LncRNA63及其共表達(dá)基因Hr3在家蠶中的表達(dá)和功能分析

王 博, 李苗苗, 王景婭, 胡曉玥, 闞云超, 喬惠麗

(南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院, 河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)重點實驗室, 河南南陽 473061)

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs, lncRNAs)是一類長度大于200個核苷酸、不參與或很少參與編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)源性RNA分子，由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成。最初被認(rèn)為是基因表達(dá)產(chǎn)物中的“轉(zhuǎn)錄噪音”。近年越來越多針對lncRNAs的功能研究表明，lncRNAs行使信號分子、誘餌分子、引導(dǎo)分子和支架分子的功能(Guptaetal., 2010; Kinoetal., 2010; Tsaietal., 2010; Matharu and Ahituv, 2015)。與mRNAs相比，lncRNAs主要存在于細(xì)胞核中，表達(dá)量比mRNAs低，保守性較低，具有時空表達(dá)特異性；與其他非編碼RNA相比，lncRNAs具有數(shù)量多、種類多和作用方式多等特點。近年來，隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，越來越多的lncRNAs被發(fā)現(xiàn)，在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中發(fā)現(xiàn)了2 602個lncRNAs(Youngetal., 2012; Lopez-Ezquerraetal., 2017)，在擬南芥Arabidopsisthaliana中發(fā)現(xiàn)了2 708個lncRNAs(Liuetal., 2012)，在玉米Zeamays中預(yù)測了20 163個lncRNAs(Lietal., 2014)。目前，有關(guān)lncRNAs的功能和作用機(jī)制研究取得了許多突破性的進(jìn)展，越來越多的研究表明lncRNAs主要從轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳3個層面進(jìn)行基因表達(dá)的調(diào)控，廣泛參與不同生物的多種生命活動過程(Geisleretal., 2013; Kornienkoetal., 2013; Dykes and Emanueli, 2017; Statelloetal., 2021)。

LncRNAs在昆蟲中的研究起步較晚，近幾年不同昆蟲物種中的lncRNAs相繼被鑒定(Youngetal., 2012; Etebarietal., 2015, 2016; Jayakodietal., 2015; Jenkinsetal., 2015; Nyberg and Machado, 2016)。Wu等(2016)在家蠶Bombyxmori基因組中挖掘出共11 810個lncRNAs，其中內(nèi)含子區(qū)lncRNAs 474個，基因間區(qū)lncRNAs 6 250個，反義lncRNAs 5 086個。Zhou等(2016)通過建立嚴(yán)格的lncRNAs篩選流程，進(jìn)一步篩選出6 821個lncRNAs，并建立了家蠶的ncRNA數(shù)據(jù)庫BmncRNAdb。LncRNAs在家蠶的絲腺發(fā)育、抗病毒和基因可變剪接中的功能研究也取得了一些進(jìn)展(Zhouetal., 2018; Wangetal., 2019; Zhangetal., 2020)，研究發(fā)現(xiàn)反義lncRNA在家蠶性別決定基因dsx的可變剪接中發(fā)揮功能(Xuetal., 2019)。但由于lncRNAs具有數(shù)量多、種類多、作用方式多和保守性低等特點，昆蟲中很多l(xiāng)ncRNAs的功能和調(diào)控機(jī)制還不清楚。

