內(nèi)生拮抗細(xì)菌264ZY7 的生物學(xué)特性測定及發(fā)酵條件優(yōu)化

劉 華，馮中紅，李統(tǒng)華，楊成德

（1.甘肅省經(jīng)濟(jì)作物技術(shù)推廣站 蘭州 730000； 2.甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室·甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 蘭州 730070）

隨著我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們生活水平的提高，對農(nóng)業(yè)發(fā)展的追求已從單純的高產(chǎn)轉(zhuǎn)化為優(yōu)質(zhì)安全。化學(xué)農(nóng)藥的過量使用甚至濫用，造成了農(nóng)藥污染、農(nóng)藥殘留、土壤多樣性破壞和食品安全性降低等問題。于是生物防治成為近年來新的研究熱點。生物防治具有高效無污染、無毒無公害等基本特點，不但與綠色食品的需求相符合，還可保障農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。具有顯著生防作用的內(nèi)生細(xì)菌在大面積推廣應(yīng)用到田間前需制成生防菌劑，且該生防菌劑須具備生防物質(zhì)活性高和存儲時間長等特點，而發(fā)酵工藝的優(yōu)化可提高拮抗菌株的生物量和活性，并降低生產(chǎn)成本。解淀粉芽孢桿菌中許多菌株能分泌抗菌物質(zhì)、產(chǎn)生拮抗作用、營養(yǎng)與空間的競爭及誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性和促進(jìn)植物生長等，是具有開發(fā)生物農(nóng)藥潛力的微生物。本試驗中，解淀粉芽孢桿菌264ZY7 是一株從高寒草甸牧草中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌，對馬鈴薯炭疽病菌（）、馬鈴薯枯萎病菌（）、小麥根腐病菌（）、黃瓜枯萎病菌（.）、番茄灰霉病菌（）和馬鈴薯褐腐病菌（）等真菌和番茄細(xì)菌性斑點病菌（pv.）等細(xì)菌均有良好的拮抗作用。因此，2016 年在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病原細(xì)菌及細(xì)菌多樣性實驗室對解淀粉芽孢桿菌264ZY7 的生長及促生特性進(jìn)行測定，并結(jié)合單因素試驗和正交設(shè)計試驗對其高密度發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為菌株264ZY7 規(guī)?；a(chǎn)、開發(fā)新型生防制劑奠定基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步田間的小試和中試提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

解淀粉芽孢桿菌（）264ZY7 由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病原細(xì)菌及細(xì)菌多樣性實驗室保存。

1.2 供試培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基NA 和培養(yǎng)液NB，PKO平板培養(yǎng)基和孟金娜平板培養(yǎng)基，阿須貝培養(yǎng)基。

1.3 生長及促生特性測定

1.3.1 生長溫度測定 最低溫度測定：將待測菌株于NA 斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，分別置于溫度梯度為0、2、4、6、8、10、12、14、16 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察其生長情況；3 次重復(fù)（每個重復(fù)樣本數(shù)5 個，下同）。

最高溫度測定：將待測菌株于NA 斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，分別置于溫度梯度為45、47、49、51、53、55、57、59、61 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h 后觀察其生長情況；3 次重復(fù)。

致死溫度測定：將待測菌株培養(yǎng)液接于裝10 mL NB 培養(yǎng)液的試管中，分別經(jīng)90、91、92、93、94、95、100、105、110 ℃的高溫處理10 min 后，取0.1 mL 菌懸液均勻涂布于NA 平板上，并于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h 后觀察并記錄菌落生長情況；3次重復(fù)。

最適溫度測定：取0.03 mL 待測菌株培養(yǎng)液接于裝3 mL NB 培養(yǎng)液的試管中，以接無菌水培養(yǎng)液為對照，分別置于22、24、26、28、32、34、36 ℃的搖床培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速180 r·min），3 次重復(fù)，24 h 后測定OD值。

