生物炭緩解乙草胺對草莓根系線粒體膜功能傷害的作用

魯曉峰，杜國棟，邵 靜，孫海龍，徐樹廣

(1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧興城，125100；2 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/沈陽市北方果樹栽培與生理生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽，110866；3 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，吉林公主嶺，136100)

乙草胺是一種作用于雜草幼芽和幼根的除草劑，具有選擇性專一、持效期長及控制雜草效率高等諸多優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用[1]。然而，若在草莓繁育過程中不當(dāng)使用乙草胺，則對幼苗植株的生長發(fā)育產(chǎn)生一定的傷害，對草莓苗木質(zhì)量以及果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)會造成嚴(yán)重的負(fù)面影響。因此，探究乙草胺藥害影響植株發(fā)育的內(nèi)在生理代謝規(guī)律，對合理使用乙草胺及有效避免藥害具有重要的指導(dǎo)意義。

除草劑可通過進(jìn)入作物根圍土壤來影響植物根系生理功能，從而表征除草劑脅迫對根系發(fā)育的傷害程度[2]。Ghazi-Khansari等[3]研究發(fā)現(xiàn)，利用草甘膦處理后，毛桃根系呈現(xiàn)出顏色變深、須根變短、變少等現(xiàn)象，說明除草劑脅迫對毛桃根系生長發(fā)育有較大傷害。土壤中的西草凈含量達(dá)到0.8～8.0 mg/kg時，小麥根系中活性氧(ROS)大量產(chǎn)生，對根系細(xì)胞膜脂造成損傷[4]。外源施加丙酯草醚和丁草胺，均能不同程度破壞小麥、油菜和大麥體內(nèi)的保護(hù)性酶活性，使植株體內(nèi)的膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量提高[5-6]。線粒體是根系細(xì)胞主要的細(xì)胞器之一，是感受外界脅迫相關(guān)信號的主要部位[7-8]。研究表明，逆境脅迫會導(dǎo)致線粒體的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生明顯變化[9]。如：在鹽堿脅迫下，番茄根系線粒體內(nèi)H2O2和MDA含量增加，線粒體膜通透性增大[10]；在干旱脅迫下，銀沙槐幼苗葉片中線粒體膜完整性低，出現(xiàn)內(nèi)部嵴消失、空泡化等現(xiàn)象[11]；在鋁脅迫下，導(dǎo)致花生根尖線粒體電子傳遞受阻，氧自由基含量增加，造成線粒體膜質(zhì)過氧化，根尖細(xì)胞發(fā)生程序性死亡[12]。生物炭(粉狀顆?；哪咎?具有孔隙結(jié)構(gòu)發(fā)達(dá)、吸附性能好、離子交換能力較強(qiáng)等特點(diǎn)[13-14]，可有效吸附極性及非極性化合物[15]，施入土壤后可影響除草劑在土壤環(huán)境中的遷移和轉(zhuǎn)化[16]。Wei等[17]研究表明，生物炭對莠去津和西瑪津有較高的吸附親和力，可有效去除殘留，減輕污染。李玉梅等[18]研究表明，施入生物炭后，異噁草松對甜菜生長的抑制作用得以緩解，根系吸收養(yǎng)分和水分的能力增強(qiáng)，表現(xiàn)為根長增加，體積增大，根尖數(shù)增多現(xiàn)象。雖然有關(guān)除草劑影響作物生長發(fā)育的研究報(bào)道較多，但關(guān)于除草劑導(dǎo)致作物根系線粒體膜結(jié)構(gòu)和功能損傷以及生物炭減緩其傷害的機(jī)制等尚無詳細(xì)研究報(bào)道。本文以草莓植株為試驗(yàn)材料，研究乙草胺誘發(fā)ROS對草莓根系線粒體膜電位、膜通透性等生物膜結(jié)構(gòu)和功能的影響，明確添加生物炭緩解乙草胺傷害的生理機(jī)制，為生產(chǎn)上有效應(yīng)對乙草胺類除草劑脅迫提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為日本草莓品種“寶交早生”(Fragaria×ananassaDuch.‘Hokowase’)。濃度90%乙草胺乳油(購自吉林美聯(lián)化學(xué)品有限公司)，生物炭(粒徑為0.10～0.15 mm)。

