香蕉彎孢霉葉斑病菌對戊唑醇的敏感性及抗藥性突變體的生物學(xué)特性

劉桂芹，周宇燁，李 鑫

(1 廊坊職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北廊坊，065000；2 廣東石油化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東茂名，525000；3 廣東省茂名市水果科學(xué)研究所，廣東茂名，525000)

香蕉是重要的水果之一，種植面積較廣，現(xiàn)已成為農(nóng)戶脫貧致富的重要產(chǎn)業(yè)，我國香蕉產(chǎn)地主要集中在海南、廣東、廣西、云南、福建等地區(qū)。近些年隨著種植面積的增大，種植年限的延長，病蟲害也呈逐年增加的趨勢[1]。香蕉葉斑病是香蕉的重大病害，主要為害香蕉葉片，在葉片上形成病斑，影響植株的光合作用。當(dāng)病害發(fā)生較重時，葉片干枯死亡，嚴(yán)重影響香蕉產(chǎn)量[2]。香蕉葉斑病由多種病原真菌單獨或復(fù)合侵染引起，主要包括褐緣灰斑病、灰紋病和煤紋病等[3]。彎孢霉葉斑病菌Curvularialunata(Walker)Boedijin是香蕉葉斑病的主要病原，每年7—9月高溫高濕季節(jié)，葉斑病發(fā)生較重，病葉率可達(dá)20%～40%，嚴(yán)重時可達(dá)80%[4]。目前，香蕉葉斑病的防治主要以化學(xué)防治為主，常見的防治藥劑主要有戊唑醇、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯、啶氧菌酯、氟環(huán)唑、代森錳鋅、甲基托布津等[5-6]。戊唑醇屬于三唑類殺菌劑，具有較好的保護(hù)、治療、鏟除作用，戊唑醇?xì)⒕V廣、持效期長，對多種植物病原菌具有較好的抑制作用，主要抑制真菌麥角甾醇的生物合成[7]。戊唑醇作用位點單一，且生產(chǎn)上已經(jīng)有多年的用藥史，病原菌在長期單一的藥劑選擇壓力下，勢必會誘發(fā)病原菌抗藥性的產(chǎn)生，目前殺菌劑抗性行動委員會(FRAC)已將戊唑醇列為中等抗性風(fēng)險藥劑[8]。已有研究報道多種病原真菌對戊唑醇產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。Chen等[9]對2018—2020年從河南小麥分離鑒定的1 118株禾谷鐮孢菌進(jìn)行抗藥性檢測，發(fā)現(xiàn)362株(30.7%)對戊唑醇產(chǎn)生了抗藥性。Fan等[10]測定了146株蘋果葡萄球菌對戊唑醇的敏感性，發(fā)現(xiàn)1株抗性菌株且可穩(wěn)定遺傳。Wei等[11]測定了48株辣椒炭疽菌對戊唑醇的敏感性，發(fā)現(xiàn)6株抗性菌株；通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，抗性菌株CgCYP51基因部分位點發(fā)生了替換。植物病原菌抗藥性監(jiān)測一直是植物保護(hù)工作的重要內(nèi)容，加強(qiáng)病原菌抗藥性監(jiān)測能夠及時充分地了解田間病原菌對藥劑的敏感性，對藥劑使用及病害防治具有重要指導(dǎo)作用。戊唑醇是防治香蕉葉斑病常用藥劑，目前鮮見香蕉葉斑病菌對戊唑醇的抗藥性報道。為充分了解我國香蕉產(chǎn)區(qū)葉斑病菌對戊唑醇的敏感性情況，本研究從廣西、廣東、海南、云南、福建等地采集分離香蕉葉斑病菌，測定分離菌株對戊唑醇的敏感性；同時探究香蕉彎孢霉葉斑病菌對戊唑醇產(chǎn)生抗藥性突變的可能性，及所獲抗性突變體的生物學(xué)特性，以評估香蕉彎孢霉葉斑病菌對戊唑醇的抗性風(fēng)險，以期為香蕉彎孢霉葉斑病的防治及戊唑醇藥劑的使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：采用組織分離，單孢純化，鑒定香蕉彎孢霉葉斑病菌168株后，接種于PDA試管斜面保存?zhèn)溆谩Ｆ渲袕V西病菌32株、廣東26株、海南38株、云南40株、福建32株。供試藥劑：98%戊唑醇(tebuconazole)原藥，江蘇龍燈化學(xué)有限公司產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 含藥培養(yǎng)基的制備 準(zhǔn)確稱取一定量的98%戊唑醇原藥，先用少量丙酮溶解后加入無菌水定容至100 mL，配制濃度為1 000 mg/L母液，再用無菌水將母液稀釋為100、80、50、25、10、5、2.5 mg/L不同濃度藥液，用移液槍分別移取不同濃度藥液20 mL，加入到冷卻至50 ℃左右180 mL PDA培養(yǎng)基中，充分混合均勻，制成10、8、5、2.5、1、0.5、0.25 mg/L含藥培養(yǎng)基平板。每處理濃度重復(fù)3次，以不加藥液的PDA培養(yǎng)基為對照。

