西州密25 號(hào)哈密瓜葉片再生體系建立

劉麗鋒，古勤生，周建華

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所 鄭州 450009； 2.鄭州市蔬菜研究所 鄭州 450015）

西州密25 號(hào)是新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究中心廖新福研究員團(tuán)隊(duì)于2007 年選育的哈密瓜類型甜瓜品種，由于富含多種維生素，色澤鮮艷，口感鮮甜，營(yíng)養(yǎng)豐富，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，因此深受消費(fèi)者喜愛。但山高水遠(yuǎn)，內(nèi)地消費(fèi)者很難吃到新鮮的哈密瓜，為打破地域限制，研究人員對(duì)哈密瓜“東移”“南移”開展研究，除新疆外，甘肅、陜西、安徽、內(nèi)蒙古、山東、云南、廣東、廣西、海南等地區(qū)開始大面積引種種植。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所西瓜甜瓜病蟲害防控課題組于2011 年引種在河南省進(jìn)行示范推廣種植，目前在河南省年均推廣面積高達(dá)67 hm，并呈逐年增加的趨勢(shì)。隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)果蔬品質(zhì)的要求逐漸提升，為了滿足消費(fèi)者對(duì)高品質(zhì)哈密瓜的需求，通過人工輔助選擇篩選高品質(zhì)的哈密瓜實(shí)現(xiàn)定向育種是目前遺傳育種的熱點(diǎn)。哈密瓜離體培養(yǎng)是哈密瓜品種改良、遺傳轉(zhuǎn)化的前提條件。其中，再生能力是關(guān)鍵因素，再生能力的差異除了基因型影響外，外植體類型不同導(dǎo)致的再生能力也不同。目前，甜瓜主要以子葉為外植體再生形成完整植株的途徑較多，但利用葉片作為外植體獲得再生植株途徑的文獻(xiàn)報(bào)道較少。不同類型外植體對(duì)甜瓜再生植株的倍性會(huì)產(chǎn)生影響，有研究表明甜瓜子葉誘導(dǎo)叢生芽的途徑容易發(fā)生倍性變化，而甜瓜經(jīng)葉片途徑誘導(dǎo)會(huì)獲得大量二倍體植株，降低倍性干擾概率。西州密25 在河南省表現(xiàn)品質(zhì)穩(wěn)定，容易坐果，抗病性強(qiáng)，利用葉片誘導(dǎo)叢生芽獲得再生植株，避免倍性干擾，是實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因甜瓜的主要條件。筆者以西州密25 號(hào)葉片作為外植體，設(shè)計(jì)不同的激素組合、暗培養(yǎng)時(shí)間等條件，對(duì)組培苗哈密瓜葉片和溫室栽培的哈密瓜葉片誘導(dǎo)叢生芽；設(shè)計(jì)不同激素濃度對(duì)伸長(zhǎng)苗誘導(dǎo)生根，以期建立一套高效的哈密瓜葉片再生體系，為哈密瓜轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

試驗(yàn)于2019 年3 月至2020 年10 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所果樹瓜類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、西瓜甜瓜病蟲害防控課題組玻璃溫室進(jìn)行。

1.2 材料

供試材料為哈密瓜西州密25 號(hào)種子，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所西瓜甜瓜病蟲害防控課題組提供。

1.3 方法

1.3.1 無菌苗培養(yǎng) 西州密25 號(hào)成熟種子剝?nèi)ネ鈿ず螅?0%酒精消毒30 s，0.1%氯化汞加2 滴Tween-20 殺菌10 min。無菌水沖洗5 次后，浸泡在無菌水中過夜，第2 天播種到1/2 MS+10 g·L蔗糖培養(yǎng)基上，置于組織培養(yǎng)室正常光周期培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)（光照16 h，黑暗8 h，溫度25℃，如無特別說明，無菌苗都在此環(huán)境中生長(zhǎng)），待長(zhǎng)出2～3 片真葉時(shí)，作為外植體使用。

