扶正抗癌方通過miR155-C/EBP-β途徑逆轉(zhuǎn)M2型巨噬細胞極化?

李龍妹， 王蘇美， 唐 青， 廖桂雅， 吳萬垠

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院， 廣州 510370)

腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境之間的交叉對話在腫瘤發(fā)展中扮演著重要角色，與中醫(yī)的“整體觀”不謀而合。扶正抗癌方(fuzheng kang-ai decoction, FZKA)正是在中醫(yī)整體觀念和辨證論治的指導(dǎo)下總結(jié)的經(jīng)驗方，目前已廣泛應(yīng)用于臨床。前期研究發(fā)現(xiàn)，扶正抗癌方聯(lián)合吉非替尼可延長非小細胞肺癌患者中位疾病無進展生存時間以及中位生存時間[1，2]；基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，對于非小細胞肺癌細胞，扶正抗癌方可抑制細胞增殖[3-5]，逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，進而抑制細胞轉(zhuǎn)移[6-8]，誘導(dǎo)細胞凋亡[9]，逆轉(zhuǎn)細胞對吉非替尼的耐藥[10]。腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophages, TAMs)是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，誘導(dǎo)TAMs由M2型向M1型極化轉(zhuǎn)變是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的一個重要靶點。為此，本文以小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞為對象，檢測扶正抗癌方對巨噬細胞極化的影響，并探討其作用分子機制，進一步探明扶正抗癌方治療腫瘤的機理。

1 材料

1.1 細胞株

小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心。細胞培養(yǎng)及傳代：RAW264.7細胞培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2，用DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清進行培養(yǎng)及傳代。M2型巨噬細胞的誘導(dǎo)：加入重組白細胞介素-4(interleukin-4, IL-4, 20 ng·mL-1)，培養(yǎng)48 h。

1.2 藥物、試劑與儀器

扶正抗癌方是廣東省名中醫(yī)吳萬垠教授的協(xié)定方，現(xiàn)已制備成顆粒劑。扶正抗癌方組成：太子參15 g，白術(shù)15 g，黃芪30 g，炒薏苡仁30 g，甘草10 g，山慈菇30 g，白花蛇舌草30 g，龍葵30 g，石見穿30 g，八月札30 g，蛇泡簕30 g，莪術(shù)15 g。顆粒劑由廣東一方制藥制備完成，按照《中華人民共和國藥典》2010版顆粒劑項下常規(guī)項目進行質(zhì)量控制。制備步驟：藥材加水浸泡30 min，加熱至沸煎2 h分離煎液，藥渣繼續(xù)加水煎煮合并煎液，低溫減壓濃縮，噴霧干燥制成干粉后壓制成顆粒分裝，每劑分2袋裝，每袋15 g，1 g=10.33 g生藥。本文實驗過程中，將顆粒加入1640培養(yǎng)基充分震蕩超聲，37 ℃水浴加熱，離心取上清后0.22 μm濾器過濾制備成20 mg·mL-1母液，4 ℃保存。本文測定加入扶正抗癌方后培養(yǎng)基的pH值為7.2～7.4，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)未發(fā)生變化，排除扶正抗癌方藥液加入對細胞生長環(huán)境的pH值及細胞滲透壓的影響。

蛋白質(zhì)印跡法iNOS抗體、TGF-β抗體、C/EBP-β抗體(美國CST公司，貨號13120 s、3711 s、3087)；流式細胞術(shù)的熒光CD 206抗體和熒光CD163抗體(美國BioLegend公司，貨號141705、155307)；蛋白質(zhì)印跡法CD206(美國R&D公司，貨號AF2535)；二抗(美國Bio-Rad公司，貨號1706515)；胎牛血清、胰酶(美國Gibco公司，貨號10270-106、25200-072)；microRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量PCR檢測試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，貨號MR101-02、Q711-02)；miR155引物及內(nèi)參U6引物、miR155 inhibitor 及nc-inhibitor(廣州銳博生物科技公司)。miR155 inhibitor主要作用序列：5′-ACCCCUAUCACGAUUAGCAUUAA-3′，nc-inhibitor主要作用序列：5′-CAGUACUUUUG UGUAGUACAA-3′。