1.2 試驗(yàn)處理

將三葉一心的草莓假植幼苗定植于內(nèi)徑寬和高均為16.0 cm的塑料缽中。栽培基質(zhì)為園土∶泥炭∶有機(jī)肥=3∶1∶1(體積比)，每盆裝入基質(zhì)1.25 kg，每盆栽植草莓苗1株。草莓植株在塑料缽中定植30 d后，選擇長勢基本一致的草莓植株進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)乙草胺處理(為突出乙草胺的毒害作用，本試驗(yàn)中加大了乙草胺的使用濃度，即每缽澆灌0.2 mol/L的乙草胺100 mL，編號為D)、生物炭+乙草胺處理(在栽植草莓植株前，每缽基質(zhì)添加125.00 g生物炭，與園土、泥炭、有機(jī)肥混合均勻；澆灌0.2 mol/L乙草胺100 mL，編號為DB)及清水對照(未施加乙草胺和生物炭，編號為CK)3個處理。每處理每重復(fù)1株(盆)，重復(fù)30次。按試驗(yàn)設(shè)定劑量將除草劑溶液澆灌塑料缽基質(zhì)中，對照施入等量的蒸餾水。分別于處理后1 d、3 d、5 d、7 d和9 d，取草莓根系前端1～2 cm分生區(qū)部位根段樣品，用于各生理指標(biāo)的測定。

1.3 測定方法

1.3.1 根系分生區(qū)線粒體的提取及其特性的測定 線粒體的提取參照楊玖英[19]的方法；線粒體膜電位(Δψm)測定參照Braidot[20]等方法；線粒體膜通透性的測定參照金超芳[21]等方法；線粒體細(xì)胞色素c/a(Cyt c/a)測定參照Tonshin及馬懷宇[22]等方法。

1.3.2 根系分生區(qū)膜脂過氧產(chǎn)物及保護(hù)性酶活性的測定 丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定[23]；過氧化氫酶(CAT)活性采用KMnO4滴定法測定[24]；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)顯色法測定[25]；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[26]；超氧陰離子(O2·-)含量采用羥胺法測定[27]；過氧化氫(H2O2)含量采用四氯化鈦法測定[28]。

1.3.3 根系活力及質(zhì)膜H+-ATPase活性測定 根系活力采用TTC法測定[29]，單位為mg/(g·h)；質(zhì)膜H+-ATPase測定參照Blumwald等[30]方法，以單位質(zhì)量的質(zhì)膜在單位時間水解ATP所釋放的無機(jī)磷(Pi)量來表示活性，單位為μmol/(mg·h)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010 軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)處理，Sigma Plot 10.0軟件繪圖，SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根系線粒體膜功能

線粒體膜電位(Δψm)是評線粒體功能的特征指標(biāo)。施加處理D后，根系線粒體膜Δψm于處理后7 d內(nèi)呈持續(xù)下降的趨勢，比CK低64.3%，后期無明顯變化。施加處理DB后，根系線粒體膜Δψm的下降幅度顯著減小。說明，乙草胺對草莓根系線粒體膜功能產(chǎn)生傷害，而土施生物炭能在一定程度上緩解除草劑乙草胺對草莓植株的傷害(見圖1A)。

線粒體細(xì)胞色素Cyt c是呼吸電子傳遞鏈的重要組成部分，遇到脅迫傷害易從線粒體內(nèi)膜脫落，而細(xì)胞色素Cyt a則不易脫落，可用Cyt c/a來反應(yīng)Cyt c量的變化。與CK相比，前期處理D和DB根系線粒體內(nèi)膜上細(xì)胞色素Cyt c/a含量明顯下降，均于處理7 d后達(dá)最低值，后期Cyt c/a變化不明顯，處理DB的線粒體Cyt c/a降幅顯著小于處理D(見圖1B)。表明，乙草胺導(dǎo)致草莓根系線粒體內(nèi)膜上的Cyt c不斷流失，對線粒體的呼吸電子傳遞功能產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響，而土施生物炭能夠有效減緩乙草胺對根系線粒體膜功能的傷害。

滲透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)是連接線粒體內(nèi)外膜的通道，其開放程度可反映線粒體膜的通透性。與CK相比，在處理1～9 d，處理D和DB的根系線粒體膜透性(MPT)呈持續(xù)，處理DB的升幅顯著小于處理D(見圖1C)?？梢姡也莅穼€粒體膜通透性產(chǎn)生了抑制作用，而土施生物炭能有效減弱乙草胺對線粒體膜通透性的負(fù)面影響。

