和田部分地區(qū)和田黑雞3種球蟲分子檢測(cè)與鑒定

宋顯明，信璐瑤，侯旻昱，鄧金華，方 晨，李澤宇，趙永旭，齊 萌*

(1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉 831199；2.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300)

雞球蟲病是由艾美耳屬球蟲引起的腸道原蟲病，主要表現(xiàn)為食欲減退、貧血、血便、消瘦和生產(chǎn)性能下降等臨床癥狀，致死率較高，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)健康持續(xù)發(fā)展[1]?？筛腥倦u的7種球蟲中，以柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)和毒害艾美耳球蟲(Eimerianecatrix)的致病力最強(qiáng)，病死率可達(dá)80.0%以上；布氏艾美耳球蟲(Eimeriabrunetti)可引起致死性血性腹瀉；堆型艾美耳球蟲(Eimeriaacervulina)、巨型艾美耳球蟲(Eimeriamaxima)、和緩艾美耳球蟲(Eimeriamitis)及早熟艾美耳球蟲(Eimeriapraecox)致病性較弱，一般不引起明顯臨床癥狀和病理變化[2]。自然情況下，雞球蟲感染多呈混合感染，在不同國(guó)家和地區(qū)流行的球蟲種類存在差異。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，多種宿主源球蟲均可進(jìn)行特異種類鑒定，并可進(jìn)行種系發(fā)育分析[3]。

和田黑雞是優(yōu)良的肉蛋兼用型地方品種雞，主要分布于和田地區(qū)民豐縣、洛浦縣和和田縣。在養(yǎng)殖過(guò)程中，受傳統(tǒng)養(yǎng)殖觀念影響，養(yǎng)殖戶對(duì)和田黑雞的疾病預(yù)防意識(shí)薄弱，飼養(yǎng)管理粗放，多種疾病?；旌习l(fā)生，導(dǎo)致死亡，造成一定的經(jīng)濟(jì)損失[4]。為了解和田黑雞柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲和布氏艾美耳球蟲的感染情況，采用PCR對(duì)和田部分地區(qū)和田黑雞糞便樣本DNA進(jìn)行檢測(cè)和序列分析，以期為該地區(qū)雞球蟲病的防治提供基礎(chǔ)參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 2020年6月至2021年4月，分別于和田縣、洛浦縣、民豐縣和墨玉縣的11個(gè)林下平養(yǎng)模式規(guī)模為2 000只～3 000只和田黑雞養(yǎng)殖戶收集雞糞便樣本，隨機(jī)采集雞剛排出的新鮮糞便樣本，每份糞便樣本2 g～5 g，每只雞計(jì)為1份樣本，裝入潔凈自封袋，編號(hào)，置于4 ℃冰箱保存。

1.1.3 主要儀器 T100型梯度PCR儀，凝膠成像系統(tǒng)儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；小型臺(tái)式高速離心機(jī)，艾本德股份公司產(chǎn)品；DYY-12型瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；電泳槽，北京君意東方電泳公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.2 球蟲的PCR擴(kuò)增和電泳分析 基于球蟲ITS基因位點(diǎn)，參考文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)的柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲和布氏艾美耳球蟲特異性引物，引物序列見表1，由蘇州金維智生物科技有限公司合成。對(duì)所有雞糞便樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系均為25 μL，包括2× EasyTaqPCR Super Mix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL。每次PCR擴(kuò)增均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照樣本為已鑒定保存的柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲和布氏艾美耳球蟲的DNA樣本，陰性對(duì)照為滅菌的雙蒸水。PCR產(chǎn)物檢測(cè)使用10 g/L的瓊脂糖凝膠，取5 μL第2輪PCR產(chǎn)物加入瓊脂糖凝膠孔中，110 V電壓電泳30 min。將凝膠取出放入紫外凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察并拍照。

表1 3種雞艾美耳球蟲特異性引物序列

1.2.3 序列分析和種類鑒定 所有成功擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物均進(jìn)行雙向測(cè)序，由蘇州金維智生物科技有限公司完成。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast同源序列搜索，用Clustal X 2.1軟件對(duì)所獲序列進(jìn)行比對(duì)分析，根據(jù)比對(duì)結(jié)果鑒定球蟲種類。下載相關(guān)球蟲同源序列，采用Mega X軟件，選擇鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建種系發(fā)育進(jìn)化樹，其可靠性用Bootstrap分析檢測(cè)，進(jìn)行1 000個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 和田黑雞3種球蟲感染情況

