婁徹氏鏈霉菌ZZ-9 與阿維菌素復(fù)配對(duì)南方根結(jié)線蟲病的防治效果

黑雅婭，楊 樹，張 欣，陳軍宏，張 揚(yáng)，薛應(yīng)鈺

（甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室·甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 蘭州 730070）

阿維菌素是由土壤微生物阿維鏈霉菌的代謝產(chǎn)物研制而成的微生物源農(nóng)藥，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，對(duì)防治根結(jié)線蟲具有良好效果。長(zhǎng)期單一使用阿維菌素等農(nóng)藥會(huì)使害蟲產(chǎn)生抗藥性，而盲目濫用農(nóng)藥也嚴(yán)重影響人類健康和農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展。湯晗等對(duì)浙江省芹菜進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測(cè)，94.7%的芹菜樣品中有農(nóng)藥檢出。韓明慧等研究發(fā)現(xiàn)新煙堿農(nóng)藥具有生殖毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性、遺傳毒性和內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，而且動(dòng)物染毒劑量為mg·kg·d級(jí)別，高于一般人群μg·kg·d級(jí)別的暴露劑量。張巍等報(bào)道顯示農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染主要表現(xiàn)在大氣污染、水體污染、土壤污染以及對(duì)生物的影響等方面。

近年來(lái)使用生防放線菌來(lái)防治植物病害已成為研究熱點(diǎn)。放線菌是廣泛分布于自然界中尤為重要的優(yōu)勢(shì)微生物類群，可以產(chǎn)生多種活性物質(zhì)。鏈霉菌屬是放線菌的一個(gè)主要類群，所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)種類多樣，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。胡棟等報(bào)道抗生素鏈霉菌（）菌株S205 對(duì)根結(jié)線蟲的校正擊倒率為92.90%，盆栽防效達(dá)到56.82%，且該菌在亞低溫狀態(tài)下依然能較好生長(zhǎng)，抗性較強(qiáng)。周銀麗等分離的壯觀鏈霉菌（）菌株JS 1可以有效殺死南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲、抑制線蟲卵孵化。此外還有研究表明，微白黃鏈霉菌（）菌株發(fā)酵培養(yǎng)液對(duì)根結(jié)線蟲具有明顯的抑制作用，殺線活性為93.29%。由此可見，鏈霉菌可以產(chǎn)生多種防治根結(jié)線蟲的活性物質(zhì)，具有很高的研究?jī)r(jià)值。

本試驗(yàn)所用放線菌菌株為婁徹氏鏈霉菌（）ZZ-9，是由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室分離的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的生防菌株。主要研究了婁徹氏鏈霉菌（）ZZ-9 活菌液、發(fā)酵濾液的殺線活性以及菌株發(fā)酵液與阿維菌素以不同比例復(fù)配對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的毒殺作用。以期通過(guò)本研究來(lái)減少化學(xué)農(nóng)藥的使用和延緩根結(jié)線蟲抗藥性產(chǎn)生，探索出一種新的方法來(lái)防治南方根結(jié)線蟲病，對(duì)農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試生防菌株 婁徹氏鏈霉菌ZZ-9（專利保存號(hào)：CGMCC No.15245）由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 供試植株和藥劑 使用的番茄品種為秦蔬毛粉802，由西安秦蔬農(nóng)業(yè)有限公司生產(chǎn)。供試藥劑為1.8%阿維菌素乳油，由山東省綠士農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 供試土壤 移栽病土于2017 年7 月采自甘肅省蘭州市榆中縣南方根結(jié)線蟲發(fā)生較嚴(yán)重的番茄地塊。選取每塊田地的四角位置和中間位置為采集點(diǎn)，在植株周圍選3 處不同位置用鐵鏟挖5～20 cm 處，每個(gè)位置取100 g 左右的土壤并去除肉眼可見較大的石塊或者腐質(zhì)，然后裝至自封袋中混合均勻，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.1.4 供試線蟲 南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲從上述土樣中分離。

