磷酸肌酸對糖尿病大鼠冠狀動脈的保護(hù)研究

蔚俊星 黨旭云

1 陜西省西安市第四醫(yī)院麻醉科 710004； 2 西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科

隨著人們生活水平的提高，糖尿病人群逐年增多，臨床上接受麻醉和手術(shù)的糖尿病患者也日益增加。糖尿病以損害全身血管為特點，可以累積心、腦、腎、眼及神經(jīng)的病變。冠狀動脈疾病作為危害人類健康的常見病，冠脈再灌療法雖能在一定程度上減少壞死面積，改善心功能，但可引起再灌注損傷或殘留術(shù)后缺血區(qū)心肌灌注不足。因此，對于糖尿病患者冠狀動脈保護(hù)的研究對于改善患者預(yù)后具有深遠(yuǎn)意義。

1 材料與方法

1.1 糖尿病模型的建立 40只雄性SD大鼠，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK(陜)2017-001。體重250～300g。高脂飼養(yǎng)4周后，按40mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素，72h后采尾血測血糖，非空腹血糖≥16.7mmol/L持續(xù)1周者確定為糖尿病。飼養(yǎng)8周建立本研究所用糖尿病病程8周大鼠模型。建模過程中3只大鼠死于糖尿病，2只未達(dá)到血糖標(biāo)準(zhǔn)，故成模大鼠共35只。之后，研究中2只大鼠因未完成再灌注就已死亡，1只大鼠因冠脈血管環(huán)制備失敗，均剔除并補(bǔ)齊。

1.2 動物分組 所有成模糖尿病大鼠隨機(jī)分為4組(n=8)：假手術(shù)組(Ⅰ)，開胸后只穿線不結(jié)扎LAD。MIRI+生理鹽水組(Ⅱ)，結(jié)扎LAD前30min按20ml/kg腹腔注射生理鹽水。MIRI+PCr單次注射組(Ⅲ)，結(jié)扎LAD前30min按2g/kg腹腔注射PCr。MIRI+PCr多次注射組(Ⅳ)，按2g/kg腹腔注射PCr，實驗前5d開始，1次/d，共5次。

1.3 心肌缺血再灌注模型的建立 烏拉坦腹腔注射，麻醉后仰臥位固定于操作臺，氣管插管連接呼吸機(jī)，潮氣量6ml/100g，呼吸頻率60～80次/min。胸骨左側(cè)第3、4肋間開胸器暴露心臟，在左心耳和肺動脈圓錐間找到與左前降支(LAD)伴行的靜脈，放置塑料管，一并進(jìn)行緊密結(jié)扎。成功扎閉LAD的標(biāo)準(zhǔn)：左室前壁發(fā)紺，向外膨出，且心電圖ST段抬高，T波高聳。于結(jié)扎成功30min后，拔出塑料管，再灌注2h。

1.4 冠脈血管環(huán)的制備 實驗結(jié)束，迅速分離出LAD，浸入冷的Krebs液中，顯微鏡下剝除外周脂肪及血管周圍的結(jié)締組織，制備成2～3mm的血管環(huán)。置于盛有37℃ Kerbs液的浴槽中，通有95%O2+5%CO2混合氣體，調(diào)節(jié)血管環(huán)的基礎(chǔ)張力為2mN，平衡60min，每15min更換1次Krebs液，正式實驗前需調(diào)零。以K+-Krebs液(含60mmol/L)檢驗動脈環(huán)收縮性，如果前后2次最大收縮幅度差<10%者，認(rèn)為血管反應(yīng)可重復(fù)，可開始正式實驗，借助張力傳感器，生理記錄儀觀察血管張力的變化。Kerbs液組成(NaCl 119mmol/L、NaHCO315mmol/L、KCl 4.6mmol/L、MgCl21.2mmol/L、NaH2PO41.2mmol/L、CaCl21.5mmol/L和葡萄糖5.6mmol/L)。K+-Krebs液組成(NaCl 60mmol/L、NaHCO315mmol/L、KCl 63.5mmol/L、MgCl21.2mmol/L、NaH2PO41.2mmol/L、CaCl21.5mmol/L和葡萄糖5.5mmol/L)。

