基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的瓜蔞紅花甘草湯治療帶狀皰疹作用機(jī)制研究

吳燕瑜，邱桂榮，齊俊南

江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006

帶狀皰疹（herpes zoster，HZ）是因潛藏在脊髓后根神經(jīng)節(jié)中的水痘-帶狀皰疹病毒被激活引起的急性炎癥性皮膚疾病，主要表現(xiàn)為局部皮膚損害和神經(jīng)痛［1］,老年人及免疫缺陷者易感［2］。由HZ引起的疼痛十分影響人們的正常生活，甚至?xí)斫箲]抑郁的負(fù)面情緒，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量［3］。目前其西醫(yī)治療方式包括口服藥物（如抗病毒藥、鎮(zhèn)痛藥、營養(yǎng)神經(jīng)藥等）、微創(chuàng)介入治療等，但仍不乏報(bào)道顯示其存在有效率低或療效欠佳者［4］。同時(shí)中醫(yī)藥對(duì)該病也早有認(rèn)識(shí)，治療方式眾多，包括中藥、針灸、火針等治療，不僅拓寬了該病的治療思路，也能夠提高治療效果［5］。

瓜蔞紅花甘草湯出自《赤水玄珠·醫(yī)旨緒余》，用于治療肋間皰疹，由瓜蔞、紅花、甘草三味藥組成，具有清熱解毒止痛之功?，F(xiàn)代藥理研究也表明，三味藥均具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用［6-8］，其中甘草更能有效抑制病毒［9］。蔚志仁等［10］采用口服瓜蔞紅花甘草湯和阿昔洛韋片、甲鈷胺膠囊治療帶狀皰疹，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療能夠加快患者癥狀的改善，降低帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛的發(fā)生。故本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法進(jìn)一步探究該方治療帶狀皰疹的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 瓜蔞紅花甘草湯中藥活性成分的篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺(tái)（TCMSP）檢索瓜蔞紅花甘草湯三味中藥的化合物，以口服生物利用度（OB）≥30%，化合物類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件，篩選出三味中藥的主要活性成分。

1.2 中藥靶點(diǎn)的獲取

在TCMSP 分析平臺(tái)的Related Targets 一欄中找出藥物有效成分相關(guān)的靶點(diǎn)，并通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行規(guī)范。在Uniprot數(shù)據(jù)庫中下載人類蛋白靶點(diǎn)，使用perl 語言查找出藥物有效成分相關(guān)對(duì)應(yīng)的人類蛋白靶點(diǎn)，若未能對(duì)應(yīng)到人類靶點(diǎn)，則將該活性成分刪除，從而建立藥物靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)集合。

1.3 疾病靶點(diǎn)的篩選

以“Herpes Zoster”為檢索詞，在GeneCards 和OMIM 2 個(gè)數(shù)據(jù)平臺(tái)中查找與帶狀皰疹相關(guān)的作用靶點(diǎn)，并檢索DrugBank數(shù)據(jù)庫對(duì)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)充。刪除重復(fù)值，得到疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集合。

1.4 藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)韋恩圖的構(gòu)建

將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入Venny軟件，得出共同靶點(diǎn)信息，并繪制韋恩圖（Venn）。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“1.4”中得到的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，物種（organism）選定為人類（homo sapiens），設(shè)置highest confidence>0.9 且刪除游離節(jié)點(diǎn)，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，并導(dǎo)出網(wǎng)絡(luò)相關(guān)信息的TSV 文件。

1.6 中藥對(duì)帶狀皰疹可視化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“1.4”中獲取的共同靶點(diǎn)及與之對(duì)應(yīng)的藥物活性成分導(dǎo)入Cytoscape3.8.0 中，用于構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)的可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.7 藥物活性成分-疾病靶點(diǎn)的GO 和KEGG 通路富集分析

GO 富集分析從生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）三個(gè)層面對(duì)基因的參與度進(jìn)行評(píng)判。KEGG 通路富集分析用于探究調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的基因主要參與的通路和該通路中基因參與的顯著性。使用R 語言程序進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，設(shè)定P值過濾條件為0.05，得出富集分析文件，并繪制圖形。

2 結(jié)果

2.1 中藥化合物篩選結(jié)果

在TCMSP 分析平臺(tái)檢索出藥物活性成分分別為瓜蔞80 種、紅花189 種、甘草280 種。經(jīng)過篩選得到瓜蔞主要活性成分為11 種，紅花為22 種，甘草為92 種，列舉其中主要成分，見表1。

表1 瓜蔞紅花甘草湯主要活性成分表

表1 （續(xù)）

2.2 中藥活性成分-作用靶點(diǎn)的獲取

通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫對(duì)中藥靶點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范，共獲取靶點(diǎn)1 922 個(gè)，甘草活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)有1 500 個(gè)，瓜蔞為31 個(gè)，紅花為391 個(gè)，刪除重復(fù)值后最終得到瓜蔞紅花甘草湯作用靶點(diǎn)238 個(gè)。

2.3 疾病靶點(diǎn)獲取

檢索與帶狀皰疹相關(guān)的作用靶點(diǎn)，其中GeneCards 數(shù)據(jù)庫查找靶點(diǎn)399 個(gè)，OMIM 數(shù)據(jù)庫為9 個(gè)，DrugBank 數(shù)據(jù)庫為35 個(gè)。合并去重得到434 個(gè)作用靶點(diǎn)。

2.4 藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的韋恩圖

將中藥作用的靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 軟件繪制出的韋恩圖見圖1。獲取兩者的交集基因?yàn)?8 個(gè)，包 括PGR、MAPK14、IL4、CDK2、JUN、IKBKB、AKT1、TNF、CASP3、MAPK8 等。