5430R型冷凍離心機，德國Eppendorf公司；ABI7500熒光定量PCR儀，美國Applied Biosystems公司；NovoCyte流式細胞儀，美國Agilent公司；ChemiDoc XRS+型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；1658033型垂直電泳系統(tǒng)及1703940型半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 分組

探究扶正抗癌方對miR155、C/EBP-β mRNA和蛋白、巨噬細胞表型影響的實驗中，設(shè)Mφ組(RAW264.7細胞組)、Mφ+IL-4組(經(jīng)IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細胞組)和Mφ+IL-4+FZKA組(給予FZKA作用的M2型巨噬細胞組)：取對數(shù)生長的RAW264.7細胞加入重組IL-4(20 ng·mL-1)，培養(yǎng)48 h誘導(dǎo)為M2型巨噬細胞，接種于六孔板，24 h后分別加入含不同濃度扶正抗癌方培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集樣品行流式細胞術(shù)、蛋白質(zhì)印跡法及實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)法檢測，其中流式細胞術(shù)另設(shè)同型對照組(Isotype組，RAW264.7細胞組)，目的是消除由于抗體非特異性結(jié)合到細胞表面而產(chǎn)生的背景染色。探究miR155模擬物和抑制物對miR155表達的影響以及miR155抑制物對C/EBP-β mRNA表達影響的實驗中，設(shè)nc-mimic組(空轉(zhuǎn)模擬物組)、nc-inhibitor組(空轉(zhuǎn)抑制物組)、miR155-mimic組(轉(zhuǎn)染miR155模擬物組)和miR155-inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR155抑制劑組)：將M2型巨噬細胞接種于六孔板，24 h后分別將miR155模擬物和抑制物以及相應(yīng)的陰性對照瞬時轉(zhuǎn)染至M2型巨噬細胞中，48 h后收集樣品行qPCR檢測。探究miR155抑制劑抑制扶正抗癌方對M2型巨噬細胞極化的逆轉(zhuǎn)實驗中，設(shè)Isotype組、Mφ組、Mφ+IL-4組、Mφ+IL-4+FZKA組、Mφ+IL-4+miR155 inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR155抑制劑的M2型巨噬細胞組)和Mφ+IL-4+miR155 inhibitor+ FZKA組(給予FZKA作用的轉(zhuǎn)染miR155抑制劑的M2型巨噬細胞組)：取對數(shù)生長的RAW264.7細胞加入重組IL-4，培養(yǎng)48 h誘導(dǎo)為M2型巨噬細胞，接種于六孔板，24 h后在相應(yīng)組中瞬時轉(zhuǎn)染miR155inhibitor，48 h后在相應(yīng)組中加入含2.0 mg·mL-1扶正抗癌方培養(yǎng)基，24 h后收集樣品行流式細胞術(shù)。

2.2 流式細胞術(shù)

收集樣品至流式管離心去上清，PBS緩沖液洗3次，加入相應(yīng)的抗體避光孵育30 min后上機操作，檢測巨噬細胞的標志物CD206和CD163的表達(抗體稀釋終濃度為1.25 μg/mL)，采用Novo Express軟件分析數(shù)據(jù)并導(dǎo)出實驗結(jié)果。

2.3 實時熒光定量PCR

收集樣品用RNA提取試劑盒提取總的RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再分別用相應(yīng)的PCR引物(見表1)和內(nèi)參(U6和GAPDH)進行PCR擴增，2-△△Ct法計算目的基因相對表達量。

表1 引物設(shè)計

2.4 蛋白質(zhì)印跡法

收集樣品提取總蛋白，BCA測定蛋白濃度、電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育抗體，iNOS、TGF-β、C/EBP-β抗體均按照1∶1000稀釋；ECL化學(xué)發(fā)光法成像，Image Lab顯影并進行數(shù)據(jù)分析。

