褐飛虱Nl15基因的克隆及功能分析

王福鑫, 王渭霞, 魏 琪, 何佳春, 賴(lài)?guó)P香, 傅 強(qiáng), 萬(wàn)品俊

(中國(guó)水稻研究所, 水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 杭州 310006)

褐飛虱Nilaparvatalugens屬半翅目(Hemiptera)飛虱科(Delphacidae)，通過(guò)刺吸式口器吸食水稻韌皮部汁液和傳播水稻病毒侵害水稻危害水稻，嚴(yán)重時(shí)被害水稻顆粒無(wú)收。我國(guó)自20世紀(jì)80年代以來(lái)，褐飛虱發(fā)生面積約占水稻種植面積的50%，年均損失稻谷仍達(dá)10～15億kg(郭予元, 2015)。 目前，化學(xué)防治仍是控制褐飛虱為害的主要手段，然而不合理地使用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致害蟲(chóng)抗性產(chǎn)生，引起褐飛虱再猖獗，同時(shí)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染(吳孔明, 2018)。

利用水稻自身抗性是有效、經(jīng)濟(jì)、安全地防治褐飛虱的措施(任西明等, 2017)。自1967年國(guó)際水稻研究所(International Rice Research Institute, IRRI)率先報(bào)道了抗褐飛虱的水稻資源后，含Bph1,bph2,Bph3和bph4等基因的抗性水稻品種先后在我國(guó)和東南亞等地大面積應(yīng)用(Pathaketal., 1969; Athwaletal., 1971; Liuetal., 2015; Sogawa, 2015)。然而，在20世紀(jì)70年代，水稻IR26(含Bph1)和IR36(含bph2)等抗蟲(chóng)品種在推廣2～8年后，褐飛虱對(duì)水稻品種的致害性發(fā)生明顯的變化，形成不同的褐飛虱生物型或種群(如Mudgo、ASD7種群等)，使原本抗蟲(chóng)的水稻品種變?yōu)楦邢x(chóng)，水稻品種抗性“喪失”(Varca and Feuer, 1976; Gallagheretal., 1994)。近年來(lái)，在我國(guó)云南等部分地區(qū)，由于褐飛虱致害性的變化，含Bph3 基因的Rathu Heenati水稻品種也存在對(duì)褐飛虱抗性喪失的風(fēng)險(xiǎn)(黃所生等, 2014; 李波等, 2019)。在室內(nèi)，脅迫飼養(yǎng)褐飛虱田間種群可以形成褐飛虱IR56種群，該種群可致害含Bph3的IR56水稻品種(鄭瑜等, 2016)。然而，新的褐飛虱種群形成及其與水稻抗蟲(chóng)基因的關(guān)系，特別是兩者間的分子機(jī)制尚屬空白。在水稻中，凝集素受體激酶(lectin receptor kinase, LecRK)和核苷酸結(jié)合位點(diǎn)-富含亮氨酸的重復(fù)序列(nucleotide-binding site and leucine-rich-repeat, NBS-LRR)分別感受來(lái)自褐飛虱釋放的植食性昆蟲(chóng)相關(guān)分子模式(herbivore-associated molecular pattern, HAMP)和效應(yīng)子(effector)信號(hào)，形成自身的第一層防御系統(tǒng)模式觸發(fā)免疫(pattern-triggered immunity, PTI)和第二層防御系統(tǒng)效應(yīng)子觸發(fā)免疫(effector-triggered immunity, ETI)(杜波等, 2016)。相對(duì)應(yīng)地，褐飛虱通過(guò)唾液效應(yīng)子或腸道蛋白、微生物來(lái)適應(yīng)(或?qū)?植物的抗蟲(chóng)防御反應(yīng)(Petrova and Smith, 2014; Pengetal., 2017; Haoetal., 2018; Shangguanetal., 2018; Jietal., 2021; Liuetal., 2021)。近年來(lái)，褐飛虱唾液效應(yīng)子和激發(fā)子的鑒定取得重要進(jìn)展。研究人員通過(guò)高通量測(cè)序、蛋白組學(xué)等技術(shù)，在不同褐飛虱種群(TN1, Mudgo, ASD7, YHY15和Leersia種群)中鑒定出近千個(gè)唾液蛋白基因及其編碼蛋白(Jietal., 2013; Liuetal., 2016; Huangetal., 2018; Raoetal., 2019)。其中，褐飛虱TN1種群中的Catalase(Petrova and Smith, 2014)、NlMLP(Shangguanetal., 2018)、NlSP1 (Huangetal., 2020)和NlugOBP11 (Liuetal., 2021)以及Mudgo種群中的NlEG1 (Jietal., 2017)和NlSEF1(Yeetal., 2017) 6個(gè)唾液蛋白基因的功能取得突破性進(jìn)展。與之相比，尚未見(jiàn)褐飛虱IR56種群中唾液蛋白基因克隆和功能的研究。我們前期構(gòu)建了褐飛虱TN1種群和IR56種群的頭部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息學(xué)篩選出2 563個(gè)差異表達(dá)基因，從中挖掘出一個(gè)功能未知基因Nl15(在IR56種群中的相對(duì)表達(dá)量是TN1種群中的5倍)。本研究以褐飛虱TN1種群和IR56種群為主要研究對(duì)象，通過(guò)基因克隆、時(shí)空表達(dá)譜、RNAi和生物學(xué)測(cè)定，探究Nl15在褐飛虱IR56等致害性種群中的功能，為解析褐飛虱與水稻防御與反防御互作的分子機(jī)制以及闡明褐飛虱克服水稻抗性的機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)與水稻