圖1 乙草胺及生物炭對草莓根系線粒體功能的影響

2.2 根系活力及H+-ATPase

與CK相比，乙草胺(處理D)使草莓根系活力持續(xù)下降，處理9 d后，根系活力僅為對照的54.8%，土施生物炭(處理DB)削弱了乙草胺引起的草莓根系活力下降(見圖2A)。與CK相比，處理D和DB均使草莓根系細(xì)胞質(zhì)膜H+-ATPase活性呈現(xiàn)明顯下降趨勢，其中，處理D下降相對明顯(見圖2B)。

圖2 乙草胺及生物炭對草莓根系活力及H+-ATPase的影響

2.3 根系丙二醛含量

丙二醛(MDA)是植物受到逆境脅迫所生成膜質(zhì)過氧化物質(zhì)，其含量常常用來表征植物機(jī)體內(nèi)膜質(zhì)過氧化程度。與CK相比，在乙草胺脅迫下(處理D和DB)的根系MDA含量均呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢。其中，處理DB的MDA含量在后期(5 d及以后)下降緩慢，高于處理D(見圖3)。表明，乙草胺脅迫明顯造成草莓根系膜質(zhì)傷害，且隨處理時間延長，根系膜質(zhì)過氧化程度趨于嚴(yán)重，而土施生物炭可有效減緩乙草胺脅迫造成的傷害。

圖3 乙草胺及生物炭處理對草莓根系丙二醛含量的影響

2.4 根系活性氧含量

與CK相比，隨著脅迫時間延長，處理D的草莓根系超氧陰離子自由基(O2·-)含量明顯上升，處理第5 d后，O2-含量較CK增長14.9%，處理9 d后O2-含量達(dá)到最高值；5 d后，處理DB的草莓根系O2-含量比CK增長9.1%，處理后期O2-含量變化不明顯。

處理3 d及以后，處理DB的O2·-含量始終低于處理D(見圖4A)。與CK相比，隨著脅迫時間的持續(xù)，處理D的根系過氧化氫(H2O2)含量明顯上升，處理7 d時H2O2含量達(dá)到最高值，較CK增長32.5%；處理DB的根系H2O2含量變化與處理D相似，但始終低于處理D(見圖4B)。說明，乙草胺脅迫對草莓植株根系的傷害嚴(yán)重，對ROS產(chǎn)生有較大的影響，而土施生物炭能有效緩解活性氧對草莓根系的傷害。

圖4 乙草胺及生物炭對草莓根系ROS含量及H2O2含量的影響

2.5 根系保護(hù)性酶活性

超氧化物歧化酶(SOD)是參與超氧陰離子自由基(O2·-)分解的唯一酶類。與CK相比，隨著乙草胺脅迫(處理D和DB)時間增加，草莓根系SOD活性均呈逐漸上升趨勢，且處理D和DB的SOD活性差異不顯著。在脅迫處理9 d后，處理D和DB的根系SOD活性分別比CK增長32.8%和27.7%(圖5A)。

過氧化物酶(POD)作為胞內(nèi)酶又可作為胞外酶來參與H2O2的分解，是眾多涉及清除ROS類物質(zhì)的最重要酶類之一。與CK相比，隨著乙草胺脅迫(處理D和DB)時間的增加，根系POD活性呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，于處理9 d后達(dá)最高水平，后期(處理7 d及以后)處理DB的POD活性顯著低于處理D(見圖5B)。說明，乙草胺脅迫造成草莓根系傷害，引起根系保護(hù)性酶POD活性增加，而土施生物炭則顯著緩解乙草胺對根系的傷害。

過氧化氫酶(CAT)清除劑也是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。與CK相比，隨著脅迫時間增加，處理D的根系CAT活性呈波動下降趨勢，處理9 d后的CAT活性達(dá)最低值，較CK降低了17.1%；處理DB的草莓根系CAT活性呈現(xiàn)持續(xù)緩慢下降趨勢，處理9 d后的CAT活性僅比CK降低6.1%(見圖5C)。表明，土施生物炭明顯緩解了乙草胺的傷害作用。