昆蟲的發(fā)育調(diào)控在農(nóng)業(yè)害蟲防治和經(jīng)濟(jì)昆蟲品種改良中具有十分重要的作用。已知昆蟲的變態(tài)發(fā)育過程受蛻皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)和保幼激素(juvenile hormone, JH)的協(xié)同調(diào)控(Truman, 2019)。昆蟲的脂肪體是參與能量代謝的主要組織，不僅提供昆蟲不同發(fā)育階段的能量需求，同時在幼蟲到蛹的變態(tài)發(fā)育過程中經(jīng)歷復(fù)雜的器官重建過程，20E調(diào)控脂肪體的細(xì)胞自噬和凋亡在昆蟲變態(tài)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用(Ihry and Bashirullah, 2014; Huetal., 2016; Lietal., 2020)。在果蠅中，研究人員發(fā)現(xiàn)20E可使中腸和脂肪體組織中與能量代謝相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)，從而抑制其代謝活性并起始變態(tài)(Whiteetal., 1999; Becksteadetal., 2005)。同樣，在家蠶幼蟲蛻皮和化蛹過程中，20E可抑制脂肪體中糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)(Tianetal., 2010)。進(jìn)一步研究表明，家蠶變態(tài)期中腸和絲腺細(xì)胞中自噬和凋亡的發(fā)生與體內(nèi)20E滴度水平的變化相關(guān)，同時20E和饑餓處理可誘導(dǎo)家蠶幼蟲脂肪體細(xì)胞自噬和凋亡的發(fā)生(Mizoguchietal., 2002; Tianetal., 2013; Xieetal., 2016)。但lncRNAs是否參與20E誘導(dǎo)的家蠶變態(tài)發(fā)育過程還未見報道。

本課題組在前期工作中通過構(gòu)建家蠶脂肪體的12個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，鑒定出1 035個lncRNAs，166個顯著差異表達(dá)的lncRNAs與20E的響應(yīng)有關(guān)，其中l(wèi)ncRNA63在20E處理家蠶5齡幼蟲后2和6 h都顯著上調(diào)。通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)lncRNA63的一個共表達(dá)基因為響應(yīng)20E調(diào)控的家蠶激素受體3(hormone receptor 3, Hr3)基因(Qiaoetal., 2021)，且該基因在家蠶中有13個可變剪接體。為進(jìn)一步鑒定lncRNA63與Hr3的共表達(dá)關(guān)系，闡明lncRNA63在家蠶變態(tài)發(fā)育調(diào)控中功能，本研究利用qRT-PCR檢測lncRNA63及其共表達(dá)基因Hr3在家蠶不同發(fā)育階段、幼蟲不同組織和20E處理后不同時間幼蟲脂肪體中的表達(dá)特征，采用細(xì)胞原位雜交確定lncRNA63在家蠶細(xì)胞中的定位，通過在家蠶個體中注射dsRNA干涉lncRNA63的表達(dá)，檢測其共表達(dá)基因Hr3的表達(dá)變化，以期為后續(xù)深入研究lncRNA63在家蠶變態(tài)發(fā)育中的功能和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

實驗所用的家蠶品系為大造P50，孵化的家蠶幼蟲于溫度25℃，相對濕度60%～70%，光周期12L∶12D的條件下用新鮮桑葉飼養(yǎng)。實驗所用細(xì)胞系為家蠶卵巢細(xì)胞系BmN，用含有10%胎牛血清的TC-100培養(yǎng)基中于28℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

RNA提取試劑Trizol Reagent(Invitrogen，美國)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermofisher，美國)，qRT-PCR試劑FastStart通用型SYBR?Green預(yù)混液(Roche, 瑞士)。用于細(xì)胞培養(yǎng)的試劑有TC-100昆蟲培養(yǎng)基(BBI,上海)，胎牛血清(Gibco, 美國)，原位雜交試劑盒FluorescentInSituHybridization Kit(Ribo, 廣州)，核質(zhì)分離試劑盒Cytoplasmic & Nuclear RNA Purification Kit(Norgen，加拿大)。dsRNA體外轉(zhuǎn)錄合成試劑盒T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒(Promega，美國)。

1.2 家蠶lncRNA63的擴(kuò)增和序列驗證

基于課題組前期構(gòu)建的家蠶脂肪體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，鑒定到lncRNA63在20E處理家蠶5齡幼蟲后2和6 h都顯著上調(diào)，生物信息學(xué)預(yù)測其共表達(dá)基因為Hr3(Qiaoetal., 2021)。序列比對分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA63所在的基因組可轉(zhuǎn)錄出2條RNA分子：ncRNA(GenBank登錄號: XR_001139768)，與lncRNA63的序列相同；mRNA(GenBank登錄號: AK406308),序列中間比lncRNA63多1 776 nt。因此我們首先設(shè)計了lncRNA63的全長擴(kuò)增引物(表1)，同時該引物也能與上述兩種不同RNA分子特異結(jié)合。家蠶Hr3具有13個可變剪接體，根據(jù)Hr3不同剪接體的序列特征，設(shè)計并合成了3對用于qRT-PCR檢測的引物(表1)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