1.5 指標(biāo)測定

1.5.1 冠脈血管反應(yīng)性的測定。舒張反應(yīng)：平衡后，向浴槽內(nèi)加入60mmol/L的KCl，待血管反應(yīng)達(dá)到最大收縮峰值后，用濃度累加法加入Ach觀察血管的舒張反應(yīng)，依次遞增使浴槽內(nèi)終濃度為10-10、3×10-10、10-9、3×10-9、10-8、3×10-8、10-7、3×10-7、10-6、3×10-6、10-5、3×10-5，建立其濃度—效應(yīng)曲線。再用Krebs液洗脫至基線，平衡40min后開始下一輪實驗。舒張反應(yīng)的變化用舒張率表示=不同濃度Ach引起的松弛數(shù)/預(yù)先使用KCl引起的血管收縮數(shù)值×100%。

收縮反應(yīng)：待血管穩(wěn)定后，向浴槽內(nèi)加入60mmol/L的KCl，3min后用Kerbs液洗脫，再用濃度累加法加入5-HT收縮血管，依次遞增使浴槽內(nèi)終濃度為10-10、3×10-10、10-9、3×10-9、10-8、3×10-8、10-7、3×10-7、10-6、3×10-6、10-5、3×10-5，建立其累加濃度—效應(yīng)曲線。收縮反應(yīng)的變化用收縮率表示=不同濃度5-HT引起的張力/預(yù)先使用KCl引起的血管收縮數(shù)值×100%。

1.5.2 電鏡結(jié)果。實驗結(jié)束后，立即將LAD置于濃度為2.5%的戊二醛溶液中，4℃固定2h。用1%的四氧化鋨固定后用乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂Epon812包埋，LKB-Ⅴ型超薄切片機(jī)進(jìn)行超薄切片，鉛鈾雙重染色，H-600透射式電子顯微鏡下觀察拍照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件處理所得數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析及單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冠脈血管反應(yīng)性的測定

2.1.1 冠脈對Ach的舒張反應(yīng)：累加濃度法觀察各組冠脈血管對Ach的濃度舒張曲線，同一濃度下與Ⅰ組相比，Ⅱ組的舒張率明顯下降(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見圖1。

圖1 各組大鼠冠脈血管對Ach的舒張作用量效曲線

2.1.2 冠脈對5-HT的收縮反應(yīng)：同一濃度下與Ⅰ組相比，Ⅱ、Ⅲ組收縮率明顯升高(P<0.01)，Ⅳ組的變化無統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與Ⅱ、Ⅲ組相比，Ⅳ組收縮率明顯下降(P<0.01)，見圖2。

圖2 各組大鼠冠脈血管對5-HT的收縮作用量效曲線

2.2 電鏡下冠脈結(jié)構(gòu)的變化 Ⅰ組：內(nèi)皮細(xì)胞凸向管腔，內(nèi)彈力膜厚薄不均，細(xì)胞核不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)輕度凝集，見圖3。Ⅱ組：內(nèi)皮細(xì)胞腫脹脫落，細(xì)胞膜不完整，內(nèi)彈力膜部分?jǐn)嗔眩?xì)胞核呈圓形，核內(nèi)染色質(zhì)凝集，見圖4。Ⅲ組：內(nèi)皮細(xì)胞貼于內(nèi)彈力膜，內(nèi)彈力膜基本均勻，細(xì)胞核形狀不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)輕度凝集，見圖5。Ⅳ組：內(nèi)皮細(xì)胞貼附于內(nèi)彈力膜上，內(nèi)彈力膜厚薄均勻，細(xì)胞核扁平，核內(nèi)染色質(zhì)分布基本均勻，見圖6。

圖3 電鏡下Ⅰ組冠脈的結(jié)構(gòu)(×5 000) 圖4 電鏡下Ⅱ組冠脈的結(jié)構(gòu)(×5 000)

圖5 電鏡下Ⅲ組冠脈的結(jié)構(gòu)(×5 000) 圖6 電鏡下Ⅳ組冠脈的結(jié)構(gòu)(×5 000)

3 討論

糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能改變密切相關(guān)。內(nèi)皮細(xì)胞作為血管的保護(hù)屏障，在高糖高脂環(huán)境下導(dǎo)致的氧化應(yīng)激可損害內(nèi)皮細(xì)胞的功能。內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌的多種活性物質(zhì)參與了體內(nèi)的病理生理過程[1]。正常情況下，血管內(nèi)皮合成和釋放一定量的NO和ET-1，調(diào)節(jié)血管張力和通透性及抗凝作用來維持營養(yǎng)物質(zhì)和氧供應(yīng)到相應(yīng)組織。