1.2.2 病菌對戊唑醇的敏感性測定 用直徑5 mm的打孔器取培養(yǎng)6 d的香蕉彎孢霉葉斑病菌，接種于不同濃度藥液平板上，以PDA培養(yǎng)基平板為對照(空白)，每處理重復(fù)3次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測量菌落直徑，以濃度對數(shù)(x)為橫軸，抑菌率的機(jī)率值(y)為縱軸求戊唑醇對香蕉彎孢霉葉斑病菌的毒力回歸方程y=ax+b，并計算抑制菌絲體生長的有效中濃度EC50值及r2。抑菌率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-5)×100。

1.2.3 香蕉彎孢霉葉斑病菌抗戊唑醇突變體的獲得

1.2.3.1 親本菌株的MIC值測定 根據(jù)香蕉彎孢霉葉斑病菌對戊唑醇的敏感性，從廣東、海南、廣西、福建、云南等5地分別隨機(jī)抽取相對敏感的菌株各3株，共計15株，按照1.2.1的藥劑濃度和1.2.2的方法測定戊唑醇對親本菌株的最低抑菌濃度(MIC)值。

1.2.3.2 藥劑連續(xù)誘導(dǎo) 將選取獲得的15株菌株(親本菌株)在各自菌株EC50值濃度下逐代誘導(dǎo)，每隔3 d轉(zhuǎn)接1代，并逐漸增加藥劑濃度，直至菌株可以在最低抑菌濃度(MIC)上生長。以各自親本菌株為對照，計算藥劑誘導(dǎo)后的抗性倍數(shù)。

1.2.3.3 紫外線誘導(dǎo) 將1.2.3.1挑選出的親本菌株15株，接種至各自菌株MIC濃度平板中，每菌株接種20皿，每皿接種5個菌餅，將其置于事先預(yù)熱15 min的紫外燈(20 W，254 nm)下方垂直距離20 cm處照射60 s，封口置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)3 d，以紫外燈未照射的親本菌株為對照，能在MIC濃度中生長的菌株則為疑似抗性菌株，測定菌株敏感性，計算抗性倍數(shù)和抗性頻率。

1.2.3.4 抗性評價 抗性水平劃分參照FAO標(biāo)準(zhǔn)[12]，抗性水平<5，敏感菌株(S)；5<抗性水平<10，低抗菌株(LR)；10<抗性水平<40，中抗菌株(MR)；抗性水平>40，高抗菌株(HR)。藥劑連續(xù)誘導(dǎo)和紫外線誘導(dǎo)抗性倍數(shù)=抗性突變體EC50/親本菌株EC50，整個群體菌株抗性倍數(shù)=供試菌株EC50/敏感性基線EC50；根據(jù)抗性菌株在整個群體中出現(xiàn)的頻率計算抗性菌株頻率[13]，抗性菌株頻率(%)=(抗性菌株數(shù)/供試菌株數(shù))×100。

