靈芝菌絲體水溶性抗氧化活性成分的多指標(biāo)提取工藝優(yōu)化

鄭丹婷,陳煉茹,韓 偉,馮 杰,唐慶九,張勁松,馮 娜

(1.華東理工大學(xué) 藥學(xué)院 制藥工程與過程化學(xué)教育部工程研究中心 上海市新藥設(shè)計重點實驗室,上海 200237;2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食用菌研究所 國家食用菌工程技術(shù)研究中心,上海 201403)

靈芝是應(yīng)用最廣泛的藥用真菌之一,與鹿茸、人參、首烏并列為我國四大珍貴藥材。大量的研究表明靈芝具有抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、降血脂、抗氧化和保護(hù)神經(jīng)等藥理活性[1-5],故具有極高的市場需求。傳統(tǒng)意義上的靈芝為多孔菌科真菌赤芝或紫芝的子實體[6],其受地域、季節(jié)、原料等因素的影響,品控較差、生長周期長且成本較高[7],使靈芝的商業(yè)化應(yīng)用受限。靈芝菌絲體為靈芝營養(yǎng)體的基本結(jié)構(gòu),可通過液態(tài)發(fā)酵技術(shù)快速獲得,且可以通過對培養(yǎng)條件的調(diào)整,得到含有更多目標(biāo)成分(如三萜、多糖、氨基酸等)的菌絲體[8-10],有利于靈芝有效成分工業(yè)化生產(chǎn)的規(guī)?；c標(biāo)準(zhǔn)化。因此對靈芝菌絲體的研究具有重要價值。

天然產(chǎn)物的體外抗氧化研究有很多,但目前尚無標(biāo)準(zhǔn)化的評價方法,且由于抗氧化機(jī)制較為復(fù)雜,通常選取多種方法進(jìn)行評價,因此需要利用多指標(biāo)綜合分析方法將不同評價方法得到的結(jié)果進(jìn)行整合。按權(quán)重計算法可將多指標(biāo)綜合分析方法分為主觀法和客觀法兩類[11]。熵權(quán)法是根據(jù)不同評價指標(biāo)各自區(qū)分度的大小進(jìn)行加權(quán)的一種客觀方法,通過該法確定指標(biāo)權(quán)重的評價結(jié)果具有很強(qiáng)的數(shù)學(xué)理論依據(jù),避免了主觀判斷存在的不合理性,真正做到了符合客觀實際的權(quán)重計算[12],且計算方式簡單、可操作性強(qiáng),有利于對多種方法得到的結(jié)果進(jìn)行綜合評價。

本文以靈芝菌絲體為原材料,對其水溶性抗氧化活性成分進(jìn)行提取,采用熵權(quán)法對靈芝菌絲體水提液(GLMw)的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除率、2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基清除率、羥自由基清除率進(jìn)行賦權(quán)。以加權(quán)得到的靈芝菌絲體水提液綜合抗氧化活性為評價指標(biāo),在單因素實驗的基礎(chǔ)上應(yīng)用星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法(CCD)對靈芝菌絲體水溶性抗氧化成分的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,為后續(xù)靈芝菌絲體抗氧化活性的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 實驗

1.1 主要原料與儀器

靈芝菌絲體樣品由上海市農(nóng)科院食用菌所提供。

乙醇,體積分?jǐn)?shù)為95%,分析純(AR),上海泰坦科技股份有限公司;2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS),質(zhì)量分?jǐn)?shù)>95%,上海畢得醫(yī)藥科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96%,上海源葉生物科技有限公司;水楊酸、過硫酸鉀、30% H2O2、NaH2PO4、Na2HPO4、NaOH和FeSO4·7H2O,皆為AR,上海凌峰化學(xué)試劑公司。