1.3.2 最適生長pH 測定 將NB 培養(yǎng)液初始pH用40%NaOH 和40%HCl 分別調(diào)為3、4、5、6、7、8、9、10 和11，取0.03 mL 待測菌株接于裝有3 mL NB培養(yǎng)液的試管中，以無菌水培養(yǎng)液為對照，于28 ℃、180 r·min搖床中培養(yǎng)，3 次重復(fù)，12 h 后測定OD值。

1.3.3 生長曲線測定 取0.03 mL 待測菌株接于裝有3 mL NB 培養(yǎng)液的試管中，以接無菌水培養(yǎng)液為對照，于28 ℃、180 r·min搖床中培養(yǎng)，3 次重復(fù)，前3 h 每隔30 min 檢測一次OD值，3 h 后每隔1 h測一次。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，制作生長曲線。

1.3.4 生物學(xué)功能的研究 溶磷能力采用溶磷圈法，即將待測菌株分別點接在PKO 和孟金娜平板培養(yǎng)基上，同時，用無菌水點接作為對照，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，菌落周圍出現(xiàn)透亮溶磷圈的記錄為陽性，否則為陰性；將待測菌株用劃線法接于阿須貝培養(yǎng)基上，3 次重復(fù)，以接無菌水為對照，28 ℃培養(yǎng)，在第3天和第7 天檢查其生長情況，在培養(yǎng)基上明顯生長者記為陽性，繼代培養(yǎng)3 代仍為陽性，則認(rèn)為具有固氮能力；利用Salkowski 法測定產(chǎn)IAA 能力。

1.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.4.1 種子液制備 將已活化的新鮮待測菌株接于NA 培養(yǎng)液（100 mL·150 mL三角瓶）中，振蕩培養(yǎng)（180 r·min，28 ℃）24 h，制得種子液。

1.4.2 碳、氮源及無機(jī)鹽篩選 供試碳源：A 蔗糖；B 玉米淀粉；C 水溶性淀粉；D 麥芽糖；E 乳糖；F 不加糖；CK NB 培養(yǎng)基。將以上碳源分別替換基礎(chǔ)培養(yǎng)液（40 mL·150 mL三角瓶）中葡萄糖，接入種子液2 mL，振蕩培養(yǎng)（180 r·min，28 ℃）24 h，3 次重復(fù)，測定發(fā)酵液OD值，以O(shè)D值確定最佳碳源。

供試氮源：A 尿素；B（NH）SO；C KNO；D NHCl；E 酵母膏；F 不加氮；CK NB 培養(yǎng)液。將以上氮源分別替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中蛋白胨，其他處理同碳源篩選，以確定最佳氮源。

無機(jī)鹽：A MgSO；B KHPO；C MnSO；D Cu-SO；E CaCl；F 不加無機(jī)鹽離子；CK NB 培養(yǎng)基。將以上無機(jī)鹽分別替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中NaCl，其他處理同碳源篩選，以確定無機(jī)鹽。

1.4.3 正交試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗篩選結(jié)果，將最適碳、氮源和無機(jī)鹽按不同濃度進(jìn)行L9（3）正交試驗（表1），28 ℃，180 r·min搖床振蕩培養(yǎng)24 h，通過檢測發(fā)酵液OD值，分析方差顯著性，確定最優(yōu)培養(yǎng)基組合。

表1 L9（33）正交試驗設(shè)計

1.4.4 搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化 設(shè)定pH 為5、6、7、8、9，溫度為20、24、28、32、36 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為150、180、210、240、270 r·min，接種量為0.5%、1%、2%、6%、10%，裝液量為150 mL 三角瓶中分裝20、40、60、80 和100 mL 培養(yǎng)液，3 次重復(fù)；在最佳培養(yǎng)基上分別振蕩培養(yǎng)24 h，檢測發(fā)酵液OD，篩選發(fā)酵條件。