1.3.2 溫室苗培養(yǎng) 西州密25 號(hào)成熟種子在水中浸泡3 h，然后用紗布包住，放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱，2～3 d 后胚根伸出，播入光照充足的玻璃溫室（晝28 ℃/夜20 ℃）的花盆中，待長(zhǎng)出2～3 片真葉時(shí)，采回實(shí)驗(yàn)室，在自來水下沖洗2 h，然后用70%酒精消毒30 s，0.1%氯化汞加2 滴Tween-20 殺菌5 min。無菌水沖洗5 次后作為外植體。

1.3.3 叢生芽誘導(dǎo) 將上述2 種處理的葉片作為外植體，切掉葉片四周邊緣，然后再將葉片切成5 mm×5 mm 的方塊接種到12 種叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（表1）誘導(dǎo)叢生芽；將無菌苗葉片接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2.0 mg·LBA+0.2 mg·LIAA，分別暗培養(yǎng)0、3、6、9、12、15 d，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)室光下培養(yǎng)，每處理3 次重復(fù)，每次重復(fù)9 個(gè)葉片，30 d 后觀察叢生芽生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)叢生芽誘導(dǎo)率。

表1 12 種誘導(dǎo)叢生芽分化的培養(yǎng)基組合

1.3.4 生根培養(yǎng)基 當(dāng)不定芽伸長(zhǎng)至2～3 cm 時(shí)，從基部切下轉(zhuǎn)接到以下8 種不同的生根培養(yǎng)基R1～R8，即1/2MS+（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0）mg·LIBA 誘導(dǎo)生根，每處理3 次重復(fù)，每次重復(fù)9 個(gè)伸長(zhǎng)苗，30 d 觀察生根數(shù)、根長(zhǎng)以及根系生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)。

愈傷組織誘導(dǎo)率/%=形成愈傷組織的葉片數(shù)/接種葉片數(shù)×100；

叢生芽誘導(dǎo)率/%=形成叢生芽的葉片數(shù)/接種葉片數(shù)×100。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS Stastistic 22 軟件進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素濃度對(duì)西州密25 號(hào)葉片誘導(dǎo)叢生芽的影響

由表2 可以看出，將2 種類型的葉片接種到不同濃度激素的12 種培養(yǎng)基上，葉片愈傷組織誘導(dǎo)率和叢生芽誘導(dǎo)率均有一定差異。在無菌條件下生長(zhǎng)10 d 的無菌苗幼嫩葉片，在不同的培養(yǎng)基上均可以誘導(dǎo)愈傷組織，MS6、MS9、MS11 三種培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織相對(duì)較高，分別達(dá)92.6%、96.3%、92.6%；叢生芽誘導(dǎo)率相對(duì)較高的是MS4、MS5、MS11 培養(yǎng)基，均為14.8%，MS2、MS6、MS7、MS10和MS12 等5 種培養(yǎng)基均未誘導(dǎo)出叢生芽；在這2種激素組合情況下，無菌苗葉片雖然能夠誘導(dǎo)叢生芽，但是誘導(dǎo)率很低。而溫室培養(yǎng)的葉片，愈傷組織誘導(dǎo)率在MS3、MS5、MS6、MS9、MS11 和MS12等6 種培養(yǎng)基中都可達(dá)100%，MS1 愈傷組織誘導(dǎo)率最低，為85.2%；不同的培養(yǎng)基均可以誘導(dǎo)叢生芽，MS11 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的叢生芽再生率高達(dá)85.2%，MS1 培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽效率最低，達(dá)25.9%，均高于無菌苗葉片誘導(dǎo)叢生芽的效率。結(jié)合無菌苗葉片和溫室葉片誘導(dǎo)叢生芽的情況，MS11相對(duì)其他培養(yǎng)基效果最好。