利用Trizol試劑對家蠶脂肪體樣品進(jìn)行總RNA提取，利用超微量核酸蛋白測定儀對總RNA的濃度進(jìn)行測定。每個樣品取2 μg總RNA，利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，以此為模板對lncRNA63進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(20 μL): cDNA模板1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, Premix ExTaq (TaKaRa) 10 μL, DNase/RNase-Free Water 8 μL。PCR反應(yīng)程序: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min或3 min, 30個循環(huán); 72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時對目的條帶進(jìn)行切膠回收，純化后的產(chǎn)物連接T載，篩選陽性克隆進(jìn)行測序分析。

1.3 家蠶lncRNA63及其共表達(dá)基因Hr3的時空表達(dá)分析

從家蠶幼蟲4齡第2天至成蟲第3天每天固定時間整蟲取樣， 4齡第 2-4 天和 5 齡第 1-8 天的幼蟲解剖除去中腸內(nèi)容物，化蛹后1-9 d，成蟲羽化后1-3 d，每個樣品3組，每組3頭個體。選取家蠶5齡第3天幼蟲進(jìn)行解剖， 獲得頭、體壁、血淋巴、中腸、馬氏管、脂肪體、絲腺、精巢和卵巢9種組織，液氮速凍，每個樣品3組，每組來自5頭個體。同1.2節(jié)的方法提取家蠶不同樣品的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，以家蠶actinA3(GenBank登錄號: U49854)為內(nèi)參基因，用FastStart通用型SYBR?Green預(yù)混液進(jìn)行qRT-PCR檢測。PCR反應(yīng)體系(10 μL): cDNA模板1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, FastStart通用型SYBR預(yù)混液5 μL, DNase/RNase-Free Water 3 μL。PCR反應(yīng)程序: 95℃ 15 s; 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 共40次循環(huán)；溶解曲線范圍為65℃～95℃。

1.4 LncRNA63及其共表達(dá)基因Hr3在20E處理后家蠶脂肪體中的表達(dá)檢測

選取家蠶5齡第2天幼蟲，利用顯微注射儀注射20E(2 μg/μL)于血淋巴，每頭家蠶注射5 μg，對照組注射等體積的無水乙醇，注射后2, 6, 12和24 h后進(jìn)行解剖，分別取處理和對照的脂肪體組織速凍于液氮，每個樣品3組，每組來自5頭個體。RNA提取和cDNA第1鏈合成同1.2節(jié)，qRT-PCR檢測同1.3節(jié)。

1.5 LncRNA63在家蠶細(xì)胞中的表達(dá)檢測

家蠶BmN細(xì)胞用含有10%胎牛血清的TC-100培養(yǎng)基中于28℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集單層鋪滿的6孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，使用Cytoplasmic & Nuclear RNA Purification Kit分離并提取細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈(同1.2節(jié))，qRT-PCR檢測lncRNA63在家蠶BmN細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的相對表達(dá)量(同1.3節(jié))。