1.4.5 100 L 發(fā)酵罐放罐時間確定 在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，對生防菌株進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，每隔3 h 取樣，3 次重復(fù)，測定發(fā)酵液OD值，確定100 L 發(fā)酵罐中最佳放罐時間。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010 和SPSS 19.0 等軟件進(jìn)行試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長及促生測定

2.1.1 最低、最高、致死和最適生長溫度的測定由圖1 可知，菌株264ZY7 在溫度低于2 ℃或高于55 ℃時不生長，在30～36 ℃時OD明顯高于其他溫度，在110 ℃水浴10 min 后涂于NA 平板上48 h后未發(fā)現(xiàn)菌落，表明菌株264ZY7 最高生長溫度為55 ℃，最低、致死和最適溫度分別為2 ℃、110 ℃和30～36 ℃。

圖1 最適生長溫度測定

2.1.2 生長pH 值測定 由圖2 可知，pH 值在4 及以下時菌株264ZY7 生長明顯受限，pH 值在5～7范圍時生長良好，其OD高于其他pH 值，pH 超過8 時，菌株生長減緩，pH 值達(dá)到11 時菌株不生長。這表明菌株264ZY7 最適生長pH 值為5～7，低于4和高于8 不利于其生長。

圖2 菌株264ZY7 最適生長pH

2.1.3 生長曲線測定 由圖3 可知，菌株264ZY7在0～5 h 為遲緩期，在5 h 后進(jìn)入對數(shù)生長期，14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，在30 h 時菌株生物量上升到最大值，之后進(jìn)入衰退期（圖3）。

圖3 菌株264ZY7 生長曲線

2.1.4 促生能力表征測定 菌株264ZY7 在無氮阿須貝培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d 可以正常生長，且連續(xù)培養(yǎng)3 代均可形成明顯菌落，說明菌株具有穩(wěn)定的固氮能力；在溶磷培養(yǎng)基上不形成透明圈，說明無溶磷作用；在含色氨酸和不含色氨酸的培養(yǎng)液中分別加入比色液均表現(xiàn)為淡紅色或血紅色的陽性反應(yīng)（圖4），表明菌株有產(chǎn)IAA 的能力。

圖4 產(chǎn)IAA 能力的定性測定

2.2 碳、氮源及無機(jī)鹽篩選

2.2.1 碳、氮源及無機(jī)鹽篩選 由圖5 可以看出，菌株264ZY7 碳源為蔗糖時，OD顯著大于其他碳源，即最適碳源為蔗糖。

圖5 碳源對菌株264ZY7 生長的影響

由圖6 可以看出，在酵母膏為氮源的培養(yǎng)基上OD顯著高于其他氮源，說明酵母膏是最適氮源，尿素對該菌株有顯著的抑制作用。

圖6 氮源對菌株264ZY7 生長的影響

由圖7 可以看出，CK（無機(jī)鹽為NaCl）時發(fā)酵液OD顯著高于其他無機(jī)鹽，表明NaCl 是最佳無機(jī)鹽，CuSO與MnSO對其有顯著的抑制作用。

圖7 無機(jī)鹽對生防菌株264ZY7 生長的影響

2.2.2 碳、氮源及無機(jī)鹽濃度優(yōu)化 菌株264ZY7在碳源濃度（，后同）為蔗糖20 g·L時，OD顯著大于其他碳源濃度，即最佳碳源濃度為蔗糖20 g·L；氮源酵母膏濃度為4 g·L時，OD顯著大于其他氮源酵母膏濃度，即最佳氮源濃度為酵母膏4 g·L；無機(jī)鹽濃度為NaCl 5 g·L時，OD顯著大于其他NaCl 濃度，即最佳無機(jī)鹽濃度為NaCl 5 g·L（圖8、圖9、圖10）。

