復方天麻首烏片中2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量測定方法的建立

張鈺祺，易徐航，楊恢檢，熊毓，陳雅靜，周璇

萍鄉(xiāng)市食品藥品檢驗所，江西 萍鄉(xiāng) 337000

復方天麻首烏片為萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院的醫(yī)院制劑，由制何首烏、天麻、澤瀉、山楂4 味中藥組成，具有養(yǎng)血息風，滋補肝腎之功效，主治肝腎陰虛所致的頭痛、頭暈目眩、口苦咽干、腰酸乏力、脫發(fā)、白發(fā)及有上述癥狀的早期高血壓，腦動脈硬化，脂溢性脫發(fā)，血管神經(jīng)性頭痛等。何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根。何首烏屬于典型的“生熟異治”中藥品種，其炮制品種制何首烏具有強筋骨、補肝腎、烏須發(fā)、益精血、化濁降脂等功效，常用于須發(fā)早白、血虛萎黃、腰膝酸軟、眩暈耳鳴、高脂血癥等［1］。何首烏中化學成分主要為二苯乙烯苷類，其中主要的藥效成分為2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷［2-5］。研究表明，2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷有降低總膽固醇，降血脂作用［6-7］。何首烏的炮制方法歷史上記載有很多，比如蒸制、黑豆制以及傳統(tǒng)的“九蒸九曬”等方式［8-9］，不同的炮制方法對何首烏的化學成分和內(nèi)在品質(zhì)會產(chǎn)生不同的影響［10］。制何首烏作為復方天麻首烏片中重要的君藥成分，其品質(zhì)的優(yōu)劣將直接影響到制劑的臨床療效。因此，為更好地對復方天麻首烏片中制何首烏進行內(nèi)在質(zhì)量控制，保障該制劑的臨床療效，研究以2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷為考察指標，采用HPLC 法建立了復方天麻首烏片中制何首烏的含量測定方法，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供科學參考。

1 材料

1.1 試藥

對照品：2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批號PF180629-08，Stanford Analytical Chemicals Inc.，純度99.48%）；甲醇、乙腈（色譜級，北京百靈威公司）；其余試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水，復方天麻首烏片均由萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院提供。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（美國Agilent 公司，型號1200）；萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler 公司，型號ME-204）；十萬分之一天平（德國Satorius 公司，型號CP225D）。

2 方法及結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1對照品儲備液的制備取2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，加入甲醇稀釋成每1 mL 含0.4 mg 的儲備溶液。

2.1.2供試品溶液的制備取供試品20 片，除去外層包衣，研細，取適量（約相當于本品6 片），精密稱定，置具塞錐形瓶內(nèi)，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，取出放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3陰性樣品溶液的制備取天麻100 g 粉碎成細粉；澤瀉 100 g、山楂 300 g 加水煎煮兩次，分別為2 h，1 h，濾過，合并濾液，濃縮，使其相對密度為1.16～1.20（60 ℃），加入乙醇使含醇含量達到60%，靜置沉淀48 h，取上清液，回收乙醇，濾液濃縮，使其相對密度為1.13～1.18（60 ℃），加入天麻細粉及淀粉適量，混合均勻，制粒干燥，使成100 g，按“2.1.2”項下方法制成陰性樣品溶液，依法測定，結(jié)果表明：陰性樣品的HPLC 圖譜中，未出現(xiàn)與對照品保留時間一致的色譜峰，見圖1。

2.2 色譜條件

色譜柱為Agilent 5 TC -C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以水-乙腈（81∶19）為流動相，流速為1.0 mL/min，波長320 nm，色譜柱溫度為30 ℃，進樣量為5 μL，結(jié)果顯示，對照品與其他組分的色譜峰分離度良好。對照品、樣品及陰性樣品色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖：A.對照品；B.供試品；C.陰性樣品

2.3 方法學考察

2.3.1線性關系考察精密量取上述對照品儲備溶液，加甲醇逐級稀釋得系列標準溶液，使其含對照品濃度分別為10.64，21.28，42.56，85.12，170.24，340.48 mg/L。按“2.2”項下色譜條件進樣，以進樣濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），得回歸方程：Y=16.402 21X-8.838 97，r=0.999 99。結(jié)果表明對照品進樣濃度在10.64～340.48 mg/L 范圍內(nèi)呈良好線性關系。

2.3.2精密度試驗精密吸取對照品溶液（85.12 mg/L）5 μL，按“2.2”項下色譜條件重復進樣6 次，記錄對照品的峰面積，RSD 為0.12%，結(jié)果表明精密度良好。

2.3.3穩(wěn)定性實驗取同一批次（批號：20210303）供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h 精密吸取5 μL 進樣，按“2.2”項下色譜條件，測定2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的峰面積，RSD 為0.78%。表明在室溫下供試品溶液12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4重復性試驗取同一批次（批號：20210303）樣品六份，按“2.1.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進行分析，計算2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量（μg/g）。結(jié)果RSD 為1.30%，表明該方法重復性良好。

2.3.5加樣回收率試驗取已知含量（456.7 μg/g；批號：20210303）的復方天麻首烏片樣品，研細，取約相當于本品3 片，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入適量對照品儲備液，按“2.1.2”項下方法制備，按“2.2”項下色譜條件進樣，測定加樣回收率（n=6），結(jié)果表明2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的平均回收率為95.15%（RSD%=2.42），結(jié)果見表1。2.3.6 耐用性試驗 取同一批次（批號：20210303）樣品，按“2.1.2”項下方法制備，分別選擇Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Sepax Amethyst C18-H（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Welch Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3 種品牌的色譜柱，按“2.2”項下色譜條件測定，結(jié)果無明顯差別。

表1 回收率試驗結(jié)果

2.4 樣品測定

取不同批號復方天麻首烏片樣品，按“2.1.2”項下供試品溶液的制備項下制備供試液。按“2.2”項下色譜條件進樣和分析，結(jié)果見表2。

表2 復方天麻首烏片樣品中2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量（n=3，μg/g）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

采用DAD 檢測器對2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品在190～400 nm 波長范圍內(nèi)掃描，其最大吸收波長為320 nm，因此選擇320 nm 作為檢測波長。流動相選擇中［11］，通過對甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸進行測定，結(jié)果表明乙腈-水（19∶81）條件下分離效果最好，峰形最佳，故選擇乙腈-水（19∶81）為流動相。

3.2 提取方法及時間的考察

提取條件采用超聲提取法分別考察了甲醇、50%甲醇、稀乙醇三種提取溶劑，結(jié)果表明甲醇提取效率最高［11］。在此基礎上，分別考察了水浴加熱回流和超聲兩種方式，結(jié)果顯示水浴加熱回流提取效率更高，故選用水浴加熱回流方式。同時對甲醇溶液用量10 mL、25 mL、50 mL 以及加熱回流時間30 min、1 h、1.5 h 進行考察，最后確定采用甲醇25 mL 加熱回流提取1 h 為宜。

3.3 小結(jié)

本研究建立了復方天麻首烏片中2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量測定方法，經(jīng)方法學驗證，該方法準確、快速，操作簡便，專屬性強，重現(xiàn)性好，從5 批復方天麻首烏片樣品中制何首烏的含量測定結(jié)果來看，2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量為366.7～856.7 μg/g，可用于復方天麻首烏片的質(zhì)量評價。