1992年10月，江澤民在黨的十四大報(bào)告中提出：“奪取有中國(guó)特色社會(huì)主義事業(yè)的更大勝利”［3］210，在概念表述上，把“建設(shè)有中國(guó)特色的社會(huì)主義理論”表述成“建設(shè)有中國(guó)特色社會(huì)主義理論”，并從社會(huì)主義的發(fā)展道路、發(fā)展階段、根本任務(wù)等九個(gè)方面對(duì)建設(shè)有中國(guó)特色社會(huì)主義理論的內(nèi)容進(jìn)行了全面概括。

1.1.5 培養(yǎng)基 高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基、高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基、小米浸汁培養(yǎng)基。

1.1.6 主要儀器 HZP-91R 恒溫培養(yǎng)搖床，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；VORTEX-5 漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；RQX-250 智能型人工氣候箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 南方根結(jié)線蟲的繁殖和二齡幼蟲的獲得2019 年6 月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室采用盆栽感病番茄繁殖南方根結(jié)線蟲。將番茄種子催芽后播種于采集的病土土樣中，繁殖南方根結(jié)線蟲，每盆種2 株番茄，共10 盆。35 d 后，將番茄根取出并用流水沖洗表面泥土，用鑷子挑取根部卵囊于培養(yǎng)皿中，用0.5%次氯酸鈉消毒3 min，再用無(wú)菌水反復(fù)沖洗3 次。將消毒后的卵囊置于滅菌的培養(yǎng)皿中，室溫條件下孵化2 d，每隔24 h 用移液槍收集二齡幼蟲于滅菌的三角瓶中，采用計(jì)數(shù)皿對(duì)二齡幼蟲進(jìn)行計(jì)數(shù)，并用無(wú)菌水將其配制成200 條·mL的線蟲懸浮液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.2 ZZ-9 菌株活菌液的制備 將放線菌ZZ-9 采用劃線法接種于高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，于28 ℃倒置培養(yǎng)7 d。向150 mL 三角瓶中加入60 mL 高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基，并將活化好的ZZ-9 菌株菌餅（直徑5 mm）挑取到三角瓶中，每個(gè)三角瓶接6 個(gè)菌餅，28 ℃、180 r·min振蕩培養(yǎng)72 h，制成種子液；按照10%的接種量將種子液接入到80 mL 的小米浸汁培養(yǎng)基中（150 mL 三角瓶），28 ℃、180 r·min振蕩培養(yǎng)4d 后，即得活菌液。

1.2.3 ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液的制備 將活菌液在4 ℃、10 000 r·min條件下離心20 min，取上清液，用0.22μm 微孔濾器過(guò)濾，即得無(wú)菌發(fā)酵濾液，存于4 ℃冰箱，備用。

1.2.4 阿維菌素溶液的制備 將1.8%阿維菌素乳油用無(wú)菌水分別配制成有效成分含量（，后同）為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg·mL的藥液備用。

1.2.5 ZZ-9 菌株活菌液、發(fā)酵濾液殺線活性測(cè)定將ZZ-9 菌株活菌液和發(fā)酵濾液分別稀釋5 倍、10倍、15 倍、20 倍后加入無(wú)菌24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（直徑20.0 mm），每孔加入300 μL，再加入10 μL 線蟲懸浮液（200 條·mL），以加入300μL 無(wú)菌水和10μL線蟲懸浮液為對(duì)照，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理3 次重復(fù)，密封后于25 ℃條件下保濕培養(yǎng)，每隔24 h 觀察并記錄線蟲的死亡情況，計(jì)算死亡率、校正死亡率[19]。

1.2.6 ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液與阿維菌素以不同比例復(fù)配的殺線活性測(cè)定 將ZZ-9 菌株發(fā)酵原液和5個(gè)濃度（，后同）梯度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg·mL）的阿維菌素溶液分別以1∶1、2∶1、3∶1 復(fù)配，利用混勻儀充分震蕩使其混合均勻，每個(gè)處理3 次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。按照1.2.5 方法測(cè)定殺線活性。