1.2.4 抗性菌株的生物學(xué)特性 生長速度及生長量測定：將抗性菌株與親本菌株在PDA培養(yǎng)基上28 ℃黑暗培養(yǎng)4 d后，用直徑5 mm打孔器于菌落邊緣取菌餅，繼續(xù)轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃黑暗條件下再培養(yǎng)4 d，測量菌落直徑，計算菌絲生長速率，每菌株重復(fù)3次。同時分別取抗性菌株與親本菌株菌餅各5個，分別接種于PDB液體培養(yǎng)基中，28 ℃避光120 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，抽濾得到菌絲，于80 ℃ 烘干，稱量菌絲干重，每菌株重復(fù)3瓶。

抗性菌株遺傳穩(wěn)定性測定：將獲得的抗性菌株在PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)15代，每隔5代測定其敏感性，比較F0、F5、F10及F15代菌株對藥劑的敏感性，分析抗性菌株對戊唑醇的抗性能否穩(wěn)定遺傳。

2 結(jié)果與分析

2.1 病菌對戊唑醇的敏感性

測定168株香蕉彎孢霉葉斑病菌對戊唑醇的敏感性發(fā)現(xiàn)，隨著藥劑濃度增加，菌餅直徑越小，菌株(GX-8)在不同濃度藥液下的生長情況見圖1。168株香蕉彎孢霉葉斑病菌對戊唑醇的敏感性存在一定差異，供試菌株對戊唑醇的EC50介于0.561 4～8.624 2 μg/mL之間，平均值(4.517 3 ± 1.270 6)mg/L。其中，采自云南省紅河州河口縣的菌株YN-16的EC50最小，為0.561 4 mg/L；采自海南省臨高縣的菌株HN-12的EC50最大，為8.624 2 mg/L，最大EC50是最小EC50的15.36倍。

圖1 不同濃度戊唑醇平板上香蕉彎孢霉葉斑病菌(GX-8)菌絲生長情況

2.2 病菌對戊唑醇敏感性基線的建立

將香蕉彎孢霉葉斑病菌對戊唑醇的敏感性劃分為7個區(qū)間，以菌株敏感性分布為橫坐標(biāo)，菌株頻率分布為縱坐標(biāo)繪制菌株對戊唑醇的敏感性分布。由圖2可知，香蕉彎孢霉葉斑病菌對戊唑醇的敏感性分布呈連續(xù)性單峰曲線，采用 SPSS軟件進(jìn)行K-S法正態(tài)性檢驗，得Z=0.962 7，p=0.251 8(>0.05)，表明供試菌株對戊唑醇的敏感性分布符合正態(tài)分布。因此，可將EC50的平均值4.517 3mg/L作為香蕉彎孢霉葉斑病菌對戊唑醇的敏感性基線。

圖2 168株香蕉彎孢霉葉斑病菌對戊唑醇的敏感性頻率分布

2.3 病菌對戊唑醇的抗藥性

通過測定168株香蕉彎孢霉葉斑病菌對戊唑醇的敏感性，計算其EC50，以敏感性基線為基準(zhǔn)，計算抗性倍數(shù)，并根據(jù)FAO抗性分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價發(fā)現(xiàn)，168株菌株均為敏感菌株，未檢測到抗性菌株，最大EC50是最小EC50的15.36倍；且有79株菌株EC50大于平均值，有發(fā)展成為抗性菌株的潛在可能。

2.4 不同省(區(qū))病菌對戊唑醇的敏感性

從表1可以看出，不同省(區(qū))的香蕉葉斑病菌對戊唑醇的敏感性存在差異，來自海南的菌株EC50平均值最高，為4.607 3 mg/L；來自云南的菌株EC50平均值最小，為3.812 4 mg/L，不同省(區(qū))病菌EC50平均值從大到小依次為海南>廣東>廣西>福建>云南。