功率可調(diào)臺式加熱系列(LCD)超聲儀(SK5210HP型),上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司;紫外-可見光分光光度計(UV1900PC型),上海亞研電子科技有限公司;臺式微量高速離心機(jī)(H1650-W型),湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;水浴鍋(SB-2000型),上海愛朗儀器有限公司;電子式內(nèi)校分析天平(AL104型),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;pH計(PHS-25型),上海儀電科學(xué)儀器。

1.2 樣品溶液的制備

由于從靈芝菌絲體中提取得到的物質(zhì)為混合物,為使不同提取條件下得到的樣品溶液的體外抗氧化活性具有比較意義,參考蔡夢婷等[13]的表述方法,將各水提液稀釋為2 mg/mL的樣品溶液(即每mL樣品溶液中含有從2 mg靈芝菌絲體粉末中得到的水提物),用于后續(xù)體外抗氧化活性測定。具體制備過程如下:精密稱取靈芝菌絲體粉末0.1 g于具塞試管中,按一定液固比加入去離子水,浸潤5 min后在相應(yīng)條件(液固比、超聲功率、超聲時間、超聲溫度)下進(jìn)行提取,提取后于11 000 r/min條件下離心12 min,取適量上清液定容于25 mL容量瓶,得2 mg/mL的樣品溶液。

1.3 分析方法的確定

1.3.1 DPPH自由基清除率

參考Brand-Williams等[14]的方法,稱取DPPH粉末12.5 mg,用乙醇(體積分?jǐn)?shù)為95%)溶解,定容至100 mL,將所得0.031 7 mmol/L的DPPH自由基儲備液避光保存。使用時稀釋5倍,使其吸光度為0.7左右,得到DPPH自由基工作溶液。測量時,取樣品溶液2 mL于5 mL棕色容量瓶,加入2 mL DPPH自由基工作溶液后搖勻,避光反應(yīng)30 min后用紫外-可見光分光光度計于517 nm處測定吸光度,用95%乙醇調(diào)零。按式(1)計算DPPH自由基清除率(S1),重復(fù)實驗3次,取平均值。

(1)

式中:Ai為樣品溶液與DPPH溶液反應(yīng)后的吸光度;Aj為用95%乙醇代替DPPH溶液測得樣品溶液的本底吸光度;A0為以去離子水代替樣品溶液的空白吸光度。

1.3.2 羥自由基清除率

采用水楊酸法測定水提液的羥自由基清除率,參考文獻(xiàn)[15]并加以改進(jìn)。在10 mL具塞試管中依次加入樣品溶液、9 mmol/L FeSO4和8.8 mmol/L H2O2溶液各1 mL,室溫下靜置10 min,再向試管中移入1 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液,混合均勻后在37 ℃水浴條件下保溫30 min,離心后檢測上清液在510 nm處的吸光度,用去離子水調(diào)零。羥自由基清除率(S2)計算方法如式(2),重復(fù)實驗3次,取平均值。

(2)

式中:A′i為樣品溶液與水楊酸溶液反應(yīng)后的吸光度;A′j為用去離子水代替H2O2測得樣品溶液的本底吸光度;A′0為以去離子水代替樣品溶液的空白吸光度。

1.3.3 ABTS自由基清除率

參考Ilyasov等[16]的方法并加以改進(jìn)。移取5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和100 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液于10 mL棕色容量瓶,搖勻后避光反應(yīng)12～16 h,用pH=7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋90倍左右,使其吸光度約為0.7,得到ABTS自由基工作溶液。取樣品溶液1 mL于5 mL棕色容量瓶,加入4 mL ABTS自由基工作溶液后搖勻,避光反應(yīng)6 min后測定溶液在734 nm的吸光度。按式(3)計算ABTS自由基清除率(S3),重復(fù)實驗3次,取平均值。

(3)

式中:A″i為樣品溶液與ABTS溶液反應(yīng)后的吸光度;A″j為用磷酸鹽緩沖液代替ABTS溶液測得樣品溶液的本底吸光度;A″0為以去離子水代替樣品溶液的空白吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 液固比的影響

