異的生理本質(zhì)[6]。茶樹(Camellia sinensis) ‘小雪芽’白化葉片的葉綠體發(fā)育異常，體積膨脹變大，并且基粒片層和類囊體膜結(jié)構(gòu)發(fā)育受阻，出現(xiàn)囊狀空泡[7]。因此，金邊紅苞鳳梨葉片邊緣組織的白化和綠白嵌合性狀的形成可能與葉肉細(xì)胞葉綠體的發(fā)育緊密相關(guān)。Golden2-like (GLK)蛋白是核基因組中調(diào)控葉綠體發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子[8]。研究表明，擬南芥glk1glk2雙突變體全株褪綠，葉綠素含量顯著下降, 葉綠體橫截面積約是野生型的50%，并且其堆疊的基粒高度降低[8]。自從擬南芥(Arabidopsis thaliana)中克隆出AtGLK1和AtGLK2后，其他物種，如水稻(Oryza sativa)、番茄(Lycopersicon esculentum)、小立碗蘚(Physcomitrella patens)等的鑒定和表征分析工作也不斷進(jìn)行[8-14]。

本研究以金邊紅苞鳳梨為材料，對其葉片進(jìn)行了超微結(jié)構(gòu)觀察，并克隆了AbGLK1基因，對其編碼的AbGLK1 蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)、轉(zhuǎn)錄激活活性和亞細(xì)胞定位分析，利用RT-qPCR檢測了AbGLK1基因在金邊紅苞鳳梨不同組織中的表達(dá)水平，分析了AbGLK1基因的表達(dá)與金邊紅苞鳳梨嵌合葉片葉綠體發(fā)育的關(guān)系，為進(jìn)一步研究AbGLK1基因調(diào)控金邊紅苞鳳梨葉綠體發(fā)育的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料金邊紅苞鳳梨(Ananas comosusvar.bracteatus‘Chiyan’)購于廣東省湛江市，在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院溫室大棚(成都，中國)進(jìn)行養(yǎng)護(hù)管理，選用長勢一致，無病蟲害，嵌合性狀明顯的植株。分別采集金邊紅苞鳳梨根、莖以及同一成熟功能葉片的綠色組織和白化組織后用液氮速凍,置于-80 ℃冰箱保存，用于RNA 提取。剪下成熟功能葉片，插入水中，帶回實(shí)驗(yàn)室做徒手切片和透射電鏡。

1.2 超微結(jié)構(gòu)觀察

橫向截取葉片中間綠、白分界清晰部分2~3 cm,采用雙面刀片進(jìn)行徒手切片，將切好的薄片做成簡易切片，置于激光共聚焦顯微系統(tǒng)下觀察葉片葉綠體自發(fā)熒光并拍照。激發(fā)波長488 nm，孔徑8.0μm，共振頻率7.8 Hz。

將嵌合葉片的綠色組織和白化組織分別切成1 mm×1 mm 小塊放入3% (V/V)戊二醛中，于4 ℃冰箱中保存。透射電鏡樣品制備參考李春雷和倪德江的方法，用LEICADC61C 超薄切片機(jī)切片，在JEM-1010 電子顯微鏡下觀察葉綠體超微結(jié)構(gòu)[15]。

1.3 AbGLK1 基因的克隆

總RNA的提取和cDNA的合成采用LAB GENETM植物RNA 提取試劑盒(多糖多酚樣本，蘭博基因)提取樣品的總RNA，提取的總RNA 經(jīng)Nano Drop 2000 spectrophotometer (Thermo Scientific)和1.2%的凝膠電泳檢測合格后，以其為模板，利用Evo M-MLV RT Kit whit gDNA Clean for qPCR Ⅱ試劑盒(艾科瑞生物)合成cDNA，置于-20 ℃冰箱保存。

基因克隆在已獲得的金邊紅苞鳳梨轉(zhuǎn)錄組信息的基礎(chǔ)上，利用Premier premier 5.0 設(shè)計(jì)引物(表1)，以金邊紅苞鳳梨葉片cDNA 為模板進(jìn)行AbGLK1基因開放閱讀框(ORF)全長擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系(25μL)：cDNA 模板1μL，上下游引物各1μL, Mix(green)Golden Star T6 Super PCR Mix(1.1×) 22μL (擎科生物)。PCR 反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性2 min；然后98 ℃變性10 s，53.5 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸1 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過電泳和膠回收后，連接到克隆載體pClone007 (擎科生物)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)。挑取PCR 檢測陽性的菌液送至成都擎科公司測序。