圖8 碳源濃度對菌株264ZY7 生長的影響

圖9 氮源濃度對菌株264ZY7 生長的影響

圖10 無機(jī)鹽離子濃度對菌株264ZY7 生長的影響

2.3 正交試驗

由表2 正交試驗可知，菌株264ZY7 在蔗糖25 g、NaCl 5 g、酵母膏5 g、水1000 mL 的培養(yǎng)液中OD顯著大于其他正交試驗，表明最適宜菌株264ZY7 生長為牛肉膏3 g、蔗糖25 g、NaCl 5 g、酵母膏5 g、水1000 mL。

表2 正交試驗優(yōu)化結(jié)果

2.4 搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1 最適pH 值篩選 由圖11 可知，菌株264ZY7 在pH 6 時生長最快，且顯著大于其他pH值下的OD，表明菌株264ZY7 生長的最適pH 值為6。

圖11 pH 對菌株264ZY7 生長的影響

2.4.2 最適溫度篩選 由圖12 可知，菌株264ZY7在溫度為28 ℃時OD最大，且顯著大于其他溫度下OD值，表明適宜菌株264ZY7 生長的最適溫度為28 ℃。

圖12 溫度對菌株264ZY7 生長的影響

2.4.3 最佳接種量篩選 由圖13 可知，菌株264ZY7 接種量為1%時OD最大，且顯著高于其他接種量條件下的OD，表明該菌株生長最適的接種量為1%。

圖13 接種量對菌株264ZY7 生長的影響

2.4.4 最佳裝液量篩選 由圖14 可知，菌株264ZY7 的裝液量為40 mL·150 mL時OD顯著高于其他裝液量條件，即最佳裝液量為40 mL·150 mL。

圖14 裝液量對菌株264ZY7 生長的影響

2.4.5 最佳轉(zhuǎn)速篩選 由圖15 可知，菌株264ZY7在搖床轉(zhuǎn)速為240 r·min時OD達(dá)到最大，且顯著高于其他轉(zhuǎn)速時的生物量，表明該菌株生長最適的搖床轉(zhuǎn)速為240 r·min。

圖15 搖床轉(zhuǎn)速對菌株264ZY7 生長的影響

2.4.6 100 L 發(fā)酵罐放罐時間確定 由圖16 可知，在最佳搖瓶發(fā)酵條件下對菌株264ZY7 進(jìn)行100 L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，菌株264ZY7 在21 h 時OD極顯著高于其他時間，表明菌株264ZY7 的發(fā)酵罐最佳放罐時間為21 h。

圖16 發(fā)酵時間對菌株264ZY7 生長的影響

3 討論與結(jié)論

高寒草甸內(nèi)生細(xì)菌因其特殊的生境條件及抗逆性強(qiáng)等特點，是開發(fā)生防制劑的首選。王玉琴等從東祁連山高寒牧草中分離出內(nèi)生細(xì)菌265ZY4 可有效抑制多種病原菌的生長，并且有固氮、溶磷和分泌IAA 等多種生物學(xué)功能。郭海等報道了高寒草地矮生嵩草內(nèi)生細(xì)菌262AG6 對馬鈴薯炭疽病的抑制效果達(dá)到81.33%。筆者試驗測定了菌株264ZY7 的固氮、溶磷、產(chǎn)IAA 能力及最低、最高、致死、最適生長溫度、pH 和生長曲線。結(jié)果表明，菌株264ZY7 具有穩(wěn)定的固氮和產(chǎn)IAA 能力，最高生長溫度55 ℃、最低生長溫度2 ℃、致死溫度110 ℃、最適溫度30～36 ℃，最適pH 值5～7。致死溫度110 ℃，比楊冬靜等報道的解淀粉芽孢桿菌的致死溫度（100 ℃）高，表明菌株264ZY7 更耐受加工制備成生防制劑過程中的高溫等條件；與張娟等報道的解淀粉芽孢桿菌pH 為中性的結(jié)論基本一致。生長曲線表明，在5 h 進(jìn)入對數(shù)生長期，在10～14 h 時進(jìn)入穩(wěn)定生長期，與王卉等報道的解淀粉芽孢桿菌L-S60 在10 h 進(jìn)入對數(shù)生長期、在20 h 時進(jìn)入穩(wěn)定生長期的結(jié)果相比培養(yǎng)時間極度縮短，表明菌株264ZY7 能在較短的時間內(nèi)培養(yǎng)出高密度的生物量，在病害防治中所需時間縮短，能方便快捷的運(yùn)用于生產(chǎn)中。