供試褐飛虱為室內(nèi)飼養(yǎng)的TN1種群和IR56種群(源自2010年在杭州富陽(yáng)田間采集的種群，中國(guó)水稻研究所)，在感蟲(chóng)TN1水稻和抗蟲(chóng)IR56水稻上連續(xù)飼養(yǎng)所得，飼養(yǎng)條件為溫度28℃±1℃，相對(duì)濕度80%±10%，光周期14L∶10D。2個(gè)褐飛虱種群的所有齡期樣本為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)的樣品數(shù)目為：卵100粒、1-5齡若蟲(chóng)20頭、雌雄成蟲(chóng)(初羽化后48 h內(nèi))各10頭；解剖鏡下分離150頭短翅型雌成蟲(chóng)(初羽化48 h內(nèi))用于解剖頭、胸、腹和足，以上樣品置于1.5 mL的Eppendorf管中經(jīng)液氮處理后，-80℃冰箱保存，用于總RNA提取。

1.2 總RNA 提取與cDNA 的合成

將1.1節(jié)各發(fā)育階段褐飛虱(卵質(zhì)量或蟲(chóng)質(zhì)量為8 mg)及雌成蟲(chóng)頭、胸、腹和足(各組織鮮質(zhì)量約2 mg)，每組織重復(fù)取樣3次，利用Trizol法(Invitrogen，美國(guó))提取總RNA，通過(guò)微量紫外分光光度儀(NanoDrop 2000，美國(guó))和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度和質(zhì)量。采用ReverTra Ace qPCR RT Kit(東洋紡生物科技有限公司，上海)試劑盒的步驟合成cDNA第1鏈。

1.3 基因克隆與序列分析

基于褐飛虱IR56種群頭部轉(zhuǎn)錄組序列(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建且尚未發(fā)表)，檢索到1個(gè)轉(zhuǎn)錄本Nl15[基因表達(dá)量FPKM(fragments per kilobase per million mapped fragments)≥10.1]，并利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)目的基因的擴(kuò)增引物(表1)。以褐飛虱IR56種群的不同齡期cDNA混合并作為模板，利用LA Taq聚合酶(TaKaRa，大連)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系： LA Taq (5 U/μL) 0.12 μL, 10×PCR緩沖液2.5 μL, dNTP Mix(2.5 mmol/L)2.0 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA 模板(500 ng/μL)1 μL, ddH2O 17.38 μL。PCR反應(yīng)程序： 94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1.5 min, 35次循環(huán); 72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，通過(guò)DNA回收試劑盒(Promega，美國(guó))純化，連接于pEASY-T3載體(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)，導(dǎo)入pEAST-T1感受態(tài)細(xì)胞(全式金生物技術(shù)有限公司)，隨機(jī)挑選4個(gè)陽(yáng)性克隆子送杭州尚亞生物科技有限公司測(cè)序。