表2 激素濃度對(duì)甜瓜葉片誘導(dǎo)叢生芽的影響

2.2 暗培養(yǎng)對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響

由表3 可以看出，葉片在正常光周期培養(yǎng)條件下，即暗培養(yǎng)0 d，將葉片直接切下接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基3～4 d 后，葉片膨大，15 d 左右切口處出現(xiàn)愈傷組織，30 d 時(shí)綠色愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)48.1%，此時(shí)叢生芽在綠色愈傷組織部位萌發(fā)，陸續(xù)出現(xiàn)芽點(diǎn)，叢生芽誘導(dǎo)率可達(dá)37.0%；暗培養(yǎng)12 d，30 d 時(shí)綠色愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)37%，叢生芽誘導(dǎo)率達(dá)66.7%；暗培養(yǎng)15 d，30 d 時(shí)綠色愈傷組織誘導(dǎo)率為11%，叢生芽誘導(dǎo)率達(dá)48.2%。暗培養(yǎng)12 d 叢生芽誘導(dǎo)率達(dá)最高，為66.7%。其他時(shí)間叢生芽誘導(dǎo)率沒有顯著差異。光照對(duì)西州密25 號(hào)葉片產(chǎn)生愈傷組織和叢生芽的誘導(dǎo)影響較大。經(jīng)過0～15 d 不同時(shí)間的暗培養(yǎng)，葉片均可以誘導(dǎo)愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率為100%。經(jīng)過暗培養(yǎng)的葉片，從暗處剛轉(zhuǎn)移到正常光周期培養(yǎng)條件下，葉片為淺黃色、愈傷組織均為白色，經(jīng)過1～2 d，葉片很快轉(zhuǎn)為綠色，愈傷組織呈現(xiàn)白色、淺黃色，30 d 后愈傷組織有的仍然呈現(xiàn)白色疏松狀，這種類型的愈傷組織只會(huì)膨大，不能誘導(dǎo)出叢生芽（圖1 白色箭頭指示）；有的呈現(xiàn)綠色緊致狀，逐漸分化出綠色芽點(diǎn)，誘導(dǎo)形成叢生芽（圖1 紅色箭頭指示，圖2 顯微鏡下綠色致密愈傷組織誘導(dǎo)生成叢生芽狀態(tài)）。

表3 暗培養(yǎng)對(duì)甜瓜葉片誘導(dǎo)叢生芽的影響

圖1 兩種類型愈傷組織及叢生芽

圖2 顯微鏡下綠色愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽

2.3 不同IBA濃度對(duì)生根的影響

西州密25 號(hào)葉片誘導(dǎo)獲得的叢生芽在MS+0.5 mg·LBA 培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，當(dāng)不定芽伸長(zhǎng)到2 cm 時(shí)，切下轉(zhuǎn)移到8 種生根培養(yǎng)基，7 d 后出現(xiàn)不定根，15 d 左右長(zhǎng)成完整植株。由表4 可以看出，8種生根培養(yǎng)基均可以誘導(dǎo)不定芽生根，說明西州密25 生根容易，IBA 質(zhì)量濃度為0.5～4.0 mg·L均可以誘導(dǎo)生根，在R2、R3、R6、R7、R8 等5 種培養(yǎng)基中生根率均可達(dá)到100%，在R1 培養(yǎng)基中生根率較低，也可以達(dá)到71.4%。結(jié)合根的數(shù)量和主根長(zhǎng)度，R2 生根培養(yǎng)基優(yōu)于其他培養(yǎng)基。