基于3種球蟲ITS基因位點(diǎn)，對(duì)449份和田黑雞糞便DNA樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)74份呈球蟲陽(yáng)性，感染率為16.5%(74/449)。11個(gè)采樣點(diǎn)中，10個(gè)均呈球蟲陽(yáng)性，以和田縣4的和田黑雞感染率最高，為40.9%(9/22)，而在墨玉縣1的和田黑雞樣本中未檢測(cè)出球蟲陽(yáng)性；不同采樣點(diǎn)和田黑雞球蟲感染率差異顯著(P<0.05)。其中，柔嫩艾美耳球蟲、布氏艾美耳球蟲和毒害艾美耳球蟲感染率分別為6.0%(27/449)、12.0%(54/449)和2.4%(11/449)，柔嫩艾美耳球蟲和布氏艾美耳球蟲混合感染率為1.6%(7/449)，布氏艾美耳球蟲和毒害艾美耳球蟲混合感染率為2.4%(12/449)，柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲和布氏艾美耳球蟲三者混合感染率為0.4%(2/449)(表2)。

表2 不同采樣點(diǎn)和田黑雞3種艾美耳球蟲感染情況

2.2 不同日齡和田黑雞3種球蟲感染情況

不同日齡和田黑雞球蟲感染率統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.05)，以40日齡～80日齡雞球蟲感染率最高，為20.4%(58/284)，2種和3種球蟲混合感染率分別為6.3%(18/284)和0.7%(2/284)，以布氏艾美耳球蟲感染率較高，為15.5%(44/284)；小于40日齡雞球蟲感染率為9.6%(11/115)，主要為柔嫩艾美耳球蟲和布氏艾美耳球蟲感染，感染率分別為6.1%(7/115)和4.3%(5/115)；大于80日齡雞球蟲感染率為10.0%(5/50)，主要為布氏艾美耳球蟲和毒害艾美耳球蟲感染，感染率分別為10.0%(5/50)和2.0%(1/50)(表3)。

表3 不同日齡和田黑雞3種艾美耳球蟲感染情況

2.3 球蟲序列分析和種類鑒定

25條柔嫩艾美耳球蟲序列經(jīng)比對(duì)分析，鑒定出2種序列，分別命名為E.tenella-Type1(n=8)和E.tenella-Type2(n=17)，2種序列存在1個(gè)堿基差異，分別與巴基斯坦雞源柔嫩艾美耳球蟲分離株序列(GenBank登錄號(hào)：MN830381)和印度雞源柔嫩艾美耳球蟲分離株序列(GenBank登錄號(hào)：GQ856298)同源性為100%。54條布氏艾美耳球蟲序列經(jīng)比對(duì)分析，均與印度雞源布氏艾美耳球蟲分離株序列(GenBank登錄號(hào)：GQ856292)和澳大利亞雞源布氏艾美耳球蟲分離株序列(GenBank登錄號(hào)：AF446057)同源性為100%。11株毒害艾美耳球蟲序列經(jīng)比對(duì)分析，均與廣東雞源毒害艾美耳球蟲分離株序列(GenBank登錄號(hào)：FJ449693)同源性為100%。

進(jìn)化樹顯示(圖1)，本調(diào)查中獲得的3種球蟲序列與雞源不同種類球蟲均處于同一個(gè)進(jìn)化支上。其中柔嫩艾美耳球蟲和毒害艾美耳球蟲序列形成一個(gè)亞群，布氏艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲和早熟艾美耳球蟲序列形成一個(gè)亞群，堆型艾美耳球蟲單獨(dú)形成一個(gè)亞群。