表1 引物列表Table 1 Primer list of this study

1.4 生物信息學(xué)分析和進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用NCBI 上的ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找AbGLK1的開放閱讀框,并推測其氨基酸序列；運(yùn)用ExPASy ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析AbGLK1 蛋白的理化性質(zhì)；使用ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)分析氨基酸的疏水性與親水性；通過NetPhos 2.0 Server (https://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)預(yù)測磷酸化位點(diǎn)；通過SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/sespredsopma.pl)預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；通過SignalP 4.1 Server (https://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)進(jìn)行信號肽預(yù)測；利用TMHMM Server 對蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(https://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0guide.html);

利用PSORT Ⅱ S erver (https://www.genscript.com/psort.html)進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位分析；利用NCBI 上的blastp 程序查找AbGLK1 蛋白在不同植物中的同源序列，并利用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行多重序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.5 AbGLK1 蛋白亞細(xì)胞定位分析

將亞細(xì)胞定位載體和p131-35s-YFP 空載轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)。轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌菌液過夜擴(kuò)搖，離心，棄上清，用相同菌液體積懸浮液(10 mmol/L MgCl2，100μmol/L AS，10 mmol/L MES)重懸菌體，室溫靜置3 h 后注射4~5 葉期的本氏煙草(Nicotiana benthamiana)葉片。注射3~5 d 后，以p131-35s-YFP空載為對照，利用激光共聚焦顯微鏡觀察帶有黃色熒光標(biāo)記的AbGLK1 蛋白在煙草葉片中的分布情況。

1.6 AbGLK1 蛋白轉(zhuǎn)錄激活活性分析

將陽性對照pGBKT7-53+pGADT7-T、陰性對照pGBKT7-Lam+pGADT7-T和重組誘餌載體pGBKT7-AbGLK1 分別轉(zhuǎn)入Y2H Gold 酵母感受態(tài)(維地生物)中，并涂布于相應(yīng)的缺陷型固體培養(yǎng)基上，倒置于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3~5 d，觀察其生長情況。挑取直徑為2~3 mm 的單菌落接種到Y(jié)PDA 液體培養(yǎng)基中，于30 ℃，250 r/min 搖床培養(yǎng)12 h，分別稀釋0、10、100 倍，均勻點(diǎn)樣于相應(yīng)的含有100 ng/mL AbA 的SD/-Trp/-Leu/X-α-gal 和SD/-Trp/X-α-gal 缺陷型固體培養(yǎng)基上，觀察菌斑生長情況，以判斷能否激活報(bào)告基因。

1.7 AbGLK1 基因的表達(dá)分析

利用RT-qPCR技術(shù)檢測AbGLK1基因在金邊紅苞鳳梨不同組織中的表達(dá)情況。以金邊紅苞鳳梨不同組織(根、莖和同一葉片的綠色和白化組織)的cDNA 為模板，參照SYBR?Green PremixPro TaqHS qPCR Kit 說明書(艾科瑞生物)進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系25μL：2X SYBR? GreenPro TaqHS Premix 12.5μL，模板cDNA 1μL，上下游引物各0.5μL，RNase free water 10.5μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；然后95 ℃變性5 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3 次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3 次技術(shù)重復(fù)，采用2-ΔΔCT 法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果和分析

2.1 葉片中葉綠體的分布和超微結(jié)構(gòu)