生理情況下，Ach通過激動內(nèi)皮細(xì)胞M3膽堿受體亞型，導(dǎo)致內(nèi)皮源性NO釋放而產(chǎn)生血管舒張。但在內(nèi)皮細(xì)胞受損條件下，Ach的以上作用將不復(fù)存在。糖尿病內(nèi)皮依賴性舒張功能異常，其機(jī)制還不清楚，它除了影響NO這條途徑，還可能與血管平滑肌受損有關(guān)。可能機(jī)制為：(1)糖尿病時NO合成減少活性降低；(2)NO滅活增加[2]，主要影響因素如氧自由基及糖基化終末產(chǎn)物；(3)降低對NO的反應(yīng)性，通過影響鳥苷酸環(huán)化酶途徑；(4)對抗NO舒張效應(yīng)的血管收縮劑如前列腺素類及內(nèi)皮素的產(chǎn)生增加[3]。

病理情況下，內(nèi)皮依賴性NO介導(dǎo)的舒張功能受損是糖尿病患者內(nèi)皮功能障礙的指征[4]。如研究結(jié)果所示，糖尿病大鼠進(jìn)行MIRI導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞受損，以至于Ach內(nèi)皮依賴性舒張功能明顯下降，即便PCr預(yù)處理對于冠脈內(nèi)皮依賴性舒張功能并無明顯改善作用。而MIRI使冠脈對5-HT敏感性增高，最大收縮效能增強(qiáng)，PCr多次給藥預(yù)處理能夠降低冠脈對5-HT的高敏感性及收縮強(qiáng)度，在一定程度上可緩解冠脈血管的痙攣?？傊?，舒縮效應(yīng)的總和是能增加冠脈血流量，增加心肌細(xì)胞灌注，從而起到心肌保護(hù)作用。前期研究也證實：磷酸肌酸能夠增加糖尿病大鼠MIRI后血漿中NO的含量，減少ET-1的含量，調(diào)節(jié)血管舒縮因子的平衡[5]。

線粒體功能障礙是糖尿病導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷的早期事件[6]。線粒體的主要功能是為細(xì)胞供能，還與細(xì)胞代謝、凋亡及信號傳導(dǎo)通路相關(guān)[7]。糖尿病機(jī)體活性氧過度生成，可造成線粒體形態(tài)和功能的損害。如研究結(jié)果所示，缺血再灌注組內(nèi)皮細(xì)胞明顯腫脹脫落，細(xì)胞膜不完整，線粒體明顯腫脹，部分呈空泡樣改變。PCr預(yù)處理組內(nèi)皮細(xì)胞均無明顯水腫并貼附于內(nèi)彈力膜，線粒體也無明顯腫脹。外源性PCr補(bǔ)給，可提高心肌及冠脈高能磷酸化合物的含量，減輕能量代謝障礙，使細(xì)胞膜上泵的活性得以維持，減輕細(xì)胞水腫及線粒體腫脹甚至凋亡，對于維持線粒體形態(tài)和功能起到保護(hù)作用。

綜上所述，PCr作為細(xì)胞重要的能量供應(yīng)源，可為ATP補(bǔ)充能量，實驗表明PCr是心肌細(xì)胞在缺血條件下首先衰竭的物質(zhì)，且在組織缺氧誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞會反應(yīng)性地增加外源PCr攝取[8]。目前臨床上已將它廣泛應(yīng)用于治療心力衰竭、心肌梗死及體外循環(huán)手術(shù)，研究已證實，磷酸肌酸能夠改善糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷后的心功能[9]，但對于冠脈保護(hù)的研究尚未報道。磷酸肌酸預(yù)處理，通過靶向改善線粒體功能，調(diào)節(jié)線粒體動力學(xué)平衡，抑制線粒體介導(dǎo)的凋亡是治療血管病變的重要途徑。對于線粒體功能的維護(hù)也就是對內(nèi)皮細(xì)胞最大的保護(hù)，從而有益于冠脈血管舒縮功能的維持。