圖1 瓜蔞紅花甘草湯-帶狀皰疹的韋恩圖

2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

交集基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)平臺(tái)繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)數(shù)為38 個(gè)，共計(jì)148 條邊，平均度值為7.79。節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間連接的邊越多，說明兩靶點(diǎn)之間互作關(guān)系越強(qiáng)。并分析TSV 文件中Degree值，該值越大，說明與該節(jié)點(diǎn)相互作用的靶點(diǎn)越多。如STAT3 節(jié)點(diǎn)的Degree 值為20，TNF 節(jié)點(diǎn)的Degree 值為17，具體分析見圖2。

圖2 瓜蔞紅花甘草湯治療帶狀皰疹的作用靶點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)Degree值前20的柱狀圖

2.6 中藥對(duì)帶狀皰疹的可視化網(wǎng)絡(luò)

使用Cytoscape3.8.0 構(gòu)建瓜蔞紅花甘草湯活性成分-疾病靶點(diǎn)的可視化網(wǎng)絡(luò)，具體見圖3。

圖3 瓜蔞紅花甘草湯治療帶狀皰疹的藥物-活性成分-靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 GO 和KEGG 通路富集分析

通過R 語言程序?qū)Π悬c(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析，獲取生物過程1 726 個(gè)，主要包括對(duì)脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）、對(duì)細(xì)菌起源分子的反應(yīng)（response to molecule of bacterial origin）、對(duì)腫瘤壞死因子的反應(yīng)（response to tumor necrosis factor）等；獲取細(xì)胞組分27 個(gè)，主要包括膜筏（membrane raft）、膜微區(qū)（membrane microdomain）、膜區(qū)（membrane region）等；獲取分子功能98 個(gè)，主要包括細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、磷酸酶結(jié)合（phosphatase binding）、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）具體見圖4。

圖4 GO富集分析

KEGG 通路富集為153 條，包括TNF 信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路等。具體見圖5。KEGG 富集的通路中，MAPK 信號(hào)通路與神經(jīng)損傷相關(guān)，具體見圖6。

圖5 KEGG通路富集分析

圖6 MAPK信號(hào)通路

3 討論

帶狀皰疹，又稱“蛇串瘡”“纏腰火龍”等，《諸病源候論·甑帶瘡候》曰：“甑帶瘡者纏腰生，狀如甑帶，因此為名?！薄锻饪拼蟪伞贩Q此證“俗名蛇串瘡，初生于腰，紫赤如疹，或起水皰，痛如火燎?！背毯瓯蟮龋?1］研究認(rèn)為蛇串瘡為毒邪所致，治療應(yīng)“解毒、攻毒”；李響等［12］研究認(rèn)為張從正的“攻邪學(xué)說”貫穿蛇串瘡的各個(gè)階段，要將治病首重攻邪與攻邪不傷正靈活應(yīng)用；趙莉莉［13］研究認(rèn)為該病的主要病機(jī)為氣滯血瘀，治以活血化瘀止痛。

瓜蔞紅花甘草湯中瓜蔞清熱潤燥、寬胸散結(jié)，紅花活血散瘀、通經(jīng)止痛，甘草清熱解毒、緩急止痛，故整方能清熱、解毒、止痛。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的探究，發(fā)現(xiàn)瓜蔞紅花甘草湯對(duì)帶狀皰疹的治療是通過多個(gè)靶點(diǎn)、多條通路發(fā)揮作用。該方的重要活性成分包括山柰酚、槲皮素、菠菜甾醇等。山柰酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性，抑制細(xì)菌和病毒感染引起的炎癥，改善神經(jīng)性疼痛［14-15］。槲皮素可減少IL-1β和IL-6 等促炎性因子的釋放、清除氧自由基［16］。菠菜甾醇能夠抑制PEG2、緩激肽等炎癥遞質(zhì)的釋放發(fā)揮抗炎作用［17］。通過可視化網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)藥物主要通過CDK2、MAPK14 等靶點(diǎn)發(fā)揮作用。研究表明，CDK2 參與病毒的復(fù)制，通過對(duì)其抑制可減少病毒感染［18］。p38α/MAPK14 的激活能夠促進(jìn)IL6、TNFα 等促炎性因子的釋放，導(dǎo)致外周疼痛敏化的發(fā)生和維持［19-21］。KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，瓜蔞紅花甘草湯主要通過TNF、IL-17、MAPK 等信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)帶狀皰疹發(fā)揮治療作用。MAPK 信號(hào)通路包含ERK1/2、JNK、p38 等通路［22］。研究表明，NF-κB 和ERK1/2 通路的抑制對(duì)原發(fā)性大鼠星形細(xì)胞的中缺氧/再氧化誘發(fā)損傷有神經(jīng)保護(hù)作用［23］。張敏等［24］通過小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制JNK 通路能夠緩解CXCL13 誘導(dǎo)的痛敏反應(yīng)。陳春生等［25］發(fā)現(xiàn)抑制炎癥痛大鼠模型的CCR2 活性可降低p-p38MAPK的表達(dá)，從而緩解炎性疼痛。

綜上所述，瓜蔞紅花甘草湯可從多個(gè)靶點(diǎn)、多條通路發(fā)揮對(duì)帶狀皰疹的治療作用。本研究為瓜蔞紅花甘草湯治療帶狀皰疹的臨床應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)，同時(shí)本研究僅對(duì)潛在治療通路進(jìn)行預(yù)測(cè)，實(shí)際情況仍需通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。