1.3 線蟲死亡情況的判斷

采用“體態(tài)法”“挑針刺激法”和“NaOH 刺激法”判斷線蟲死亡情況。在光學(xué)顯微鏡下，觀察不同條件處理后南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的存活情況。死亡的二齡幼蟲蟲體一般為僵直狀態(tài)，存活的二齡幼蟲蟲體一般為彎曲狀，且不斷地游動(dòng)。用挑針輕輕撥動(dòng)蟲體僵直的二齡幼蟲，靜止不動(dòng)的即為死亡個(gè)體。最后1 次觀察時(shí)向細(xì)胞培養(yǎng)板孔中滴入1%的NaOH 溶液，在顯微鏡下觀察，靜止不動(dòng)的即為死亡個(gè)體。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 和DPS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用SPSS 16.0 軟件計(jì)算LC，用Origin 9.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZZ-9 菌株活菌液、發(fā)酵濾液殺線活性測(cè)定結(jié)果

2.1.1 ZZ-9 菌株活菌液殺線活性測(cè)定結(jié)果 不同濃度的ZZ-9 菌株活菌液對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲均有明顯的毒殺作用，其中活菌液原液對(duì)二齡幼蟲毒殺效果最好，顯著高于其他濃度處理，在48 h 時(shí)達(dá)到36.13%，24 h 時(shí)達(dá)到15%，且48 h 處理的校正死亡率總體均高于24 h；但隨著稀釋倍數(shù)的增加，不同濃度處理對(duì)二齡幼蟲的毒殺作用不成規(guī)律性，這可能是由于菌液中的活菌體在各處理中分布不均導(dǎo)致的（圖1）。

圖1 ZZ-9 菌株活菌液對(duì)二齡幼蟲的毒殺作用

2.1.2 ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液殺線活性測(cè)定結(jié)果 通過(guò)不同濃度梯度的ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液對(duì)根結(jié)線蟲二齡幼蟲的毒殺作用測(cè)定，可知在一定范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵濾液稀釋倍數(shù)的增加，校正死亡率逐漸降低；且48 h 處理的校正死亡率總體均高于24 h 處理，南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的校正死亡率最高為11.87%，但48 h 時(shí)不同稀釋倍數(shù)之間變化差異不顯著；在24 h 時(shí)發(fā)酵濾液原液和稀釋5 倍液對(duì)二齡幼蟲的毒殺效果顯著高于其他稀釋倍數(shù)處理，但2 個(gè)時(shí)間處理均為發(fā)酵液原液表現(xiàn)出最強(qiáng)的殺線活性。因此，選擇發(fā)酵濾液原液進(jìn)行下一步試驗(yàn)（圖2）。

圖2 ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液對(duì)二齡幼蟲的毒殺作用

2.1.3 阿維菌素溶液對(duì)二齡幼蟲的毒殺作用結(jié)果 由圖3 可知，南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的校正死亡率隨著阿維菌素溶液濃度的增大而逐漸升高，當(dāng)濃度為1.0μg·mL時(shí)的殺線效果最好；且48 h 處理的校正死亡率總體均高于24 h 處理，最高達(dá)到30.60%；從圖3 中可看出兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)都是濃度為

圖3 阿維菌素溶液對(duì)二齡幼蟲的毒殺作用

0.2μg·mL的校正死亡率顯著低于其他濃度處理，當(dāng)在24 h 時(shí)濃度為0.2μg·mL的校正死亡率比其他濃度處理分別低了10.82%、13.05%、13.58%和14.44%，48 h 時(shí)0.2 μg·mL的校正死亡率比1.0μg·mL低了19.59%。可見，作為市面上防治根結(jié)線蟲的主要產(chǎn)品，阿維菌素對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的防治較為理想。

2.2 發(fā)酵濾液與阿維菌素溶液不同比例復(fù)配殺線活性測(cè)定結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵濾液與阿維菌素溶液1∶1 復(fù)配對(duì)二齡幼蟲的毒殺作用 ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液與阿維菌素溶液1∶1 復(fù)配后對(duì)二齡幼蟲有較強(qiáng)的毒殺作用，隨著阿維菌素溶液濃度的增大，復(fù)配溶液對(duì)二齡幼蟲的毒殺效果也越好；而且48 h 處理的校正死亡率總體均高于24 h，其LC值分別為0.648 3μg·mL和1.399 2μg·mL；當(dāng)阿維菌素濃度為0.2μg·mL時(shí)的校正死亡率分別為24.85%（48 h）和18.30%（24 h）顯著低于其他濃度處理；此外，當(dāng)阿維菌素濃度為1.0μg·mL時(shí)對(duì)二齡幼蟲的毒殺效果最好，48 h 時(shí)二齡幼蟲的校正死亡率為48.87%，比0.2 μg·mL高24.02%（圖4）。

