龍眼“華農(nóng)早”×荔枝“紫娘喜”F1真實性鑒定及果實品質(zhì)性狀多樣性分析

羅舒文，劉夢秋，劉麗琴，王佳卉，胡小文，王一承，周建男，石勝友

(1 海南大學(xué)園藝學(xué)院，?？冢?70228；2 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，廣東湛江，524091；3 重慶市北碚區(qū)經(jīng)濟作物技術(shù)推廣站，重慶，400799)

龍眼DimocarpuslonganaLour.和荔枝LitchichinensisSonn.同屬無患子科(Sapindaceae)，分別為龍眼屬和荔枝屬中最重要的南方經(jīng)濟果樹。目前，龍眼品種選育以實生選種和雜交育種為主[1]。由于我國龍眼主栽品種“石硤”(平均單果質(zhì)量8.5 g)和“儲良”(平均單果質(zhì)量12.0 g)果實偏小，不具備泰國龍眼果大(單果質(zhì)量≥14.0 g)的優(yōu)勢，在國內(nèi)外市場上缺乏競爭力，因此迫切需要選育大果形優(yōu)質(zhì)龍眼品種。自20世紀(jì)80年代末以來，我國已經(jīng)通過實生選種和雜交育種選育了36個新品種[2]，但仍然沒有解決上述問題。因此，利用和挖掘?qū)匍g優(yōu)異資源基因，開辟新的育種方法，是實現(xiàn)屬種間基因轉(zhuǎn)移的重要途徑之一[3]。

1994年澳大利亞McConchie等首次實現(xiàn)了“荔枝×龍眼”的突破，2007年華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉成明教授首先在“紫娘喜”荔枝ד石硤”龍眼上獲得了2株屬間真雜種(“紫石1號”和“紫石6號”)[4-5]，隨后開展了早熟龍眼ד紫娘喜”荔枝雜交，獲得19株真雜種[6]。2012年本課題組選用“華農(nóng)早”龍眼為母本，“紫娘喜” 荔枝為父本進行屬間雜交，獲得雜交苗141株。本研究開發(fā)特異性RAPD分子標(biāo)記鑒定雜交后代的真實性，并對部分雜交后代果實品質(zhì)性狀的多樣性進行分析，期望為龍眼優(yōu)質(zhì)品種的選育提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2012年，我們通過人工雜交授粉創(chuàng)制了“華農(nóng)早”龍眼ד紫娘喜”荔枝雜交組合，獲得種子203粒，于當(dāng)年7月播種在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所龍眼育種資源圃，獲得雜交后代141份，用HZ表示。

1.2 雜種真實性鑒定

1.2.1 提取基因組DNA 2021年5月，采集親本和雜交群體的葉片，參考Murray等[7]、Stephen等[8]和劉成明等[9]的方法，使用CTAB法提取其基因組DNA，然后使用1%瓊脂糖電泳檢測DNA，用凝膠成像儀檢測DNA的完整性，并用紫外分光光度計進行質(zhì)量和濃度的初步測定。把檢測好的DNA稀釋至50 ng/μL后，放置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 RAPD-PCR擴增 提取好的基因組DNA作為模板，進行PCR擴增。參考Williams等[10]、郭印山等[11]和盧博彬等[12]的方法，PCR擴增反應(yīng)體系為：反應(yīng)總體積為25 μL，其中包括10×PCR buffer(15 mmol/L Mg2+)2.5 μL，25 mmol/L MgCl20.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.0 μL，5 μmol/L 擴增引物1 μL，50 ng/μL基因組DNA 3.0 μL，5U/μL Taq酶0.20 μL，用ddH2O補足至25 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，38 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共進行35個循環(huán)；然后72 ℃延伸5 min,于4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳分離，并拍照記錄。

1.2.3 雜種后代真實性鑒定 篩選能擴增出父本特征性條帶，且在父本自交后代群體中不發(fā)生分離的純合顯性RAPD分子標(biāo)記，用于雜交后代的真實性鑒定；然后利用父本的純顯性標(biāo)記對雜交后代進行逐一篩選，能擴增出父本特征帶的后代鑒定為真雜種，沒有父本特征帶的后代鑒定為假雜種。

1.3 果實品質(zhì)性狀多樣性分析

1.3.1 果實品質(zhì)性狀調(diào)查與測定 2019—2021年，連續(xù)3年取雜交群體中開花結(jié)果的59個單株觀測其果實品質(zhì)性狀。在果實成熟期(7月上旬)采收果穗運回實驗室，每份材料選取大小一致、無病蟲害的果實20個，使用游標(biāo)卡尺、電子天平和手持式糖度計，調(diào)查并測定的數(shù)量性狀包括：果實質(zhì)量、縱橫側(cè)徑，果核質(zhì)量、縱橫側(cè)徑，果皮厚度、質(zhì)量和可溶性固形物。質(zhì)量性狀測定參考《龍眼種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[13]，制訂統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)表型賦值(見表1)。