對(duì)測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆子進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用BioEdit(v7.0.5.3)進(jìn)行序列比對(duì)和拼接；利用NCBI 的Blastx 工具(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源基因搜索；利用在線(xiàn)工具ORF Finder (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF)及蛋白質(zhì)翻譯情況；利用Computer pI/Mw工具(http:∥web.expasy.org/compute_pi)預(yù)測(cè)氨基酸的理論等電點(diǎn)和分子量；利用在線(xiàn)工具SignalP 5.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析N末端信號(hào)肽序列;利用TMHMM 2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域；利用NetNGlyc 1.0 (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)預(yù)測(cè)糖基化位點(diǎn)；利用SMART(http:∥smart.embl.de)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)功能域。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 qPCR檢測(cè)Nl15的表達(dá)模式

根據(jù)1.3節(jié)克隆的褐飛虱Nl15序列設(shè)計(jì)引物(表1)，以NlActin和NlRPS15為內(nèi)參基因(引物序列見(jiàn)表1)，以1.2節(jié)合成的褐飛虱TN1和IR56種群各發(fā)育階段和雌成蟲(chóng)不同組織的cDNA為模板，進(jìn)行qPCR。PCR反應(yīng)體系(25 μL): SYBR Green Realtime PCR Master Mix(東洋紡生物科技有限公司, 日本)12.5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, cDNA模板2 μL, ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序: 95℃ 1 min; 95℃ 15 s, 60℃ 15 s, 40次循環(huán)。qPCR均滿(mǎn)足的最低要求試驗(yàn)信息量(MIQE)標(biāo)準(zhǔn)(Bustinetal., 2009)，每樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.5 Nl15的RNAi

根據(jù)1.3節(jié)克隆的褐飛虱Nl15和GFP序列設(shè)計(jì)dsRNA引物(表1)。 參考MEGAscript RNAi(Ambion, 美國(guó))試劑盒說(shuō)明書(shū)合成dsRNA，dsRNA的質(zhì)量和濃度檢測(cè)同1.2節(jié)。

參考Wan等(2019)的方法，選取褐飛虱TN1和IR56種群4齡若蟲(chóng)，在其胸部節(jié)間膜顯微注射50 ng(約60 nL)Nl15的dsRNA(以注射等量dsGFP為對(duì)照組)。注射后置于IR56水稻(出芽30 d后)，于1 d后，剔除死亡的褐飛虱，開(kāi)始逐日觀察(持續(xù)8 d)試蟲(chóng)的死亡數(shù)和存活數(shù)。共設(shè)置12個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)40頭試蟲(chóng)。其中，3個(gè)重復(fù)用于生物學(xué)測(cè)定，9個(gè)重復(fù)(每個(gè)重復(fù)5頭若蟲(chóng))用于注射后3 d靶基因Nl15表達(dá)量檢測(cè)，qPCR同1.4節(jié)。待試蟲(chóng)羽化后，采用“Parafilm sachet”法(Pathaketal., 1982)測(cè)定蜜露量；參考鄭瑜等(2016)的方法收取初羽化1 d內(nèi)的雌成蟲(chóng)，逐頭稱(chēng)量試蟲(chóng)體重，置于石蠟小袋中(1頭/袋)并固定在IR56水稻(60 d苗齡)葉鞘并在該處標(biāo)記，1 d后測(cè)定每頭雌成蟲(chóng)的體質(zhì)量增量。每個(gè)處理至少測(cè)定25個(gè)個(gè)體。