葉綠體在反射光下呈現(xiàn)紅色，這種現(xiàn)象稱為葉綠素?zé)晒猬F(xiàn)象。在激光共聚焦顯微鏡下，葉片邊緣白化組織部分沒有檢測到紅色熒光(圖1: A)；葉片中心綠色組織部分絕大多數(shù)細(xì)胞發(fā)出紅色熒光，并能清晰地看到葉肉細(xì)胞內(nèi)密集分布著橢圓形葉綠體(圖1: C)，說明金邊紅苞鳳梨嵌合葉片白化組織沒有結(jié)構(gòu)完整、能夠發(fā)出葉綠素?zé)晒獾娜~綠體。為了進(jìn)一步弄清綠、白組織中葉綠體結(jié)構(gòu)的差異，采用透射電鏡檢測了葉片綠色組織和白化組織的葉綠體超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明白化組織葉肉細(xì)胞中的葉綠體結(jié)構(gòu)異常，內(nèi)膜系統(tǒng)模糊，無類囊體存在，含有大量囊狀小泡，質(zhì)體小球數(shù)量多且體積較大(圖1: B)。而綠色組織葉肉細(xì)胞中的葉綠體結(jié)構(gòu)完整，呈梭狀或長橢圓形，能清晰見到淀粉粒，內(nèi)膜形成豐富的基粒類囊體，基粒片層結(jié)構(gòu)明顯且排列整齊，質(zhì)體小球零星分布在葉綠體內(nèi)(圖1: D)。這說明金邊紅苞鳳梨葉片白化組織葉綠體的類囊體膜和基粒片層未發(fā)育成熟，導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)異常，不能正常積累葉綠素，從而表現(xiàn)出白化表型。

圖1 金邊紅苞鳳梨葉片中葉綠體的分布(A, C)和超微結(jié)構(gòu)(B, D)。A, B: 白化組織; C, D: 綠色組織; Ch: 葉綠體; Gr: 基粒; SG: 淀粉粒; P: 質(zhì)體小球; V:囊泡。Fig. 1 Distribution (A, C) and ultrastructure (B, D) of chloroplast in leaves of Ananas comosus var. bracteatus ‘Chiyan’. A, B: Albino tissue; C, D: Green tissue.Ch: Chloroplast; Gr: Grana; SG: Starch granule; P: Plastoglobulus; V: Vesicles.

2.2 AbGLK1 基因的克隆

金邊紅苞鳳梨葉片邊緣白化組織表現(xiàn)出典型的葉綠體發(fā)育異常現(xiàn)象，是其葉片白化的關(guān)鍵原因。GLK基因是核基因組中調(diào)控葉綠體發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子。為揭示葉片邊緣白化組織葉綠體發(fā)育異常的分子調(diào)控機(jī)制，對金邊紅苞鳳梨中的AbGLK1進(jìn)行ORF 全長擴(kuò)增，得到1 個(gè)約1 500 bp 的目的片段，片段大小與預(yù)期一致。測序結(jié)果表明,AbGLK1基因含有1 個(gè)1 371 bp 的開放閱讀框，編碼456 個(gè)氨基酸(圖2)。

2.3 AbGLK1 氨基酸序列的多重比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI 數(shù)據(jù)庫中使用blastp 檢索不同植物中GLK 蛋白的同源序列，比對結(jié)果表明，AbGLK1的氨基酸序列與菠蘿(A. comosusvar.comosus, XP_020100867.1)的相似性最高(99.12%)，其次是海棗(Phoenix dactylifera, XP_008783138.1, 60.7%)和油棕(Elaeis guineensis, XP_010916010.1, 60.35%)，與胡桃(Juglans regia, XP_018834281.1)、小果野蕉(Musa acuminatasp. malaccensis, XP_009381033.1)、蓮(Nelumbo nucifera, XP_010260326.1)、木犀欖(Olea europaeavar. sylvestris, XP_022877228.1)、阿月渾子(Pistacia vera, XP_031255395.1)、胡楊(Populus euphratica, XP_011047697.1)、棗(Ziziphus jujube,XP_015881406.1)、哥倫比亞錦葵(Herrania umbratica, XP_021279775.1)等的相似度較低，約為50%~60%。利用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行多重序列比對，結(jié)果表明，AbGLK1 蛋白和其他物種的GLK 蛋白都含有高度保守的GARP-DNA 結(jié)合域和C 末端結(jié)構(gòu)域GCT box (GOLDEN2 C-terminal box)，符合GLK轉(zhuǎn)錄因子家族的典型結(jié)構(gòu)特征。位于N 末端的GARPDNA 結(jié)合域包含1 個(gè)HLH 基序，第1 個(gè)螺旋由以PELHRR 基序?yàn)槠鹗嫉?4 個(gè)氨基酸組成，第2 個(gè)螺旋以NI/VASHLQ 基序?yàn)槠鹗迹? 個(gè)螺旋中間是包含22 個(gè)氨基酸的環(huán)(圖3)。