參考黃愛萍等[14]和石勝友等[15]的方法，對數(shù)量性狀進行分級，將數(shù)量性狀分為10級，1級<平均值-2s，10級≥平均值+2s，中間每級相差0.5s，s為標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3.2 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用Excel統(tǒng)計并整理原始數(shù)據(jù)，計算數(shù)量性狀的最大值、最小值、平均值、變異系數(shù)和多樣性指數(shù)，計算質(zhì)量性狀的多樣性指數(shù)，比較性狀的變異程度。其中變異系數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值。果實品質(zhì)多樣性用Shannon-Weinner多樣性指數(shù)(H’)表示。多樣性指數(shù)計算公式為：H’=-∑PilnPi，式中Pi為某一性狀第i類材料份數(shù)所占的比例，ln為自然對數(shù)[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 純顯性RAPD標(biāo)記篩選

采用30對引物對兩個親本進行擴增篩選，根據(jù)父本特異條帶的有無，共得到6對引物；然后用這些引物對父本“紫娘喜”自交后代群體進行擴增分析，發(fā)現(xiàn)有1個標(biāo)記的兩個特異條帶在父本自交群體中均沒有發(fā)生分離，即引物T4，大概率判斷這個標(biāo)記是純顯性標(biāo)記，可用于龍眼“華農(nóng)早”ד紫娘喜”荔枝F1代雜種真實性的鑒定。

2.2 雜種真實性鑒定

應(yīng)用篩選出的純顯性標(biāo)記對141個“華農(nóng)早”龍眼ד紫娘喜”荔枝雜種后代單株進行真實性鑒定，以有無父本特異性條帶為判斷標(biāo)準(zhǔn)。鑒定結(jié)果表明，共有100株能擴增出父本的純合顯性標(biāo)記，為真雜種；41株未擴增出父本特異性條帶，為假雜種。F1真雜種率為70.9%。

2.3 雜交后代果實品質(zhì)多樣性分析

2.3.1 質(zhì)量性狀多樣性分析 對F1果實質(zhì)量性狀多樣性分析表明，14個質(zhì)量性狀的Shannon-Weaver多樣性指數(shù)在0.61～1.50之間。其中種子顏色的多樣性指數(shù)最高，為1.50。離核難易的多樣性指數(shù)最低，為0.56(見表2)。說明雜交后代的果實質(zhì)量性狀變異類型豐富，果實多樣性程度較高。

果實性狀：果實形狀有近圓形、側(cè)扁圓形、橢圓形3種，其中側(cè)扁圓形和近圓形占絕大部分。側(cè)扁圓形的最多，共有30份，占比50.8%；近圓形的有28份，占比47.5%；橢圓形的僅有1份，占比1.7%。果肩性狀主要有單肩隆起、雙肩隆起和平。其中果肩平的有42份，占比71.2%;單肩隆起和雙肩隆起較少，分別有9份和8份，分別占比15.3%和13.6%。果頂形狀分為鈍圓、漸圓、圓形、渾圓，主要以圓形和渾圓為主，果頂圓形和渾圓的分別是33份和24份，占比55.9%和40.7%;果頂鈍圓和漸圓各有1份，各占比1.7%。

果皮性狀：果皮顏色有黃綠色、黃褐色、褐色、黑褐色等4種;其中黃褐色最多，有43份，占比72.9%，褐色有14份，占比23.7%，黃綠色和褐色各有1份，占比1.7%。果皮龜裂紋分明顯和不明顯，其中龜裂紋明顯的較多，有37份，占比62.7%；不明顯的有22份，占比37.3%。疣狀突起分為無、不明顯、較明顯和明顯;疣狀突起不明顯的最多，有23份，占比39.0%；疣狀突起較明顯、明顯和無的分別有14、11和11份，分別占23.7%、18.6%和18.6%。果皮粗糙度分光滑、較粗糙和粗糙，果皮較粗糙有23份，占比38.98%；果皮光滑和粗糙各有18份，占比30.51%。

果肉性狀：果肉顏色有蠟黃、蠟白、乳白、乳白帶血絲4種，其中蠟白色最多，有45份，占比76.3%；乳白的有10份，占比16.9%；蠟黃和乳白帶血絲分別有2份，占比3.4%。果肉質(zhì)地分為軟和脆兩種，果肉脆的有37份，占比62.7%；果肉軟的有22份，占比37.3%。果汁分為少量、中量和多量3種;果汁中量的有27份，占比45.76%；果汁多量的有18份，占比30.51%；果汁少量的有14份，占比23.73%。果肉透明度分不透明、半透明和透明3種，主要為不透明和半透明，分別有34份和22份，分別占比57.6%和37.3%；透明有3份，占比5.1%?；潭确只?、略帶渣和不帶渣，略帶渣和不帶渣的較多，分別有26份和24份，分別占比44.1%和40.7%；化渣的有9份，占比15.3%。