在褐飛虱4齡若蟲(chóng)中注射dsRNA后連續(xù)取食IR56水稻植株3 d，收取整株水稻的葉鞘提取總RNA，方法同1.2節(jié);檢測(cè)水稻中防御相關(guān)基因OsLecRK4(GenBank登錄號(hào): KF748981),OsMPK10(GenBank登錄號(hào): NP_001385207.1),OsWRKY24(GenBank登錄號(hào): AY676925.1),OsLox(GenBank登錄號(hào): OSU72251),OsNPR1(GenBank登錄號(hào): GU722160.1)和OsGns5(GenBank登錄號(hào): AAD10382.1)的表達(dá)量，qPCR同1.4節(jié)。內(nèi)參基因OsActin和OsUbiquitin(OsUbq)的引物均引自參考文獻(xiàn)(表1)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

基因表達(dá)量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用Shapiro-Wilk和Levene方法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布性和方差齊性，兩組間比較采用Student氏t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，事后檢驗(yàn)采用Tukey氏法。采用Kaplan-Meier法計(jì)算存活率，并采用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存比較?；蛳鄬?duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法分析(Livak and Schmittgen, 2001)。用R 軟件包(tidyverse v1.3.1, rstatix v0.7.0, magricolae v1.3.5, survival v3.2.11, survminer v0.4.9和ggplot2 v3.3.4)完成數(shù)據(jù)清洗、變換、統(tǒng)計(jì)分析與繪圖。

2 結(jié)果

2.1 褐飛虱Nl15基因序列

PCR擴(kuò)增獲得褐飛虱Nl15 cDNA(GenBank登錄號(hào): OK181113)，長(zhǎng)1 353 bp，符合預(yù)期長(zhǎng)度，與轉(zhuǎn)錄組中的Nl15序列一致，由此證明轉(zhuǎn)錄組序列的正確性。推導(dǎo)的Nl15編碼蛋白質(zhì)序列包含335個(gè)氨基酸。雙序列比對(duì)結(jié)果表明，Nl15與褐飛虱參考基因組(GenBank登錄號(hào): GCF_014356525.1)中同源基因編碼的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào): XP_039291559)一致性達(dá)79%，與灰飛虱Laodelphaxstriatellus同源蛋白hypothetical protein(GenBank登錄號(hào): RZF48609.1)的氨基酸序列一致性達(dá)45%，除此之外，未搜索到其他物種的同源基因。ORF Finder分析表明，Nl15包含1個(gè)長(zhǎng)度為1 008 bp的ORF，5′UTR和3′UTR長(zhǎng)度分別為195和150 bp，預(yù)測(cè)的分子質(zhì)量為38.7 kD，理論等電點(diǎn)為7.54；Nl15蛋白的N端包含長(zhǎng)度為23個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，不含跨膜結(jié)構(gòu)域及其他已知的功能結(jié)構(gòu)域；第152位的天冬酰氨酸殘基是N-連接糖基化位點(diǎn)。

2.2 Nl15基因在兩個(gè)褐飛虱種群中的時(shí)空表達(dá)譜

qPCR結(jié)果表明(圖1)，Nl15基因在褐飛虱TN1種群和IR56種群中的齡期和組織的表達(dá)模式相似，在3-4齡若蟲(chóng)中的相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于卵期、1-2齡若蟲(chóng)和雌成蟲(chóng)的(P<0.001)。在褐飛虱雌成蟲(chóng)頭部中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于在胸部、腹部和足中的(P<0.05)，并且在IR56種群頭部中Nl15的相對(duì)表達(dá)量顯著高于在TN1種群頭部中的(P<0.05)(數(shù)據(jù)未展示)。