在超聲時間60 min、超聲溫度40 ℃、超聲功率180 W條件下,考察液固比對靈芝菌絲體水提液抗氧化活性的影響,結(jié)果見圖1。由圖1可知:隨液固比增大,3種自由基清除率的變化規(guī)律基本一致。液固比<50 mL/g時,隨著液固比的增大,3種自由基清除率均增大,其中20～30 mL/g時清除率增大速度較快,這是由于當(dāng)液固比<30 mL/g時,樣品與溶劑間的濃度差較小,不利于抗氧化活性物質(zhì)的溶解、擴(kuò)散。液固比>30 mL/g時,水提液的自由基清除率隨液固比的增大略有增大,到50 mL/g時達(dá)到最大值,60 mL/g后有所下降,但整體波動不大,其原因是液固比為50 mL/g時,樣品的溶解達(dá)到飽和,此后繼續(xù)增大液固比不但效果不明顯,反而會增加熱負(fù)荷并導(dǎo)致轉(zhuǎn)移時的損失增加[17]。因此,液固比選擇50 mL/g為最佳。

圖1 不同液固比下的水提液抗氧化活性Fig.1 Effects of liquid-solid ratio on antioxidant activity of GLMw

圖2 不同超聲功率下水提液的抗氧化活性Fig.2 Effects of ultrasonic power on antioxidant activity of GLMw

2.1.2 超聲功率的影響

通常來說,超聲功率的增大有利于增強(qiáng)空化作用、提高破壁速率,從而導(dǎo)致更多活性物質(zhì)的溶出,但隨著超聲功率的不斷升高,一些成分可能會發(fā)生分解,從而影響提取物的抗氧化活性。王小梅等[18]通過研究發(fā)現(xiàn)不同超聲功率下得到的麥冬多糖的分子量分布有較大差異,而不同分子量多糖的抗氧化活性也具有較大差異。因此,在超聲溫度40 ℃、超聲時間60 min、液固比50 mL/g的條件下,考察超聲功率對水提液抗氧化活性的影響,結(jié)果見圖2。由圖2可知:隨超聲功率增大,靈芝菌絲體水提液3種自由基清除率變化趨勢基本一致,即超聲功率為72～153W時,水提液的抗氧化活性隨超聲功率的增大而增大,超聲功率為180 W時,抗氧化活性急劇下降。因此,選擇153 W為最佳超聲功率。

2.1.3 超聲時間的影響

在液固比50 mL/g、超聲功率153 W、超聲溫度40 ℃的條件下,考察超聲時間對靈芝菌絲體水提液抗氧化活性的影響,結(jié)果見圖3。由圖3可知:隨著超聲時間的延長,水提液的抗氧化活性也不斷增大,60 min時達(dá)到最高;超聲時間超過60 min后,由于樣品在溶劑中的浸提時間過長,其中的多糖等黏性物質(zhì)會擴(kuò)散出來并附著在樣品表面,從而阻礙有效成分的提取,導(dǎo)致抗氧化活性有所下降,其中羥自由基清除率的下降幅度最大,但3種自由基清除率隨超聲時間的變化趨勢總體一致。因此,選取60 min為最適超聲時間。

圖3 超聲時間對水提液抗氧化活性的影響Fig.3 Effects of ultrasonic time on antioxidant activity of GLMw

2.1.4 超聲溫度的影響

Muthukumaran等[19]的研究表明,溫度的提高能夠降低溶劑的表面張力和黏度,從而增加由于超聲波空化作用產(chǎn)生的氣泡數(shù)量,有利于傳質(zhì)。但溫度過高會導(dǎo)致蒸汽壓力升高,而蒸汽壓增加反過來又會因為緩沖導(dǎo)致氣泡塌陷,從而抑制空化作用[20]。因此,在液固比50 mL/g、超聲功率153 W、超聲時間60 min的條件下,考察超聲溫度對水提液抗氧化活性的影響,結(jié)果見圖4。由圖4可知:溫度為40 ℃時自由基清除率顯著高于30 ℃的結(jié)果。40 ℃后,3種自由基的清除率均隨著溫度的升高而下降。因此,選取40 ℃為最適超聲溫度。