圖3 金邊紅苞鳳梨AbGLK1 與其他植物GLK 蛋白的氨基酸序列多重比對分析。紅色方框?yàn)楸Ｊ氐腉ARP-DNA 結(jié)合域，橙色方框?yàn)楸Ｊ氐腉CT box。Fig. 3 Multiple alignment of amino acid sequences of AbGLK1 in Ananas comosus var. bracteatus ‘Chiyan’ and GLK proteins in other plants. The red boxes show the conserved GARP-DNA binding domain, and orange boxes show the conserved GCT binding domain.

為研究AbGLK1 在GLK 轉(zhuǎn)錄因子家族中的系統(tǒng)進(jìn)化地位，利用MEGA 7.0 軟件中的Neighborjoining 方法分析AbGLK1 蛋白與擬南芥(NP_00118 9562.1, NP_199232.1)、番茄(NP_001266193.1, NP_001266252.1)、桃(Prupe.3G127700)、水稻(XP_01564 4244.1, XP_015615913.1)、玉米(NP_001105513.1,NP_001105018.1)、菠蘿(XP_020100867.1)間的進(jìn)化關(guān)系。由圖4 可知，AbGLK1 轉(zhuǎn)錄因子與菠蘿的GLK親緣關(guān)系最近。金邊紅苞鳳梨、菠蘿、玉米、水稻等單子葉植物的GLK 聚為一支，而擬南芥、桃、番茄等雙子葉植物的GLK 間的距離較遠(yuǎn)，說明單、雙子葉植物的GLK 同源蛋白有明顯差異。此外,在單子葉分支中，AbGLK1 與玉米ZmGLK1 和水稻OsGLK1 聚為同一亞支，說明AbGLK1 可能與ZmGLK1 以及OsGLK1 有著相似的功能。

圖4 金邊紅苞鳳梨AbGLK1 與其他植物GLK 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of AbGLK1 in Ananas comosus var. bracteatus ‘Chiyan’ and GLK proteins in other plants

2.4 AbGLK1 蛋白的生物信息學(xué)分析

AbGLK1 蛋白由20 種氨基酸組成，其中含量最高的是脯氨酸(Pro, 11.8%)和絲氨酸(Ser, 9.2%)。該蛋白原子總數(shù)為6 822，分子量為49.090 kDa，推測分子式為C2153H3369N621O662S17，理論等電點(diǎn)為5.79, 酸性氨基酸(Asp+Glu)占12.5%，堿性氨基酸(Arg+Lys)占9.87%，不穩(wěn)定指數(shù)為66.09，脂肪系數(shù)為69.52。氨基酸親水性(負(fù)值)和疏水性(正值)全部分布在-3.233~1.589，其中峰值分布在負(fù)值的比例明顯高于峰值分布在正值的比例，平均親水指數(shù)為-0.508，說明該蛋白為親水性蛋白。親水性最強(qiáng)的位點(diǎn)和疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)分別是第153、154 位的天冬氨酸(Asn)、精氨酸(Arg)和第362、363 位的丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測表明,AbGLK1 蛋白含有32 個(gè)絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn),13 個(gè)蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)以及3 個(gè)酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)。信號肽序列和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明該蛋白沒有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)。二級結(jié)構(gòu)表明,該蛋白存在豐富的無規(guī)卷曲(64.69%)和α-螺旋(26.97%)，而延伸鏈(5.70%)和β-轉(zhuǎn)角(2.63%)相對較少。

2.5 AbGLK1 蛋白的亞細(xì)胞定位分析

為明確AbGLK1 轉(zhuǎn)錄因子在植物細(xì)胞中的定位情況，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究，通過激光共聚焦顯微鏡觀察侵染后煙草葉片中的熒光信號分布情況。從圖5 可見,帶有黃色熒光標(biāo)記的AbGLK1 蛋白主要分布于細(xì)胞核中，而對照的熒光信號在整個(gè)細(xì)胞中均能被檢測到，這說明AbGLK1 定位在細(xì)胞核中，與PSORTⅡServer 的預(yù)測結(jié)果一致。

圖5 金邊紅苞鳳梨AbGLK1 的亞細(xì)胞定位。A: 明場; B: 細(xì)胞核定位maker 的熒光場; C: AbGLK1 黃色熒光蛋白; D: 3 個(gè)通道的疊加; E~H: 空載體對照。Fig. 5 Subcellular localization of AbGLK1 in Ananas comosus var. bracteatus ‘Chiyan’. A: Bright field; B: Nuclei-maker; C: AbGLK1 YFP; D: Merged signal of the three channels; E-H: Empty vector control.