▲本研究中所獲序列

3 討論

不同國(guó)家和地區(qū)雞球蟲感染情況存在差異，但均普遍感染。在印度北部，Kumar S等[6]報(bào)道3個(gè)肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)雞球蟲感染率為81.3%(61/75)，以柔嫩艾美耳球蟲為優(yōu)勢(shì)感染種類。在日本，Matsubayashi M等[7]對(duì)21個(gè)縣37個(gè)肉雞、蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)雞球蟲總感染率為89.2%(33/37)，以布氏艾美耳球蟲為優(yōu)勢(shì)感染種類。Godwin R M等[8]對(duì)澳大利亞規(guī)模化場(chǎng)和散養(yǎng)條件下肉雞進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，規(guī)?；瘓?chǎng)肉雞球蟲的感染率為98.4%(123/125)，以堆型艾美耳球蟲為主要感染蟲種，而散養(yǎng)肉雞球蟲的感染率為80.7%(109/135)，以和緩艾美耳球蟲為優(yōu)勢(shì)蟲種。在我國(guó)，Lan L H等[9]報(bào)道浙江省5個(gè)地區(qū)規(guī)?；瘓?chǎng)平養(yǎng)肉雞球蟲總感染率為30.7%(95/310)，以柔嫩艾美耳球蟲為優(yōu)勢(shì)感染種類。Geng T等[10]報(bào)道河南省和湖北省18個(gè)地區(qū)規(guī)?；金B(yǎng)肉雞場(chǎng)中有16個(gè)呈球蟲陽(yáng)性，陽(yáng)性場(chǎng)雞球蟲最高感染率為97.2%(305/318)，河南省以和緩艾美耳球蟲為優(yōu)勢(shì)蟲種，而湖北省以柔嫩艾美耳球蟲為優(yōu)勢(shì)感染種類。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，和田4個(gè)地區(qū)11個(gè)和田黑雞養(yǎng)殖場(chǎng)有10個(gè)呈球蟲感染陽(yáng)性，3種致病性球蟲總感染率為16.5%(74/449)，低于上述報(bào)道雞球蟲感染率，這可能與本研究?jī)H檢測(cè)了3種球蟲，其他種類球蟲未檢測(cè)有關(guān)；發(fā)現(xiàn)和田黑雞感染以布氏艾美耳球蟲為優(yōu)勢(shì)感染種類，感染率為12.0%(54/449)，與上述報(bào)道相一致。

研究表明，雞球蟲的感染與雞群日齡有較大關(guān)系。陳麗鳳等[11]對(duì)秦皇島地區(qū)10個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)肉雞進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)15日齡～45日齡雞群為球蟲易感雞群。李微等[12]對(duì)哈爾濱地區(qū)218個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)球蟲感染率隨日齡的增長(zhǎng)逐漸增大，至60日齡感染率達(dá)到最高，為76.5%(52/68)，60日齡以上感染呈降低趨勢(shì)。王開勝等[13]對(duì)新疆昌吉地區(qū)15家養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)17日齡～62日齡的雞群球蟲感染率為100%。本研究發(fā)現(xiàn)40日齡～80日齡雞群球蟲感染率相對(duì)高于其他年齡段的雞群，感染率為20.4%(58/284)，與上述的調(diào)查結(jié)果基本相一致。不同地理環(huán)境、養(yǎng)殖方式、養(yǎng)殖規(guī)模和飼養(yǎng)管理等因素對(duì)雞球蟲感染影響差異較大，應(yīng)合理使用抗球蟲藥物，定期進(jìn)行圈舍消毒及墊料更換，做好不同日齡雞球蟲病的防控。

雞感染球蟲后，常存在混合感染，根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察對(duì)球蟲進(jìn)行準(zhǔn)確的種類鑒定存在一定困難。ITS基因可準(zhǔn)確鑒定球蟲種類，還可分析不同種類之間的親緣關(guān)系[14]。此次調(diào)查發(fā)現(xiàn)部分和田黑雞樣本呈球蟲混合感染，感染率為4.9%(22/449)，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示所獲3種致病性球蟲序列親緣關(guān)系較近，同處一個(gè)進(jìn)化支上。

調(diào)查結(jié)果顯示，和田部分地區(qū)的和田黑雞致病性球蟲感染較普遍，以布氏艾美耳球蟲為感染蟲種，以40日齡～80日齡雞感染率較高。養(yǎng)殖過(guò)程中，應(yīng)針對(duì)雞易感年齡段合理使用抗球蟲藥，防止球蟲產(chǎn)生耐藥性。