1.6 LncRNA63的亞細(xì)胞定位

根據(jù)lncRNA63和家蠶U6(GenBank登錄號: AY649381.1)的序列由銳博生物設(shè)計合成原位雜交特異雜交探針。將1.5節(jié)培養(yǎng)的狀態(tài)良好的BmN細(xì)胞鋪于24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿的細(xì)胞爬片上過夜培養(yǎng)，然后將未經(jīng)20E處理BmN細(xì)胞(對照)和每孔中添加20E(2 μg/μL)至終濃度為10 μmol/L處理2, 6, 12和24 h的BmN細(xì)胞用銳博的原位雜交探針試劑盒進(jìn)行l(wèi)ncRNA63和內(nèi)參U6的雜交。首先棄去細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞5 min，共3次，用4%的多聚甲醛室溫固定20 min；PBS清洗細(xì)胞，每孔加入300 μL預(yù)冷的通透液，4℃通透10 min；PBS清洗細(xì)胞，每孔加入200 μL預(yù)雜交液，在37℃封閉30 min；棄去預(yù)雜交液，避光條件下將2.5 μL濃度為20 μmol/L lncRNA63探針或2.5 μL濃度為20 μmol/L內(nèi)參U6探針加入到150 μL雜交液中，37℃雜交過夜；然后用雜交洗液進(jìn)行梯度洗脫，除去多余的探針。最后加入DAPI染液，室溫孵育15 min，PBS清洗細(xì)胞5 min，共3次。將細(xì)胞爬片取出置于已滴加抗熒光淬滅封片劑的玻片上，用尼康Eclipse C1激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.7 LncRNA63的個體干涉

根據(jù)lncRNA63和對照GFP的基因序列設(shè)計并合成帶有T7啟動子的特異引物(表1)，以已構(gòu)建的含有l(wèi)ncRNA63和GFP全長基因的T載質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得帶有T7啟動子的DNA模板。PCR反應(yīng)體系(20 μL): 無菌水8 μL, 2×Ex Taq Mix(TaKaRa, 大連)10 μL, 質(zhì)粒DNA 1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL。PCR反應(yīng)程序: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min, 30個循環(huán); 72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后利用T7 RiboMAXTMExpress RNAi System體外轉(zhuǎn)錄合成lncRNA63和GFP的dsRNA。

選取家蠶5齡第2天幼蟲，用顯微注射儀將lncRNA63和對照GFP的dsRNA分別注射于幼蟲血淋巴中，每頭家蠶注射量為10 μg。注射后24 h分別取實驗組和對照組的家蠶頭、絲腺、體壁和脂肪體組織，每個樣品3組，每組來自5頭個體。利用同1.2節(jié)中的方法進(jìn)行RNA提取和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，qRT-PCR檢測lncRNA63及其共表達(dá)基因Hr3在利用dsRNA干涉前后家蠶幼蟲不同組織中的表達(dá)量變化(同1.3節(jié))。

1.8 數(shù)據(jù)分析

qRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果采用2-ΔΔCt計算方法進(jìn)行基因相對表達(dá)量分析。所有數(shù)據(jù)利用Prism8.0軟件進(jìn)行作圖，并采用雙尾非配對t檢驗分析比較各組實驗數(shù)據(jù)間的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 家蠶lncRNA63及其共表達(dá)基因Hr3的時空表達(dá)

如圖1所示，在4和5齡初期，lncRNA63的表達(dá)水平較低，在5齡中期開始上升，在5齡后期和整個蛹期保持了一個相對較高的表達(dá)水平，其中蛹期第4天有一個表達(dá)高峰，隨后在蛹末期羽化前又出現(xiàn)一個表達(dá)高峰，化蛾后逐步下降。共表達(dá)基因Hr3的表達(dá)具有非常明顯的階段特異性，在4齡末到5齡的蛻皮期間出現(xiàn)一個表達(dá)高峰，在5齡第1天蛻皮完成后又迅速降低，在蛹末期羽化前再次出現(xiàn)一個表達(dá)高峰，羽化后表達(dá)量再次降低。由此可見，lncRNA63和Hr3家蠶不同發(fā)育階段的表達(dá)特征不完全一致，但二者在羽化前的蛹末期都具有較高的表達(dá)。

圖1 qRT-PCR檢測家蠶lncRNA63及其共表達(dá)基因Hr3在家蠶不同發(fā)育階段的表達(dá)量Fig. 1 Expression levels of lncRNA63 and its co-expression gene Hr3 in Bombyx mori at different developmental stages by qRT-PCR4L2d-5L8d: 分別為4齡第2-4天至5齡第1-8天幼蟲Day-2-4 4th to day-1-8 5th instar larva, respectively; PP1-PP9: 分別為1-9日齡蛹 1-9-day-old pupa, respectively; A1-A3: 分別為羽化后1-3 d的成蟲1-3-day-old adult, respectively. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。Data in the figure are mean±SE. 下同The same below.