2.6 AbGLK1 蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性分析

轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域可以抑制或者激活基因的轉(zhuǎn)錄活性，但是有的轉(zhuǎn)錄因子可能不含有轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域[16]。從圖6 可見，陽性對照和陰性對照在SD/-Trp/-Leu 培養(yǎng)基上均能正常生長。在SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA 培養(yǎng)基上，只有陽性對照能夠正常生長，而陰性對照不能生長。轉(zhuǎn)化了pGBKT7-AbGLK1 載體的Y2HGold 酵母細(xì)胞在SD/-Trp 和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA 培養(yǎng)基上均能生長。這說明AbGLK1 蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性，促使下游報(bào)告基因AbAr和MEL1表達(dá)，從而使酵母細(xì)胞在添加了AbA 和X-α-Gal 時(shí)仍然可以生長并且顯藍(lán)色。蛋白轉(zhuǎn)錄激活活性的驗(yàn)證說明AbGLK1 具備轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控下游基因表達(dá)的基本功能，能夠通過結(jié)合下游靶基因的啟動子，啟動下游靶基因的表達(dá)。

圖6 金邊紅苞鳳梨AbGLK1 的轉(zhuǎn)錄激活活性Fig. 6 Transcriptional activation assay of AbGLK1 in Ananas comosus var. bracteatus ‘Chiyan’

2.7 AbGLK1 基因的表達(dá)分析

從圖7 可見，AbGLK1在金邊紅苞鳳梨的根、莖和葉片中均有表達(dá)，但具有組織器官差異性。AbGLK1在根中的表達(dá)水平最低，莖中的表達(dá)水平是根中的33.29 倍。嵌合葉片綠色組織和白化組織中的表達(dá)水平都顯著高于根和莖(P<0.05)，分別是根的176.64 和63.93 倍。金邊紅苞鳳梨的嵌合葉片分化成為了具有完整葉綠體結(jié)構(gòu)、富含葉綠素的綠色組織和葉綠體發(fā)育異常、不含葉綠素的白化組織。AbGLK1基因在邊緣白化組織中的表達(dá)水平顯著低于綠色組織，約為綠色組織的1/3 (P<0.05)。這說明AbGLK1基因的下調(diào)表達(dá)可能是白化組織葉綠體發(fā)育異常的原因之一。

圖7 金邊紅苞鳳梨AbGLK1 基因的表達(dá)。柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Fig. 7 Expression of AbGLK1 in Ananas comosus var. bracteatus ‘Chiyan’.Different letters upon column indicate significant difference at 0.05 level.

3 結(jié)論和討論

在本研究中，金邊紅苞鳳梨葉片白化組織葉綠體內(nèi)膜解體、呈囊泡狀結(jié)構(gòu), 無明顯基粒結(jié)構(gòu)，也無完整類囊體片層結(jié)構(gòu)，在結(jié)構(gòu)上屬于不正常的葉綠體。這與之前的研究類似，水稻白化突變體葉肉細(xì)胞內(nèi)都是囊狀空泡，沒有葉綠體[17]；返白系小麥(Triticum aestivum)葉綠體的類囊體發(fā)育處于停滯狀態(tài)，未發(fā)育出明顯的片層結(jié)構(gòu)[18]。葉綠體類囊體膜是1 個(gè)由各種葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合體高度構(gòu)成的有組織性體系，是葉綠素的載體[19]。葉綠體內(nèi)膜系統(tǒng)降解，致使膜蛋白復(fù)合物不能穩(wěn)定存在于葉綠體內(nèi)，葉綠素也不能正常累積[6]。因此, 葉綠體發(fā)育不成熟會導(dǎo)致葉綠素不能正常累積, 這可能是金邊紅苞鳳梨白化組織形成的直接原因。