圖5 乙草胺及生物炭對草莓根系保護(hù)性酶活性的影響

3 討論

在正常生理狀態(tài)下，植物組織中的ROS產(chǎn)生與清除處于平衡狀態(tài)。當(dāng)植物受到逆境脅迫時，植株體內(nèi)會產(chǎn)生過量ROS，引起細(xì)胞膜系統(tǒng)受到損傷[31]，引起膜脂過氧化物產(chǎn)物(MDA)激增[32-33]。溫銀元等[27]研究發(fā)現(xiàn)，受到撲草凈脅迫后，西府海棠幼苗根系中抗氧化酶SOD、POD等含量均顯著升高，O2·-和H2O2含量顯著高于對照。在本研究中，乙草胺脅迫引起草莓根尖部位的SOD和POD活性提高，與前人研究結(jié)果相似；而添加生物炭后，利用其較強(qiáng)的吸附能力，明顯減緩了乙草胺對草莓根系的直接傷害，保護(hù)了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[34]。劉煒[35]等研究指出，低溫逆境下，小麥根系細(xì)胞質(zhì)膜Ca2+-ATPase會迅速失活。本研究也發(fā)現(xiàn)，草莓受到乙草胺脅迫后，質(zhì)膜H+--ATPase活性呈現(xiàn)下降的趨勢，可能是根系應(yīng)對脅迫的一種適應(yīng)性反應(yīng)；隨著脅迫時間的延長，H2O2和O2·-大量積聚，膜脂過氧化加劇，導(dǎo)致質(zhì)膜H+-ATPase活性進(jìn)一步下降，質(zhì)膜功能損傷。

線粒體是細(xì)胞能量代謝的場所，細(xì)胞氧化功能的中心，也是產(chǎn)生ROS的場所，其內(nèi)含有抗氧化酶對機(jī)體有一定保護(hù)作用[36]。過量的ROS會引起線粒體膜氧化損傷，導(dǎo)致線粒體的電子傳遞受阻，內(nèi)膜的完整性和呼吸電子傳遞鏈?zhǔn)艿狡茐模M(jìn)一步破壞線粒體的抗氧化防御體系，使線粒體O2·-產(chǎn)生速率加快、H2O2含量增高、膜脂過氧化加劇[37]。在本研究中，施加乙草胺后，草莓根系線粒體的O2·-產(chǎn)生速率顯著增加，根系線粒體膜電位(Δψm)持續(xù)降低。在植物根系中，線粒體呼吸鏈電子漏是O2·-產(chǎn)生的主要來源[38]，而線粒體膜電位的下降又能導(dǎo)致線粒體呼吸鏈電子漏的增加[39]。施用乙草胺造成草莓根系線粒體膜電位降低，這可能是導(dǎo)致根系O2·-產(chǎn)生的重要原因之一。細(xì)胞色素Cyt c介導(dǎo)的呼吸鏈電子漏旁路，可以清除由于呼吸鏈漏電子而產(chǎn)生的O2·-和H2O2。徐建興[40]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植物遭受逆境脅迫時，線粒體內(nèi)膜的完整性和呼吸電子傳遞鏈?zhǔn)艿狡茐?，最終導(dǎo)致線粒體O2·-產(chǎn)生速率加快、H2O2含量增高。本研究結(jié)果顯示，乙草胺脅迫處理的草莓根系線粒體Cyt c/a值明顯低于CK，而生物炭+乙草胺處理的Cyt c/a含量明顯高于乙草胺單獨(dú)處理，根系中的H2O2含量也低于乙草胺單獨(dú)處理。表明，在乙草胺脅迫下，加入生物炭可在一定程度上保護(hù)線粒體膜及其他細(xì)胞器膜，緩解乙草胺脅迫對于草莓植株根系線粒體功能的傷害，是植物根系線粒體膜免于除草劑乙草胺傷害的有效保護(hù)機(jī)制。

4 結(jié)論

乙草胺脅迫可導(dǎo)致草莓根系線粒體膜結(jié)構(gòu)和功能受到傷害。通過土壤添加生物炭，可有效減緩乙草胺脅迫對草莓根系的傷害，增強(qiáng)根系抗氧化酶系統(tǒng)活性，維持植物根系線粒體膜整體功能，進(jìn)而提高草莓植株對乙草胺脅迫的適應(yīng)能力。