如圖2(A)所示，lncRNA63在家蠶5齡幼蟲頭、體壁和絲腺中表達(dá)量較高，在血淋巴、中腸、馬氏管、脂肪體、精巢和卵巢中表達(dá)量較低。如圖2(B)所示，Hr3在頭、體壁、血淋巴、絲腺和卵巢中表達(dá)量較高，在中腸、馬氏管、脂肪體以及精巢中表達(dá)量較低。由此可見，lncRNA63和Hr3在家蠶幼蟲不同組織中呈現(xiàn)表達(dá)特異性，但二者在頭、體壁和絲腺中都有較高表達(dá)。

圖2 qRT-PCR檢測家蠶lncRNA63(A)及其共表達(dá)基因Hr3 (B)在家蠶5齡幼蟲不同組織中的表達(dá)量Fig. 2 Expression levels of lncRNA63 (A) and its co-expressed gene Hr3 (B) in different tissues of the 5th instar larvae of Bombyx mori detected by qRT-PCR

圖3 qRT-PCR檢測lncRNA63(A)及其共表達(dá)基因Hr3 (B)在2 μg/μL 20E處理家蠶5齡第2天幼蟲不同時間脂肪體中的表達(dá)量Fig. 3 Expression levels of lncRNA63 (A) and its co-expression gene Hr3 (B) in the fat body of the day-2 5thinstar larvae of Bombyx mori after treatment with 2 μg/μL 20E for different time detected by qRT-PCRCK: 無水乙醇Ethanol. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上符號表示差異顯著性(*P<0.05;**P<0.01; ***P<0.001; nsP>0.05)(雙尾非配對t檢驗)；圖4和7同。 Data in the figure are mean±SE. Symbols above bars indicate the significance of difference (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; nsP>0.05) by two-tailed, unpaired t-test. The same for Figs. 4 and 7.

2.2 家蠶lncRNA63及Hr3在20E處理不同時間脂肪體中的表達(dá)

結(jié)果顯示，lncRNA63在20E處理后2, 6和12 h的家蠶脂肪體中的表達(dá)量逐漸升高(圖3: A)，且與對照組相比均顯著上調(diào)(P<0.05)，而在處理后24 h其表達(dá)量下降到與對照相當(dāng)水平(P>0.05)。如圖3(B)所示，Hr3的表達(dá)趨勢與lncRNA63一致，在20E處理后2, 6和12 h其表達(dá)量逐步上升，且顯著高于對照組(P<0.05)，24 h表達(dá)量也急劇下降，但仍顯著高于對照組(P<0.05)。

2.3 LncRNA63的亞細(xì)胞定位

qRT-PCR檢測結(jié)果如圖4所示，內(nèi)參基因actinA3在BmN細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的相對表達(dá)量顯著高于在細(xì)胞核中的(P<0.01)，由此表明BmN細(xì)胞的核質(zhì)分離的效果較好。LncRNA63在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，但lncRNA63在細(xì)胞核中表達(dá)量顯著高于在細(xì)胞質(zhì)中的(P<0.001)。

圖4 qRT-PCR檢測lncRNA63在家蠶BmN細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)量Fig. 4 Expression levels of lncRNA63 in the cytoplasm and nucleus of BmN cells of Bombyx mori by qRT-PCR

圖5 原位雜交檢測lncRNA63和U6在家蠶BmN細(xì)胞中的定位Fig. 5 Localization of lncRNA63 and U6 in Bombyx moriBmN cells detected by in situ hybridizationDAPI: DAPI染色顯示細(xì)胞核Cell nucleus stained with DAPI; Cy3: 標(biāo)記有Cy3的原位雜交探針在細(xì)胞中的分布情況Distribution of in situ hybridization probe labeled with Cy3 in the cell; Merge: DAPI和Cy3的疊加圖像Overlay image of DAPI and Cy3. 激光共聚焦顯微鏡60倍。Confocal microscope with 60×magnification. 標(biāo)尺Scale=20 μm. 圖6同The same for Fig. 6.