葉綠體發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要核基因組和質(zhì)體基因組共同調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控葉綠體發(fā)育的過程中發(fā)揮了重要作用，GLK 蛋白是核基因組中調(diào)控葉綠體發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子[8]。GLK基因在原始的開花植物中是以單個(gè)基因形式存在的，后來在某些物種中GLK基因進(jìn)行了復(fù)制[20]。本研究首次從金邊紅苞鳳梨中克隆了AbGLK1基因。AbGLK1定位在細(xì)胞核，并通過酵母系統(tǒng)驗(yàn)證了AbGLK1 具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游基因表達(dá)的功能。擬南芥AtGLK1主要通過結(jié)合啟動子中的CCAATC 特異性序列來激活核基因的表達(dá)[21]。通過系統(tǒng)進(jìn)化分析，找到進(jìn)化距離較近的已知功能的轉(zhuǎn)錄因子，可以為其功能研究提供參考[22]。在本研究中，AbGLK1 與玉米ZmGLK1、水稻OsGLK1 聚為同一亞支，且與水稻OsGLK1距離更近，暗示AbGLK1可能與水稻OsGLK1有著相似的功能。Nakamura 等[23]提出OsGLK1 調(diào)節(jié)葉綠體的發(fā)育是通過提高核編碼的葉綠體相關(guān)基因的表達(dá)水平，同時(shí)還通過提高核編碼的sigma因子的表達(dá)水平來促進(jìn)質(zhì)體編碼光合作用相關(guān)基因的表達(dá)。由此推測AbGLK1 可能通過激活核編碼葉綠體相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)控金邊紅苞鳳梨的葉綠體發(fā)育。金邊紅苞鳳梨AbGLK1的表達(dá)量在葉片中最高，其次是莖，在根中最低，這與擬南芥、水稻和玉米等的研究結(jié)果一致，即AbGLK1基因具有組織器官特異性，主要在光合組織中表達(dá)。對比金邊紅苞鳳梨葉片綠色組織和白化組織中AbGLK1基因的表達(dá)，綠色組織的表達(dá)量高于白化組織，類似的表達(dá)特征也出現(xiàn)在茶樹淺綠突變體、銀杏(Ginkgo biloba)變異黃葉、紫薇(Lagerstroemia indica)黃葉突變體以及紅掌(Anthurium andraeanum)白化突變體等中其他葉色突變中[24-27]。樺樹(Betula platyphylla×B. pendula)黃綠突變體yl中存在1 個(gè)含有BpGLK1的40 kb 缺失，互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)了BpGLK1基因是樺樹葉綠體發(fā)育和葉綠素合成的重要調(diào)控因子，在葉片失綠突變中發(fā)揮重要作用[28]。因此，AbGLK1基因的下調(diào)表達(dá)可能是金邊紅苞鳳梨白化組織葉綠體發(fā)育不成熟的潛在原因之一。

本研究以金邊紅苞鳳梨為研究對象，葉片超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)白化組織葉綠體發(fā)育不成熟。生物信息學(xué)分析表明,AbGLK1基因開放閱讀框全長1 371 bp, 編碼456 個(gè)氨基酸，具備GLK 蛋白的結(jié)構(gòu)域特征。亞細(xì)胞定位分析和轉(zhuǎn)錄激活檢測結(jié)果表明，AbGLK1定位于細(xì)胞核并具有轉(zhuǎn)錄激活能力。RT-qPCR 分析表明，AbGLK1基因的表達(dá)具有組織器官差異性, 且綠色組織的表達(dá)水平高于白化組織，由此推測AbGLK1低水平表達(dá)可能是金邊紅苞鳳梨葉片邊緣白化組織葉綠體發(fā)育不成熟的潛在原因之一。這為探究AbGLK1調(diào)控金邊紅苞鳳梨葉綠體發(fā)育的分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。接下來的工作重點(diǎn)是利用反向遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的技術(shù)手段，構(gòu)建AbGLK1介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示金邊紅苞鳳梨綠白嵌合葉片形成的分子機(jī)理。