圖4 超聲溫度對水提液抗氧化活性的影響Fig.4 Effects of ultrasonic temperature on antioxidant activity of GLMw

2.2 星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取液固比(X1)、超聲溫度(X2)、超聲功率(X3)和超聲時間(X4)為效應(yīng)因子,設(shè)計4因素5水平中心組合優(yōu)化表(表1)。根據(jù)表2列出的條件制備2 mg/mL樣品溶液,測定各水提液的抗氧化活性,每份溶液測定3次,取平均值,分別得到S1、S2和S3。

表1 CCD實驗設(shè)計因素水平

利用熵權(quán)法對評價指標(biāo)S1、S2、S3各自所占權(quán)重進(jìn)行計算。以CCD實驗優(yōu)化設(shè)計得到的30組數(shù)據(jù)為樣本,對sij按式(4)進(jìn)行離差標(biāo)準(zhǔn)化得到對應(yīng)的yij后,按式(5)分別計算S1、S2和S3的信息熵Ej,按式(6)計算相應(yīng)權(quán)重(wj)。

(4)

(5)

(6)

計算得到S1、S2、S3的權(quán)重w1、w2、w3分別為0.388 8、0.354 4、0.256 8。定義加權(quán)后的綜合抗氧化活性為Z,其計算方法見式(7)。

Z=0.388 8S1+0.354 4S2+0.256 8S3

(7)

以X1、X2、X3和X4為效應(yīng)因子,Z為效應(yīng)值,利用Design-Expert進(jìn)行效應(yīng)面分析,去掉不顯著項(P>0.05)得到的簡化后的編碼回歸方程,見式(8)。

Z=63.38+0.40X1+0.43X2+0.44X3-0.20X4+

(8)

表2 CCD實驗優(yōu)化設(shè)計及結(jié)果

表3 CCD回歸模型可信度分析

表4 CCD回歸模型方差分析

在各實驗因素的取值范圍內(nèi),根據(jù)擬合后的回歸方程計算得到綜合抗氧化活性Z最大時對應(yīng)的實驗條件,將其進(jìn)行規(guī)整以便于實際操作,具體實驗條件如下:液固比50 mL/g、超聲時間60 min、超聲溫度40 ℃、超聲功率156 W,該條件下的靈芝菌絲體水提液綜合抗氧化活性的預(yù)測值為63.48%,實驗值為62.06%,二者接近(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD<3%)。

3 結(jié)論

1)通過靈芝菌絲水提液的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和羥自由基清除率評價其體外抗氧化活性。通過對不同提取條件的研究,發(fā)現(xiàn)提取過程中的液固比、超聲時間、超聲溫度及超聲功率對水提液的抗氧化活性均有影響,且隨著提取條件的改變,3種自由基清除率雖然有差異,但變化規(guī)律基本一致。

2)通過CCD實驗優(yōu)化,對30組不同條件下得到的靈芝菌絲體水提液的自由基清除率進(jìn)行熵權(quán)法賦權(quán),權(quán)重分別為0.388 8(DPPH自由基清除率)、0.354 4(羥自由基清除率)和0.256 8(ABTS自由基清除率),以加權(quán)后得到的綜合抗氧化活性為效應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化,使得靈芝菌絲體水溶性抗氧化活性成分的提取更為全面。

3)靈芝菌絲體水溶性抗氧化活性成分的最佳超聲提取工藝參數(shù)為液固比50 mL/g、超聲時間60 min、超聲溫度40 ℃、超聲功率156 W,該條件下進(jìn)行實驗驗證,得到綜合抗氧化活性為62.06%,與預(yù)測值63.48%相近(RSD<3%)。