種子性狀：離核難易情況分為易、較易和難，離核易有45份，占比76.3%；離核較易和難分別有13份和1份，分別占比22.0%和1.7%。種子顏色較豐富，分為紅褐色、赤褐色、淺褐色、深褐色、紫黑色和漆黑色6種。其中紫黑色最多，有24份，占比40.68%；其次是深褐色和漆黑色，分別有16份和8份，分別占27.12%和13.56%；赤褐色、紅褐色和淺褐色較少，分別有5份、4份和2份，占比8.47%、6.78%和3.39%。種子顏色的多樣性指數(shù)最高，為1.50，說明雜交后代的種子顏色具有豐富的多樣性。

2.3.2 數(shù)量性狀多樣性分析 13個數(shù)量性狀的變異系數(shù)在6.58%～19.36%之間，Shannon-Weaver多樣性指數(shù)變化范圍為1.15～2.20，高于質(zhì)量性狀的多樣性指數(shù)，表明雜交后代果實的數(shù)量性狀比質(zhì)量性狀多樣性豐富。其中果肉質(zhì)量和果皮質(zhì)量的變異系數(shù)較高，分別為19.36%和18.21%；果皮質(zhì)量和果核質(zhì)量的多樣性指數(shù)較高，分別為2.20和2.19；果核側(cè)徑和可食率的變異系數(shù)較低，分別為8.44%和6.58%，它們的多樣性指數(shù)也較低，分別為1.16和1.15。

果實大小：單果質(zhì)量平均值為9.36 g，標(biāo)準(zhǔn)差為1.44，變異系數(shù)為15.41%，多樣性指數(shù)為1.77；單果質(zhì)量最大的是HZ131，達到13.22 g；單果質(zhì)量最小的是HZ61，僅有6.89 g。單果縱徑的平均值為24.20 mm，標(biāo)準(zhǔn)差為2.06，變異系數(shù)為8.53%，多樣性指數(shù)是1.66；單果縱徑最大的是HZ105-2，為27.00 mm；最小的是HZ158，為11.92 mm。單果橫徑的平均值為26.26 mm，標(biāo)準(zhǔn)差為2.27，變異系數(shù)為8.66%，多樣性指數(shù)為1.92；單果橫徑最大的是HZ131，為30.18 mm；最小的是HZ158，為14.22 mm。單果側(cè)徑的均值為23.35 mm，標(biāo)準(zhǔn)差為2.03，變異系數(shù)為8.72%，多樣性指數(shù)為1.66；單果側(cè)徑最大的是HZ131，為27.33 mm，最小的是HZ158，為11.15 mm。2021年，我們發(fā)現(xiàn)了1個優(yōu)株單果質(zhì)量平均為17.6 g，最大達到19.3 g。

果核大小：平均果核質(zhì)量為1.54 g，標(biāo)準(zhǔn)差為0.24，變異系數(shù)為15.75%，多樣性指數(shù)為2.19；其中果核質(zhì)量最大的是HZ127，為2.10 g；最小的是HZ176，為1.11 g。果核縱徑的平均值為13.87 mm，標(biāo)準(zhǔn)差為1.19，變異系數(shù)為8.58%，多樣性指數(shù)為1.27；果核縱徑最大的是HZ127，為15.61 mm；最小的是HZ105-2，為7.02 mm。果核橫徑的平均值為13.75 mm，標(biāo)準(zhǔn)差為1.28，變異系數(shù)為9.29%，多樣性指數(shù)為1.42；果核橫徑最大的是HZ127，為16.33 mm；最小的是HZ105-2，為7.02 mm。果核側(cè)徑的平均值為11.45 mm，標(biāo)準(zhǔn)差為0.97，變異系數(shù)為8.44%，多樣性指數(shù)為1.16；果核側(cè)徑最大的是HZ127，為13.32 mm；最小的是HZ105-2，為5.08 mm。

果皮性狀：果皮厚度的均值為0.62 mm，標(biāo)準(zhǔn)差為0.10，變異系數(shù)為16.44%，多樣性指數(shù)是1.39；果皮厚度最大的是HZ123，為0.82 mm；最小的是HZ125-2，僅0.26 mm。果皮質(zhì)量的平均值是1.50 g，標(biāo)準(zhǔn)差是0.27，變異系數(shù)達18.21%；其中果皮質(zhì)量最大的是HZ131，達2.32 g；最小的是HZ61，為0.98 g。