圖4 ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液與阿維菌素溶液1∶1 復(fù)配對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的毒殺作用

2.2.2 發(fā)酵濾液與阿維菌素溶液2∶1 復(fù)配對(duì)二齡幼蟲的毒殺作用 由圖5 可知，ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液與阿維菌素溶液2∶1 復(fù)配后對(duì)二齡幼蟲有較強(qiáng)的毒殺作用，48 h 處理的校正死亡率總體均高于24 h，其LC值分別為1.417 6μg·mL和2.641 4μg·mL；當(dāng)阿維菌素溶液濃度為1.0μg·mL時(shí)復(fù)配溶液對(duì)二齡幼蟲的毒殺效果最好，48 h 時(shí)校正死亡率為39.10%，顯著高于其他濃度處理，其中比0.2μg·mL高了29.72%。

圖5 ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液與阿維菌素溶液2∶1 復(fù)配對(duì)二齡幼蟲的毒殺作用

2.2.3 發(fā)酵濾液與阿維菌素溶液3∶1 復(fù)配對(duì)二齡幼蟲的毒殺作用 ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液與阿維菌素溶液3∶1 復(fù)配后對(duì)二齡幼蟲的毒殺效果顯著。48 h時(shí)，隨著溶液濃度的增大南方根結(jié)線蟲的校正死亡率也逐漸增大；當(dāng)阿維菌素濃度為1.0μg·mL時(shí)復(fù)配溶液對(duì)二齡幼蟲的毒殺效果最好，校正死亡率分別為54.44%（48 h）和34.42%（24 h），顯著高于其他濃度處理。其中，比0.2μg·mL分別高了53.35%和33.03%（圖6）。此外，24 h 和48 h 的LC值分別為1.801 1μg·mL和0.964 0μg·mL。

圖6 ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液與阿維菌素溶液3∶1 復(fù)配對(duì)二齡幼蟲的毒殺作用

2.2.4 不同溶液對(duì)二齡幼蟲殺線活性比較 由圖7可以得出，ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液與阿維菌素溶液以不同比例復(fù)配后對(duì)二齡幼蟲均有較強(qiáng)的毒殺作用。當(dāng)發(fā)酵濾液與阿維菌素溶液（濃度為1.0μg·mL）以3∶1 復(fù)配時(shí)毒殺效果最好，處理48 h 時(shí)，二齡幼蟲的校正死亡率高達(dá)54.44%，比單一使用阿維菌素的校正死亡率提高了23.84%，且藥劑使用量?jī)H有單一使用量的25%；2∶1 復(fù)配處理48 h 時(shí)，二齡幼蟲的校正死亡率達(dá)39.10%，比單一使用阿維菌素高8.5%；1∶1 復(fù)配處理48 h 時(shí)校正死亡率為48.87%，比單一使用阿維菌素的校正死亡率高18.27%。

圖7 不同溶液對(duì)二齡幼蟲的殺線活性比較（阿維菌素濃度為1.0 mg·mL-1）

ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液與阿維菌素溶液不同比例復(fù)配的殺線活性相比較沒有表現(xiàn)出一定的規(guī)律性，但均高于單一使用發(fā)酵濾液原液（校正死亡率為11.87%）或單一使用阿維菌素（校正死亡率為30.60%）。可見，ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液和阿維菌素溶液可以相互兼容，具有一定協(xié)同作用，復(fù)配使用有助于提高對(duì)南方根結(jié)線蟲病的防治效果。

3 討論與結(jié)論

隨著蔬菜長(zhǎng)期連作等現(xiàn)象的出現(xiàn)，根結(jié)線蟲病的發(fā)生日益嚴(yán)重，制約著蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。生產(chǎn)上防控根結(jié)線蟲主要以化學(xué)防治為主，具有高效、快速等特點(diǎn)，但是由于不合理的使用方法以及長(zhǎng)期大量、單一的使用農(nóng)藥而造成了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染等問(wèn)題，更直接影響了蔬菜的產(chǎn)量與品質(zhì)。因此亟需探尋出一種新的方法來(lái)防治植物病害。