2.5 瞬時轉(zhuǎn)染法

RAW264.7細胞轉(zhuǎn)染效率較低，選用廣州銳博生產(chǎn)的riboFECT CP轉(zhuǎn)染。取對數(shù)生長的細胞，以新鮮的完全培養(yǎng)基(無抗生素)重懸，接種于六孔板。第2天轉(zhuǎn)染，配制1×CP buffer:以PBS溶液將10×CP buffer稀釋為1×，每個EP管加入120 μL 1×CP buffer；在EP管中加入inhibitor溶液20 μL/孔，輕輕混勻，室溫孵育10 min；再加入CP reagent, 12 μL/孔輕輕混勻，室溫孵育10 min；取137 μL inhibitor和轉(zhuǎn)染試劑的混合溶液加入含1863 μL培養(yǎng)基的六孔板中輕輕搖勻，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，再進行后續(xù)處理。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 RAW264.7細胞向M2型巨噬細胞的極化

蛋白質(zhì)印跡法檢測iNOS、CD206、TGF-β的蛋白表達(如圖1表2)；與Mφ組比較，Mφ+IL-4組中iNOS表達降低，CD206和TGF-β表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。流式細胞術(shù)檢測CD206和CD163的表達(如圖2表3)；與Mφ組比較，Mφ+ IL-4組中CD206和CD163表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果顯示，經(jīng)IL-4誘導(dǎo)的RAW264.7細胞極化為M2型巨噬細胞。

注：A. Mφ組(RAW264.7細胞組)；B. Mφ+IL-4組(經(jīng)IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細胞組)圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測一氧化氮合成酶(iNOS)、巨噬細胞甘露糖受體(CD)206和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)蛋白的表達

表2 蛋白質(zhì)印跡法檢測一氧化氮合成酶(iNOS)、巨噬細胞甘露糖受體(CD)206和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)蛋白的表達

3.2 扶正抗癌方對巨噬細胞表型的影響

流式細胞術(shù)檢測CD206和CD163的表達(如圖2)。表3示，與Mφ+IL-4組比較，Mφ+IL-4+FZKA組(2.0 mg·mL-1)中CD206和CD163的表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。qPCR和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測iNOS、CD206、TGF-β的mRNA和蛋白表達(如圖3表4)；與Mφ+IL-4組比較，Mφ+IL-4+FZKA組中iNOS mRNA和蛋白表達增加，CD206和TGF-β mRNA和蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果顯示，加入扶正抗癌方藥液后可逆轉(zhuǎn)M2型巨噬細胞的極化且呈濃度依賴性。

注：A. Isotype組(RAW264.7細胞組)；B. Mφ組(RAW264.7細胞組)；C. Mφ+IL-4組(經(jīng)IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細胞組)；D. Mφ+IL-4+FZKA組(給予FZKA作用的M2型巨噬細胞組)；FZKA為扶正抗癌方圖2 流式細胞術(shù)檢測M2型標志物巨噬細胞甘露糖受體(CD)206和CD163表達比較

表3 流式細胞術(shù)檢測M2型標志物巨噬細胞甘露糖受體(CD)206和CD163表達比較

3.3 扶正抗癌方對C/EBP-β mRNA和蛋白表達的影響

qPCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測C/EBP-β mRNA和蛋白的表達(如圖3表4)；與Mφ+IL-4組比較，Mφ+IL-4+FZKA組(2.0 mg·mL-1)中C/EBP-β mRNA和蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果顯示，扶正抗癌方能夠在基因及蛋白質(zhì)水平呈濃度依賴性，并抑制C/EBP-β的表達。

注：A. Mφ+IL-4組(經(jīng)IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細胞組)；B. Mφ+IL-4+FZKA 1.5 mg·mL-1組(給予1.5 mg·mL-1FZKA作用的M2型巨噬細胞組)；C. Mφ+IL-4+FZKA 2.0 mg·mL-1組(給予2.0 mg·mL-1FZKA作用的M2型巨噬細胞組)；白細胞介素-4(IL-4)；FZKA為扶正抗癌方 圖3 扶正抗癌方對一氧化氮合成酶(iNOS)、巨噬細胞甘露糖受體(CD)206和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強子結(jié)合蛋白β(C/EBP-β)蛋白表達的影響