表4 不同IBA 濃度對(duì)生根的影響

3 討論與結(jié)論

外植體的選擇對(duì)于組織培養(yǎng)再生體系的建立至關(guān)重要，甜瓜子葉誘導(dǎo)叢生芽效率最高，是首選的外植體。葉片可以通過繼代培養(yǎng)組培苗以及大田、溫室種植的植株被源源不斷地提供，再生不容易產(chǎn)生倍性變化，尤其對(duì)于稀有甜瓜品種，利用葉片作為外植體意義重大。王福蘭等利用甘甜一號(hào)無菌苗葉片誘導(dǎo)不定芽，再生率達(dá)到91%；馮鳳娟等利用西甜一號(hào)繼代3 周的2～3 片新梢葉片誘導(dǎo)不定芽，再生率最高可達(dá)91%；GUIS 等采用生長(zhǎng)10 d 的法國(guó)當(dāng)?shù)仄贩N無菌苗葉片誘導(dǎo)不定芽，再生率達(dá)72%；Kintzios 等利用溫室生長(zhǎng)的Galia 第1片真葉誘導(dǎo)不定芽，再生率達(dá)60%。Yadav 等利用Hale’s Best Jumbo 組培苗葉片和溫室生長(zhǎng)的葉片誘導(dǎo)不定芽，再生率分別為8%和80%以上。

筆者采用組培苗葉片和溫室生長(zhǎng)的甜瓜葉片誘導(dǎo)不定芽，繼代生長(zhǎng)10 d 的無菌組培苗幼嫩葉片，在培養(yǎng)基MS+2.0 mg·LBA+0.2 mg·LIAA 中誘導(dǎo)叢生芽效率相對(duì)較高，達(dá)14.8%；溫室培養(yǎng)的植株葉片在MS+2.0 mg·LBA+0.2 mg·LIAA 培養(yǎng)基中的叢生芽誘導(dǎo)率高達(dá)85.2%。結(jié)果與Yadav等的試驗(yàn)結(jié)果相似，溫室生長(zhǎng)的葉片再生率遠(yuǎn)高于無菌苗誘導(dǎo)叢生芽的再生率，原因可能與光照、溫度等外在培養(yǎng)環(huán)境條件，以及甜瓜植株生長(zhǎng)形態(tài)、基因型、葉片年齡等都有關(guān)系，繼代培養(yǎng)的甜瓜葉片生理和生化都產(chǎn)生了變化，器官發(fā)生能力下降，再生率也會(huì)降低。

暗培養(yǎng)對(duì)很多植物再生是必需條件。已有研究表明，黑暗條件可以減少植物酚類物質(zhì)的溢出，有利于不定芽的分化。也有研究指出，黑暗條件會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)生長(zhǎng)素增多，促進(jìn)愈傷組織的形成，不利于不定芽的分化。馮鳳娟等試驗(yàn)結(jié)果表明，直接轉(zhuǎn)入正常光周期比經(jīng)過暗培養(yǎng)有利于不定芽的再生。本試驗(yàn)結(jié)果表明，暗培養(yǎng)一定時(shí)間有助于甜瓜葉片誘導(dǎo)叢生芽，暗培養(yǎng)12 d，叢生芽的誘導(dǎo)率最高，可以達(dá)到66.7%。結(jié)論不同的主要原因可能是基因型、外植體類型、激素種類及濃度等不同。暗培養(yǎng)的作用機(jī)制復(fù)雜，其對(duì)外植體再生芽的誘導(dǎo)機(jī)制需進(jìn)一步研究。

甜瓜生根相對(duì)容易，添加不同濃度的IAA、IBA誘導(dǎo)甜瓜生根率達(dá)70%以上。本試驗(yàn)結(jié)果表明，1/2 MS 培養(yǎng)基中添加0.5～4.0 mg·LIBA 均可誘導(dǎo)生根，在培養(yǎng)基1/2 MS+1.0 mg·LIBA 中，生根效果最好，平均根數(shù)達(dá)到7.7，主根長(zhǎng)達(dá)到9.6 cm，生根率達(dá)到100%。

甜瓜基因型不同、外植體來源不同、激素條件不同，均會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不完全一致，但是可以利用葉片誘導(dǎo)獲得叢生芽，本試驗(yàn)為以后科研工作者利用甜瓜葉片誘導(dǎo)叢生芽提供了參考依據(jù)。