表1 不同省(區(qū))香蕉彎孢霉葉斑病菌對戊唑醇的敏感性

2.5 抗戊唑醇菌株的獲得

從表2可以看出，經(jīng)戊唑醇連續(xù)誘導(dǎo)多代后，隨著誘導(dǎo)代數(shù)增加，菌株敏感性逐漸降低，但變化并不大，僅有6株菌株產(chǎn)生了抗性，分別是親本菌株GX-22、HN-6、HN-18、FJ-11，抗性倍數(shù)介于5.64～10.13之間；抗性突變體除GX-22-R1為中抗菌株外，其余抗性突變體均為低抗菌株。通過紫外線誘導(dǎo)后，共獲得抗性菌株8株，分別是親本菌株HN-4、GD-7、YN-10，突變頻率為0.53%。突變體抗性倍數(shù)介于5.88～15.60之間，其中4株菌株為中抗菌株，其余為低抗菌株。

表2 藥劑和紫外線誘導(dǎo)的香蕉彎孢霉葉斑病菌抗性菌株對戊唑醇的抗性水平

2.6 抗戊唑醇突變菌株的生物學(xué)特性

2.6.1 菌絲生長速度及干質(zhì)量 從表3可以看出，抗性突變體菌絲生長速度和菌絲干質(zhì)量均低于親本菌株，藥劑誘導(dǎo)獲得的抗藥突變體菌絲生長速度減退率介于7.94%～18.12%之間，菌絲干質(zhì)量減退率介于12.12%～22.06%之間；紫外線誘導(dǎo)獲得的抗藥突變體菌絲生長速度減退率介于6.70%～19.23%之間，菌絲干質(zhì)量減退率介于7.14%～27.59%之間。表明抗性菌株的生物適合度有所降低。

表3 藥劑和紫外線誘導(dǎo)的香蕉彎孢霉葉斑病菌抗性突變菌株菌絲生長情況

2.6.2 遺傳穩(wěn)定性 從表4可以看出，藥劑誘導(dǎo)獲得的突變體菌株，只有GX-22-R2抗性突變菌株可以穩(wěn)定遺傳，其余抗性突變菌株均隨著轉(zhuǎn)接代數(shù)的增加，藥劑敏感性逐漸增加。紫外誘導(dǎo)獲得的突變體菌株，有3株菌株抗性可以穩(wěn)定性遺傳，分別為抗性突變菌株 UV-GD-7-R2、UV-YN-10-R1、UV-YN-10-R2，其余抗性突變菌株均隨著轉(zhuǎn)接代數(shù)的增加，藥劑敏感性逐漸增加。

表4 藥劑和紫外線誘導(dǎo)的抗戊唑醇香蕉彎孢霉葉斑病菌株遺傳穩(wěn)定性

3 結(jié)論與討論

由彎孢霉引起的香蕉葉斑病是香蕉生產(chǎn)上的重大病害，目前防治主要依賴化學(xué)防治?；瘜W(xué)防治效果較好，可以在短時間內(nèi)抑制病害發(fā)生；但長期頻繁使用化學(xué)藥劑也促使病原菌抗藥性的產(chǎn)生，開展病菌藥劑敏感性測定和抗性評價對藥劑的使用具有重要意義[14]。戊唑醇是生產(chǎn)上使用較廣的殺菌劑，已在世界上50多個國家的60多種作物上獲得登記[15]，也是防治香蕉葉斑病常見藥劑，在防治香蕉葉斑病中已使用多年。本研究測定了168株彎孢霉葉斑病菌對戊唑醇的敏感性，發(fā)現(xiàn)所有菌株對戊唑醇仍保持較好的敏感性，未出現(xiàn)敏感性下降的群體，但最敏感菌株和最抗菌株EC50相差15.36倍，可能存在潛在的抗藥性風(fēng)險。因此，藥劑使用應(yīng)當(dāng)合理選擇藥劑濃度或交替輪換其他殺菌劑，避免抗藥性發(fā)生。試驗比較了不同省(區(qū))菌株敏感性發(fā)現(xiàn)，不同省(區(qū))之間病菌敏感性存在一定差異，這可能是由于不同省(區(qū))之間生態(tài)位差異導(dǎo)致病害發(fā)生程度不同，導(dǎo)致各省(區(qū))的用藥水平、用藥次數(shù)等不同。敏感性基線建立是抗藥性監(jiān)測的重要依據(jù)，國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種病原菌對藥劑的敏感性基線；而目前香蕉葉斑病的研究主要集中于室內(nèi)藥劑篩選和田間藥劑防治，鮮見關(guān)于香蕉彎孢霉葉斑病菌殺菌劑敏感性基線的報道。本文建立了彎孢霉葉斑病菌對戊唑醇的敏感性基線，可為香蕉彎孢霉葉斑病菌的抗藥性監(jiān)測提供重要參考。