表4 扶正抗癌方對一氧化氮合成酶(iNOS)、巨噬細胞甘露糖受體(CD)206、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)，轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強子結(jié)合蛋白β(C/EBP-β)mRNA和蛋白表達的影響

3.4 扶正抗癌方對miR155表達的影響

qPCR檢測miR155的表達(如表5)，與Mφ+IL-4組比較，Mφ+IL-4+FZKA組(1.5, 2.0 mg·mL-1)中miR155表達增加且呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果顯示，扶正抗癌方以濃度依賴性促進miR155的表達。

表5 扶正抗癌方對miR155表達的影響

3.5 miR155模擬物和抑制物對M2型巨噬細胞miR155表達的影響

qPCR檢測miR155的表達(如表6)，與nc-mimic組比較，轉(zhuǎn)染miR155模擬物組(miR155-mimic組)中miR155的表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與nc-inhibitor組比較，轉(zhuǎn)染miR155抑制物組(miR155-inhibitor組)中miR155的表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果顯示，miR155 mimics和inhibitors在M2型巨噬細胞中轉(zhuǎn)染成功。

表6 轉(zhuǎn)染miR155模擬物和抑制物后M2型巨噬細胞中miR155的表達

3.6 miR155對C/EBP-β mRNA表達的影響

qPCR檢測miR155的表達(如表7)，與nc-inhibitor組比較，miR155-inhibitor組C/EBP-β mRNA表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果顯示，miR155能夠靶向抑制C/EBP-β mRNA的表達。

表7 miR155對轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強子結(jié)合蛋白β(C/EBP-β)mRNA表達的影響

3.7 miR155 inhibitor抑制扶正抗癌方對M2型巨噬細胞極化的逆轉(zhuǎn)

流式細胞術(shù)檢測CD206和CD163的表達(如圖4表8)，與Mφ組比較，Mφ+IL-4組中CD206和CD163表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果顯示巨噬細胞向M2型極化成功；與 Mφ+IL-4組比較，Mφ+IL-4+FZKA組中CD206和CD163表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果顯示扶正抗癌方逆轉(zhuǎn)M2型巨噬細胞的極化；與Mφ+IL-4+FZKA組比較，Mφ+IL-4+miR155 inhibitor + FZKA組中CD206和CD163表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。結(jié)果顯示，miR155 inhibitor抑制扶正抗癌方對M2型巨噬細胞極化的逆轉(zhuǎn)。

4 討論

TAMs是位于腫瘤間質(zhì)中的巨噬細胞，由外周血單核細胞或組織中巨噬細胞循環(huán)至腫瘤部位分化而成，占腫瘤組織的50%以上[11]。在不同微環(huán)境下，TAMs可分化為M1型或M2型。在惡性腫瘤中，受Th2型細胞因子調(diào)控，如IL-4、IL-13，TAMs傾向于分化為M2型。臨床研究發(fā)現(xiàn)，高TAMs密度腫瘤患者的無復(fù)發(fā)存活率及總存活率均顯著低于低TAMs密度患者，表明TAMs是一個不良預(yù)后因素，可能是一個潛在的臨床預(yù)后指標[12]。