對生防內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵條件優(yōu)化有利于菌株的培養(yǎng)和用于生產(chǎn)中。馮中紅等對抗馬鈴薯壞疽病的莫海威芽孢桿菌ZA1 培養(yǎng)條件的優(yōu)化得到最佳培養(yǎng)基配比氯化銨14.25 g、玉米粉19 g、馬鈴薯237 g、水1000 mL，最佳發(fā)酵條件pH 7.7、培養(yǎng)溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速180 r·min及發(fā)酵時間36 h，ZA1 優(yōu)化后活菌數(shù)為4.12×10CFU·mL。本試驗中菌株264ZY7 對多種病原真菌和番茄丁香假單胞葉斑病菌都有較強(qiáng)的抑制效果，為了使其較快的進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)并應(yīng)用到田間地頭，試驗通過單因素和正交設(shè)計試驗優(yōu)化了其發(fā)酵工藝。結(jié)果表明，菌株264ZY7 的最優(yōu)培養(yǎng)基配比及生長條件為：牛肉膏3 g，蔗糖25 g，NaCl 5 g，酵母膏5 g，水1000 mL；溫度為28 ℃；接種量為1%；裝液量為40 mL·150 mL；搖床轉(zhuǎn)速為240 r·min；pH 6；100 L 發(fā)酵罐放罐時間為21 h。與劉京蘭報道的內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌優(yōu)化后的發(fā)酵條件為pH 6，發(fā)酵溫度28 ℃等的結(jié)論接近，最佳接菌量比7%少。與李鑫等報道的解淀粉芽孢桿菌HRH-317 優(yōu)化后的發(fā)酵條件pH 7，最佳接菌量3.8%、最佳時間21 h，最適溫度37 ℃相比，最佳接種量少，最適溫度低于李鑫等報道的解淀粉芽孢桿菌HRH-317 的最適溫度且更近于常溫，比梁艷瓊等和洪鵬等報道的解淀粉芽孢桿菌的最佳接種時間48 h 短，表明本試驗中的生防菌能在較低要求的培養(yǎng)條件下獲得較多的有益產(chǎn)物，且此差異的出現(xiàn)也可能由菌株的來源不同所致。經(jīng)過發(fā)酵工藝的優(yōu)化，菌株264ZY7 的生物量顯著高于優(yōu)化前（發(fā)酵前最高的OD1.69，發(fā)酵后的OD10.37），該結(jié)論為菌株264ZY7 進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。但菌株264ZY7 的抑菌物質(zhì)及在番茄根、莖、葉內(nèi)的定殖動態(tài)尚不明確，此還有待于進(jìn)一步研究探討。

內(nèi)生拮抗細(xì)菌264ZY7 具有穩(wěn)定的固氮和產(chǎn)IAA 能力，在牛肉膏3 g、蔗糖25 g、NaCl 5 g 和酵母膏5 g，水補(bǔ)足至1000 mL 和pH 6 的培養(yǎng)基中，于28 ℃、接種量1%、裝液量40 mL·150 mL和轉(zhuǎn)速240 r·min條件下發(fā)酵21 h 的OD達(dá)10.37。該研究結(jié)果為利用內(nèi)生拮抗細(xì)菌264ZY7 開發(fā)生防制劑奠定了基礎(chǔ)。