近年來(lái)生物防治已成為研究熱點(diǎn)，鏈霉菌屬生防放線菌對(duì)多種植物病害都有防治效果，但容易受環(huán)境條件的影響。而將生防菌與殺線劑復(fù)配可以彌補(bǔ)二者各自的不足，既可以增強(qiáng)生防菌防效的穩(wěn)定性，充分發(fā)揮生防菌與殺線劑的協(xié)同作用，又可以減少農(nóng)藥的使用量，減緩線蟲抗藥性的產(chǎn)生。阿維菌素是目前防治根結(jié)線蟲使用最多的藥劑，張俊龍等研究結(jié)果顯示，1.8%阿維菌素乳油對(duì)南方根結(jié)線蟲表現(xiàn)出較好的室內(nèi)活性，其LC值為14.926 3 mg·L。朱衛(wèi)剛等試驗(yàn)結(jié)果表明, 1.8%阿維菌素乳油對(duì)南方根結(jié)線蟲具有很強(qiáng)的殺線活性, 其LC為1.48 mg·L。而本研究結(jié)果顯示當(dāng)ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液原液與1.8%阿維菌素乳油（濃度為1.0μg·mL）以3∶1 復(fù)配時(shí)對(duì)南方根結(jié)線蟲病的防治作用較強(qiáng)，其LC為0.964μg·mL。可見生防菌ZZ-9 與阿維菌素有潛在的相容性，復(fù)配方案可以提高阿維菌素對(duì)根結(jié)線蟲的防治效果。

大量研究表明生防菌與殺菌劑等藥劑復(fù)配可以防治多種植物病害，并且能充分發(fā)揮二者間的協(xié)同作用。JI 等研究表明，枯草芽孢桿菌.DJ-6 與吡唑醚菌酯1∶1 配比時(shí)對(duì)草莓枯萎病抑制增效作用最大。趙廣等研究證明枯草芽孢桿菌9 A 與嘧菌酯、咪鮮胺、吡唑醚菌酯、多菌靈復(fù)配可有效防治杧果炭疽病，其防效均顯著高于單一化學(xué)農(nóng)藥處理及單一菌液處理，可以減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量。毛雪琴等研究發(fā)現(xiàn)將生防菌MT-06 與甲霜錳鋅混配可提高甲霜錳鋅對(duì)小麥赤霉病的防效。還有研究表明，印楝素與5%阿維菌素復(fù)配施用，防治效果顯著高于單一使用；其次，葉田會(huì)等研究結(jié)果顯示，永衛(wèi)168 與淡紫擬青霉聯(lián)合施用的防效為75.83%，較單一處理的防效提高了23.75%～28.89%。筆者在研究中也發(fā)現(xiàn)將生防菌和藥劑復(fù)配使用對(duì)南方根結(jié)線蟲病的防效均高于單一使用阿維菌素及單一使用菌株發(fā)酵液，可見將生防菌與藥劑復(fù)配可增強(qiáng)生防菌防效的穩(wěn)定性，提高藥劑的防治效果，這與前人研究結(jié)果相一致。因此，采用生防菌與藥劑復(fù)配防治植物病害具有一定的可行性。

綜上所述，本試驗(yàn)通過(guò)室內(nèi)防效試驗(yàn)篩選出了最佳復(fù)配方案，當(dāng)ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液原液與阿維菌素（濃度為1.0μg·mL）以3∶1 復(fù)配時(shí)對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的防治作用最強(qiáng)，48 h 時(shí)的校正死亡率為54.44%。試驗(yàn)結(jié)論初步發(fā)現(xiàn)將生防菌與農(nóng)藥復(fù)配可提高單一使用藥劑或生防菌的防治效果，減少農(nóng)藥使用量，為婁徹氏鏈霉菌ZZ-9 的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了更廣闊的思路，但其田間防效及實(shí)際推廣應(yīng)用還需進(jìn)一步試驗(yàn)研究。