室內(nèi)藥劑誘導(dǎo)和紫外線誘導(dǎo)是獲得抗性突變菌株常見的方法，本研究通過這兩種方法僅獲得少量抗性突變體，抗性頻率和抗性倍數(shù)較低。當(dāng)病原菌對藥劑產(chǎn)生抗性時，往往伴隨著一系列生物學(xué)特性的改變[16]，本研究對誘導(dǎo)獲得的抗性突變菌株開展生物學(xué)特性測定發(fā)現(xiàn)，抗性突變菌株菌絲生長速度、菌絲干質(zhì)量均低于親本菌株，僅有少量抗性菌株抗性可以穩(wěn)定遺傳，說明抗性菌株適合度比較低。因此，推測香蕉彎孢霉葉斑病菌對戊唑醇的抗性風(fēng)險較低，生產(chǎn)上可繼續(xù)使用戊唑醇防治香蕉彎孢霉葉斑病。

戊唑醇作為重要的三唑類殺菌劑，被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)，主要抑制麥角甾醇的生物合成，其抗藥性一直備受關(guān)注。近些年隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從分子水平可以闡述其抗性機(jī)理。研究發(fā)現(xiàn)，病原菌對戊唑醇的抗藥性可能與靶標(biāo)基因發(fā)生堿基突變、靶標(biāo)基因過量表達(dá)、病原菌對藥劑的外排能力增強(qiáng)、靶標(biāo)同源基因補(bǔ)償有關(guān)[17]。當(dāng)戊唑醇的靶蛋白編碼基因(CYP51)發(fā)生堿基突變，促使靶標(biāo)蛋白構(gòu)象改變，導(dǎo)致藥劑與靶標(biāo)蛋白的結(jié)合能力下降，從而引發(fā)病原菌抗藥性產(chǎn)生[18-19]。當(dāng)CYP51基因過量表達(dá)，會產(chǎn)生過多的靶標(biāo)蛋白，從而使藥劑濃度增加，導(dǎo)致藥劑抗藥性產(chǎn)生[20]。ABC或MFS運輸?shù)鞍资墙z狀真菌轉(zhuǎn)運毒素的外排泵，當(dāng)轉(zhuǎn)運蛋白被過度表達(dá)，會降低藥劑對細(xì)胞的毒害作用，從而產(chǎn)生抗藥性[21]。靶標(biāo)基因存在多個旁系同源基因，當(dāng)靶標(biāo)蛋白受到殺菌劑抑制時，旁系同源基因會被誘導(dǎo)表達(dá)，維持細(xì)胞的正常生理作用，從而導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生[22]。殺菌劑抗藥性涉及面較廣，本文只從藥劑敏感性、藥劑誘導(dǎo)和紫外誘導(dǎo)評價香蕉彎孢霉葉斑病對戊唑醇的抗藥性，抗性菌株的抗性機(jī)理有待進(jìn)一步研究。