圖1 Nl15基因在褐飛虱TN1(A, B)和IR56(C, D) 種群不同發(fā)育時(shí)期(A, C)和雌成蟲(chóng)不同組織(B, D)的表達(dá)模式Fig. 1 Expression profiles of Nl15 in different developmental stages (A, C) and female adult tissues (B, D) of TN1 (A, B) and IR56 (C, D) populations of Nilaparvata lugensE: 卵Egg; N1-5: 分別為1-5齡若蟲(chóng)1st-5th instar nymphs, respectively; FA: 雌成蟲(chóng)Female adult; MA: 雄成蟲(chóng)Male adult.圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同字母表示基因表達(dá)量在不同發(fā)育階段或不同組織間差異顯著(P<0.05, 單因素方差分析和Tukey氏HSD多重比較)。Data in the figure are mean±SE. Different letters above bars indicate significant difference in the gene expression level among different developmental stages and tissues (P<0.05, one-way ANOVA followed by Tukey’s HSD test).

2.3 RNAi對(duì)褐飛虱Nl15表達(dá)量和生物學(xué)性狀的影響

在褐飛虱TN1種群中，顯微注射dsNl15 3 d后，處理組(dsNl15注射組)中Nl15基因的相對(duì)表達(dá)量(0.18±0.04)顯著低于對(duì)照組(dsGFP注射組, 0.43±0.02)(F1,16=71.4,P<0.001)；在褐飛虱IR56種群中，注射dsNl15 3 d后，與注射dsGFP的對(duì)照組(0.15±0.01)相比，處理組Nl15基因的相對(duì)表達(dá)量(1.04±0.11)顯著降低了85.9%(F1,16=38.98,P<0.001)(圖2: A)。

圖2 褐飛虱TN1和IR56種群4齡若蟲(chóng)顯微注射dsRNA后若蟲(chóng)中Nl15的表達(dá)量(A)、存活率(B)以及成蟲(chóng)蜜露量(C)和體質(zhì)量增量(D)Fig. 2 Expression level of Nl15 (A) in nymphs, the survival rate (B), and the honeydew amount (C) and body weight gain (D) of adults of TN1 and IR56 populations of Nilaparvata lugens after microinjecting dsRNA into the 4th instar nymphs以dsGFP為對(duì)照組。A, C和D圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同字母表示基因表達(dá)量經(jīng)Tukey氏HSD檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)。B圖中數(shù)據(jù)采用Kaplan-Meier法計(jì)算，并采用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較。dsGFP injection group was used as the control group. Data in Figs. A, C, and D are mean±SE. Different letters above bars indicate significant differences (P<0.05) in the gene expression level analyzed by Tukey’s HSD test. Data in Fig. B were calculated by the Kaplan-Meier method and compared by the Log-rank test.

存活率曲線(xiàn)表明，顯微注射dsNl15和dsGFP后褐飛虱TN1種群的中位存活時(shí)間為9 d，顯微注射dsGFP后IR56種群未明顯死亡(死亡率僅為4.44%)，上述3個(gè)處理間的存活時(shí)間無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖2: B)。顯微注射dsGFP后的IR56種群成蟲(chóng)蜜露量最高(10.72±0.93 mg)，顯著高于顯微注射dsNl15的(3.13±0.32 mg)(P<0.05)，后者與顯微注射dsNl15(1.09±0.06 mg)和dsGFP(1.71±0.33 mg)的TN1種群蜜露量間均無(wú)顯著差異(圖2: C)。顯微注射dsGFP后IR56種群成蟲(chóng)體質(zhì)量增量(0.59±0.05 mg/頭)顯著高于顯微注射dsNl15的(0.33±0.03 mg/頭)(P<0.05)，前兩者的體質(zhì)量增量顯著高于顯微注射dsNl15(0.02±0.02 mg/頭)和dsGFP(0.03±0.05 mg/頭)的TN1種群的(P<0.05)(圖2: D)。