LncRNA63的熒光原位雜交結(jié)果如圖5所示，在對照家蠶BmN細(xì)胞中，lncRNA63與內(nèi)參U6的細(xì)胞內(nèi)定位相同，主要定位于細(xì)胞核，該結(jié)果與核質(zhì)分離的qRT-PCR的檢測結(jié)果(圖4)也一致。lncRNA63在20E處理后不同時間BmN細(xì)胞中的核質(zhì)定位情況如圖6所示，在20E處理2 h后的BmN細(xì)胞中，lncRNA63在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的熒光信號明顯增強(qiáng)；20E處理6 h后，lncRNA63在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的熒光減弱，細(xì)胞核內(nèi)的熒光增強(qiáng)；在20E處理12和24 h后lncRNA63都主要定位于細(xì)胞核中，表明20E處理可引起lncRNA63的核質(zhì)遷移。

2.4 RNAi干涉lncRNA63的效果

結(jié)果顯示，與對照(dsGFP注射組)相比，在RNA干涉后家蠶5齡第3天幼蟲的頭、絲腺和脂肪體中l(wèi)ncRNA63都顯著下調(diào)表達(dá)(P<0.01)，而在體壁中無顯著變化(P>0.05)(圖7: A)，Hr3與lncRNA63的表達(dá)模式一致，在lncRNA63被成功干涉后的頭、絲腺和脂肪體中也都顯著下調(diào)(P<0.01)，在體壁中無顯著變化(P>0.05) (圖7: B)。

圖6 原位雜交檢測lncRNA63在10 μmol/L 20E處理不同時間后家蠶BmN細(xì)胞中的定位Fig. 6 Localization of lncRNA63 in BmN cells of Bombyxmori treated with 10 μmol/L 20E for different timedetected by in situ hybridization

3 討論

本研究通過對lncRNA63和Hr3在2 μg/μL 20E處理后不同時間的幼蟲脂肪體中表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)lncRNA63(圖3: A)和Hr3(圖3: B)在處理后2, 6, 12和24 h的表達(dá)都可以被20E激活且呈正相關(guān)，表達(dá)量變化趨勢高度一致。通過在家蠶5齡幼蟲個體中干涉lncRNA63的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在不同組織中Hr3的表達(dá)都顯著降低(圖7: B)，由此進(jìn)一步表明Hr3是lncRNA63的共表達(dá)基因。作為受20E誘導(dǎo)的激素受體基因，研究發(fā)現(xiàn)Hr3不僅可在家蠶卵巢中的卵黃發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用(Eystathioyetal., 2001)，還可調(diào)控埃及伊蚊Aedesaegypti卵黃原蛋白基因的表達(dá)和終止(Mane-Padrosetal., 2012)。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)Hr3在20E調(diào)控的昆蟲細(xì)胞自噬、蛻皮和變態(tài)發(fā)育過程中也具有重要功能(Tianetal., 2013; Guoetal., 2015; Zhaoetal., 2018)。LncRNA63和Hr3在家蠶的不同組織中和不同發(fā)育階段的表達(dá)分析表明，二者在5齡幼蟲不同組織中的表達(dá)特征既有特異性又有相似性，尤其是lncRNA63(圖2: A)和Hr3(圖2: B)在頭、體壁和絲腺中都有較高表達(dá)；在4齡第2天幼蟲到成蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)分析中，lncRNA63和Hr3的表達(dá)趨勢不完全相同，但二者在羽化前的蛹末期都有一個表達(dá)高峰(圖1)。由于lncRNA63的表達(dá)具有組織特異性，推測lncRNA63和Hr3在不同發(fā)育階段的表達(dá)差異可能與整蟲取樣有關(guān)。