果肉性狀：果肉質(zhì)量均值為6.33 g，標(biāo)準(zhǔn)差是1.22，變異系數(shù)達19.36%，多樣性指數(shù)為2.15；其中果肉質(zhì)量最大的是HZ9，為9.28 g；最小的是HZ123，為4.11g?？扇苄怨绦挝锞禐?9.47%，標(biāo)準(zhǔn)差是2.30，變異系數(shù)為11.84%，多樣性指數(shù)為2.09；其中可溶性固形物含量最高的是HZ40，達23.75%；含量最低的是HZ11，僅12.84%；可溶性固形物含量大于20%的有22份，占比37.29%。說明雜交后代在可溶性固形物含量上表現(xiàn)出不同程度的變異和多樣性?？墒陈实钠骄禐?7.18%，標(biāo)準(zhǔn)差是0.04，變異系數(shù)最低，僅6.58%，多樣性指數(shù)也最低，為1.15；其中HZ9的可食率最高，為75.34%；HZ123的可食率最低，為54.78%；可食率大于70%的有16份，占比27.12%(見表3和圖3)。

圖3 “華農(nóng)早”龍眼ד紫娘喜”荔枝雜交后代F1果實與其最大單果

表3 “華農(nóng)早”龍眼ד紫娘喜”荔枝雜交后代單株(HZ)果實數(shù)量性狀

3 結(jié)論與討論

雜種鑒定是遠緣雜交育種的重要環(huán)節(jié)，特別是荔枝和龍眼都具有花性復(fù)雜、多批次開花的特點，很容易發(fā)生自交而產(chǎn)生假雜種[4]。龍眼中常用的分子標(biāo)記有AFLP、RAPD、SSR等，RAPD分子標(biāo)記具有操作簡便、所需DNA樣品少、分析速度快、多態(tài)性豐富的優(yōu)點[17]。本研究篩選了父本純顯性RAPD分子標(biāo)記，用于 “華農(nóng)早”龍眼ד紫娘喜”荔枝雜交群體的真實性鑒定，鑒定結(jié)果共獲得真雜種100株，F(xiàn)1真雜種率為70.9%。

雜交后代果實品質(zhì)性狀的鑒定評價是種質(zhì)資源創(chuàng)新利用的重要手段[18]。龍眼的果實品質(zhì)性狀包括果實大小、果皮厚度、果肉顏色、可溶性固形物含量等，這些性狀是選育龍眼種質(zhì)新材料的重要指標(biāo)。本研究采用Shannon-Weaver多樣性指數(shù)(H′)，對真雜種中59份開花結(jié)果單株的14個質(zhì)量性狀和13個數(shù)量性狀進行了多樣性分析。數(shù)量性狀的多樣性指數(shù)(1.16～2.20)比質(zhì)量性狀的多樣性指數(shù)(0.61～1.50)高，表明雜交后代果實的數(shù)量性狀比質(zhì)量性狀多樣性豐富。其中果皮質(zhì)量和果核質(zhì)量的多樣性指數(shù)較高，分別為2.20和2.19；離核難易情況的多樣性指數(shù)最低，為0.56。變異系數(shù)大小反映品種固有特征及生物產(chǎn)品的個體差異范圍[19]。13個數(shù)量性狀的變異系數(shù)在6.58%～19.36%之間，表明雜交后代間果實品質(zhì)多樣性較高，發(fā)生了不同程度的遺傳變異，為將來篩選龍眼種質(zhì)新材料提供了基礎(chǔ)。

由于龍眼與荔枝雜交后代表現(xiàn)出典型的偏母遺傳現(xiàn)象[20]，所以“華農(nóng)早”龍眼ד紫娘喜”荔枝F1果實與龍眼相似。在雜交后代中平均單果質(zhì)量超過母本“華農(nóng)早”(9.1 g)的有33株，占55.93%。雜交后代中平均單果質(zhì)量超過我國龍眼主栽品種“儲良”(12.0 g)的有3株，分別為HZ3、HZ9、HZ131。2021年，我們發(fā)現(xiàn)的1個優(yōu)株平均單果質(zhì)量(17.6 g，最大單果質(zhì)量19.3 g)大于“大烏圓”龍眼(16.3 g)，且可溶性固形物含量(≥20.0%)、可食率(≥70%)等品質(zhì)性狀都優(yōu)于“大烏圓”，有望應(yīng)用于解決龍眼大果優(yōu)質(zhì)種質(zhì)缺少的問題。由于這個單株只有1年的數(shù)據(jù)，因此未列入本論文中的多樣性分析。