M1型巨噬細胞的特征之一是表面標志物CD80和CD86高表達，且能夠分泌大量誘導(dǎo)型iNOS、IL-12、IL-23和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)等促炎因子，抑制腫瘤增殖并破壞腫瘤血管內(nèi)皮，發(fā)揮抗腫瘤免疫功能[13]。M2型巨噬細胞特征之一是表面標志物CD206和CD163的高表達，且能夠分泌IL-4、IL-10、TGF-β等抑炎因子，降解細胞外基質(zhì)，促進血管生成，發(fā)揮逃脫免疫監(jiān)視功能[14，15]。當以IL-4誘導(dǎo)RAW264.7細胞后，流式細胞術(shù)檢測CD206和CD163表達增加，同時蛋白質(zhì)印跡法檢測iNOS表達降低，TGF-β表達增加，表明IL-4可誘導(dǎo)巨噬細胞向M2型極化。加入扶正抗癌方后，流式細胞術(shù)檢測CD206和CD163表達下降，qPCR和蛋白質(zhì)印跡法分別在基因和蛋白質(zhì)水平檢測iNOS表達增加，TGF-β表達降低，表明扶正抗癌方可逆轉(zhuǎn)M2型巨噬細胞的極化。前期研究發(fā)現(xiàn)，扶正抗癌方的主要活性成分為綠原酸、隱綠原酸等。文獻報道也提示，綠原酸通過Janus激酶-信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子(the janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)信號通路抑制肝癌相關(guān)巨噬細胞M2極化，通過抑制巨噬細胞向M2型極化，進而抑制膠質(zhì)母細胞瘤的生長等[16，17]，也與本文研究結(jié)果吻合?？紤]扶正抗癌方在逆轉(zhuǎn)M2型巨噬細胞極化時有可能綠原酸起重要作用。

注：A. Isotype組(RAW264.7細胞組)；B. Mφ組(RAW264.7細胞組)；C. Mφ+IL-4組(經(jīng)IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細胞組)；D. Mφ+IL-4+FZKA組(給予FZKA作用的M2型巨噬細胞組)；E.Mφ+IL-4+miR155 inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR155抑制劑的M2型巨噬細胞組)；F. Mφ+IL-4+miR155 inhibitor + FZKA組(給予FZKA作用的轉(zhuǎn)染miR155抑制劑的M2型巨噬細胞組)；FZKA為扶正抗癌方圖4 流式細胞術(shù)檢測M2型標志物巨噬細胞甘露糖受體(CD)206和CD163的表達

表8 流式細胞術(shù)檢測M2型標志物巨噬細胞甘露糖受體(CD)206和CD163的表達

巨噬細胞的極化受磷脂酰肌醇3激酶-蘇氨酸激酶(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)、JAK/STAT等多條通路調(diào)控[18]。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子C/EBP-β具有調(diào)控細胞分化、激活巨噬細胞等作用，在M2型巨噬細胞中高表達，是一類調(diào)控巨噬細胞向M2型極化的重要轉(zhuǎn)錄因子[19]。研究發(fā)現(xiàn)，扶正抗癌方能夠在基因和蛋白層面上抑制C/EBP-β的表達。miRNAs是一類長度約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，主要通過與靶基因的3′UTR區(qū)域結(jié)合，降解靶基因mRNA或抑制靶基因mRNA翻譯，從而抑制靶基因表達。而研究發(fā)現(xiàn)，扶正抗癌方能夠促進miR155 的表達。為進一步驗證miR155與C/EBP-β的關(guān)系，當抑制miR155的表達時，C/EBP-β mRNA表達增加，表明miR155 能夠靶向抑制C/EBP-β mRNA的表達。前人研究也發(fā)現(xiàn)，miR155-5p可靶向調(diào)控 C/EBP-β介導(dǎo)巨噬細胞表型轉(zhuǎn)換[20]。最后發(fā)現(xiàn)，miR155 inhibitor能夠抑制扶正抗癌方對M2型巨噬細胞極化的逆轉(zhuǎn)，進一步證明扶正抗癌方通過miR-155逆轉(zhuǎn)M2型巨噬細胞的極化。

綜上，扶正抗癌方可通過上調(diào)miR155的表達，進而靶向抑制C/EBP-β基因的表達，并進一步通過下調(diào)M2型巨噬細胞標志物CD206、CD163和TGF-β，上調(diào)M1型巨噬細胞標志物iNOS的表達，逆轉(zhuǎn)M2型巨噬細胞的極化。由此看出，扶正抗癌方在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境方面有重要意義，在臨床防治惡性腫瘤方面有重要發(fā)展前景。