圖7 qRT-PCR檢測RNA干涉24 h后家蠶5齡第3天幼蟲不同組織中l(wèi)ncRNA63(A)和Hr3(B)的表達(dá)量Fig. 7 Expression levels of lncRNA63 (A) and Hr3 (B) in different tissues of the day-3 5th instar larvae of Bombyx mori after RNA interference for 24 h detected by qRT-PCR

由于lncRNAs在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中具有不同的功能和作用機(jī)制，為探索lncRNA63在家蠶變態(tài)發(fā)育中的功能，我們對lncRNA63在家蠶細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析。qRT-PCR的檢測結(jié)果(圖4)與原位雜交(圖5)的結(jié)果一致，lncRNA63在正常家蠶細(xì)胞中主要位于細(xì)胞核。據(jù)報道，lncRNAs大多由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，由于其加工剪接效率較低，多呈現(xiàn)出明顯的細(xì)胞核定位現(xiàn)象。細(xì)胞核lncRNAs可通過與DNA, RNA或蛋白質(zhì)等分子相互作用，調(diào)控染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能；或者順式或反式調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，影響mRNA的剪接、穩(wěn)定和翻譯等。而剪接加工完全的lncRNA可通過與mRNA類似的機(jī)制轉(zhuǎn)運到細(xì)胞之中，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平反式調(diào)控基因表達(dá)或參與細(xì)胞內(nèi)信號通路的調(diào)控(Statelloetal., 2021)。由于lncRNA63在家蠶幼蟲脂肪體中的表達(dá)受20E的調(diào)控，那么20E是否影響lncRNA63的核質(zhì)定位變化？因此我們檢測了lncRNA63在20E處理后不同時間BmN細(xì)胞中的核質(zhì)定位情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20E處理早期可引起lncRNA63在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的定位發(fā)生明顯變化，隨著處理時間的延長又恢復(fù)到其在對照細(xì)胞(圖5)的定位(圖6)。lncRNA的核質(zhì)遷移在哺乳動物中已有報道，小鼠的lncRNA Neat1可通過從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移參與巨噬細(xì)胞的炎癥激活(Zhangetal., 2019)，但在昆蟲中目前還未見報道。在家蠶化蛹期間20E可通過Hr3上調(diào)自噬相關(guān)基因的表達(dá)并進(jìn)而誘導(dǎo)脂肪體細(xì)胞自噬的發(fā)生(Tianetal., 2013)。在果蠅中，Hr3的表達(dá)與發(fā)育過程中20E的滴度相關(guān)，在3齡幼蟲中表達(dá)量增加，而Hr3在果蠅中的延遲表達(dá)是幼蟲向蛹轉(zhuǎn)變所必需的(Ruaudetal., 2010)。此外，在蝗蟲、煙草天蛾Manducasexta和棉鈴蟲中，Hr3的表達(dá)也受20E信號介導(dǎo)(Langelanetal., 2000; Zhaoetal., 2004, 2018)。LncRNA63的序列特征表明其經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后的剪接加工，且作為lncRNA63前體的AK406308具有polyA尾，推測lncRNA63可能通過類似mRNA的轉(zhuǎn)運機(jī)制在20E處理后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中調(diào)控Hr3基因的表達(dá)。

綜上所述，本研究通過對家蠶中一個新的lncRNA及其共表達(dá)基因Hr3的表達(dá)分析、細(xì)胞定位和個體干涉研究，驗證Hr3是lncRNA63的共表達(dá)基因；20E不僅可調(diào)控lncRNA63的表達(dá)，同時可誘導(dǎo)lncRNA63的核質(zhì)遷移，推測lncRNA63可能通過共表達(dá)基因Hr3參與家蠶20E調(diào)控的脂肪體發(fā)育過程。但lncRNA63響應(yīng)20E調(diào)控的分子機(jī)制及其在家蠶變態(tài)發(fā)育中的功能，還有待進(jìn)一步深入研究。