2.4 褐飛虱Nl15的RNAi對(duì)水稻中防御相關(guān)基因表達(dá)量的影響

qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，與注射dsGFP的褐飛虱TN1種群相比，注射dsNl15的褐飛虱TN1種群在IR56水稻植株上連續(xù)取食3 d后，5個(gè)水稻防御相關(guān)基因(OsLecRK4,OsWRKY24,OsLox，OsNPR1和OsGns5)的相對(duì)表達(dá)量未發(fā)生顯著變化(P>0.05)，而OsMPK10的相對(duì)表達(dá)量(t=-2.64,P<0.05)顯著上調(diào)(圖3: A)。Nl15被RNAi后的褐飛虱IR56種群4齡若蟲(chóng)在IR56水稻上連續(xù)取食3 d后，6個(gè)水稻防御相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量均發(fā)生顯著變化(OsLecRK4:t=-3.89,P<0.01;OsWRKY24:t=-2.43,P<0.05;OsMPK10:t=-2.37,P<0.05;OsNPR1:t=-4.17,P<0.01;OsLox:t=-3.49,P<0.01;OsGns5:t=-2.84,P<0.05)，與注射dsGFP的對(duì)照組相比，分別顯著提高了39.92%, 28.71%, 29.31%, 32.24%, 28.30%和28.66%(圖3: B)。

圖3 褐飛虱TN1(A)和IR56(B)種群4齡若蟲(chóng)顯微注射dsRNA后取食3 d對(duì)IR56水稻植株中防御相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig. 3 Effects of microinjection of dsRNA into the 4th instar nymphs of the TN1 (A) and IR56 (B) populations of Nilaparvata lugens on the expression levels of defense-related genes in IR56 rice plants fed for 3 d圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上星號(hào)、雙星號(hào)和ns分別代表與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)和不顯著(P>0.05)(T檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE. Asterisk, double asterisk and ns above bars indicate significant difference (P<0.05), extremely significant difference (P<0.01) and no significant difference (P>0.05), respectively, from the control group by T-test.

3 討論

本研究克隆了一個(gè)褐飛虱功能未知的基因Nl15，其編碼的氨基酸序列具有23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。分析發(fā)現(xiàn)，Nl15在Ji等(2013)、Liu等(2016)和Rao等(2019)報(bào)道的褐飛虱TN1, Mudgo, ASD7, YHY15和Leersia種群的唾液腺轉(zhuǎn)錄組中均表達(dá)(0.47

本研究通過(guò)同源分析發(fā)現(xiàn)，Nl15與灰飛虱同源蛋白hypothetical protein(GenBank登錄號(hào): RZF48609.1)的氨基酸序列一致性最高(45%)，沒(méi)有找到高度同源的其他物種的氨基酸序列，推測(cè)Nl15可能是快速進(jìn)化基因。在植物與病蟲(chóng)害協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，基因的快速進(jìn)化(正向選擇)使效應(yīng)子產(chǎn)生基因家族膨脹和物種特異性，導(dǎo)致難以通過(guò)同源搜索發(fā)現(xiàn)其他生物中的同源物(Boulainetal., 2018)。比如，在蚜蟲(chóng)中，C002,Mp1和Mp2等唾液分泌蛋白基因是一類(lèi)快速進(jìn)化基因，因其序列變異程度高，在其他生物中未發(fā)現(xiàn)同源基因(Pitino and Hogenhout, 2013)。 在3種癭蚊(Mayetioladestructor,Mayetiolahordei和Mayetiolaavenae)中，也存在因正向選擇產(chǎn)生的數(shù)十個(gè)物種特有的效應(yīng)子基因(Al-Jboryetal., 2018)。

本研究通過(guò)RNAi研究了Nl15在褐飛虱IR56種群的生物學(xué)功能，從研究結(jié)果來(lái)看，RNAi后IR56種群的存活率以及成蟲(chóng)蜜露量和體質(zhì)量增量均顯著降低(圖2)。存活率、蜜露量和體質(zhì)量增量是評(píng)價(jià)褐飛虱種群致害性的重要指標(biāo)，比如，非致害的褐飛虱TN1種群在抗蟲(chóng)IR56水稻上的這些指標(biāo)顯著低于致害的褐飛虱IR56種群的(鄭瑜等, 2016)。本研究結(jié)果表明，干擾Nl15基因的表達(dá)有效地降低了褐飛虱IR56種群的致害性指標(biāo)。對(duì)水稻防御信號(hào)基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，褐飛虱IR56種群取食水稻均可顯著誘導(dǎo)水稻防御相關(guān)基因OsLecRK4,OsMPK10,OsWRKY24，OsNPR1,OsLox和OsGns5基因的表達(dá)量顯著上調(diào)(圖3)。與之類(lèi)似，Nanda等(2018)發(fā)現(xiàn)，褐飛虱TN1種群取食后顯著提高了水稻中OsLecRK3/4,OsMPK3/5/7/10/12/13/14/16,OsNPR1和OsLox的相對(duì)表達(dá)量。其中，OsLecRK基因(OsLecRK1/2/3/4)是Liu等(2015)通過(guò)圖位克隆得到的Bph3基因，該基因是串聯(lián)排布并定位于細(xì)胞膜的基因簇。Bph3與2個(gè)褐飛虱種群(TN1種群和IR56種群)間的互作涉及多個(gè)反應(yīng)。Nanda等(2018)推測(cè)，褐飛虱TN1種群取食含Bph3的IR56水稻過(guò)程中，HAMP或激發(fā)子和質(zhì)外體效應(yīng)子，激發(fā)水稻模式識(shí)別受體OsLecRKs，進(jìn)一步激活MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，觸發(fā)第一層防御系統(tǒng)PTI，提高水楊酸、乙烯、次級(jí)代謝產(chǎn)物(如木質(zhì)素、植保素等)含量，促進(jìn)水稻的抗蟲(chóng)反應(yīng)；而在褐飛虱IR56種群取食過(guò)程中，其可能分泌質(zhì)外體或細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)子阻止PTI，產(chǎn)生效應(yīng)子激發(fā)的感病性(effector-triggered susceptibility, ETS)。此外，褐飛虱也可能分泌效應(yīng)子激發(fā)水稻的第二層防御反應(yīng)ETI。然而，褐飛虱唾液蛋白對(duì)應(yīng)的水稻ETI途徑尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，干擾Nl15的褐飛虱IR56種群能夠激發(fā)水稻OsLecRK4等PTI通路防御基因的相對(duì)表達(dá)量。因此，褐飛虱IR56種群中的Nl15可能參與水稻ETS反應(yīng)。然而，Nl15是否作為效應(yīng)子分泌至水稻葉鞘中，其下游的ETS分子網(wǎng)絡(luò)，仍需通過(guò)Western blot和酵母雙雜交等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，水稻ETS與PTI或ETI的分子關(guān)系也需進(jìn)一步研究。

干擾Nl15后，褐飛虱IR56種群取食顯著誘導(dǎo)IR56水稻中JA信號(hào)通路相關(guān)基因OsLox的相對(duì)表達(dá)量。Zhou等(2014)推斷JA不參與或負(fù)調(diào)控水稻對(duì)褐飛虱的抗性。然而，Zhao等(2019)和Xu等(2021)報(bào)道了褐飛虱取食激發(fā)JA信號(hào)途徑，并推斷JA信號(hào)正向調(diào)控水稻對(duì)褐飛虱的抗性，這與本研究的結(jié)果相一致。植物的抗性通路是極其復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)，存在多種激素及近千種次級(jí)代謝產(chǎn)物，它們?cè)诳剐苑磻?yīng)中并不相互獨(dú)立，而是存在相互作用；同樣，褐飛虱釋放的HAMP和效應(yīng)子種類(lèi)多、特異性高，在不同褐飛虱種群的組成也可能不同，這使得褐飛虱唾液蛋白與水稻抗蟲(chóng)分子物質(zhì)的互作更為復(fù)雜，仍需開(kāi)展大量的研究，進(jìn)而解析水稻對(duì)褐飛虱的抗性及褐飛虱對(duì)水稻的致害性。