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    耐鹽溶磷菌YJC19的鑒定及不同培養(yǎng)條件對(duì)其溶磷效果的影響

    2022-06-09 04:41:53譚海霞李麗艷王連龍彭紅麗杜迎輝孫杉杉
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年9期
    關(guān)鍵詞:相關(guān)性分析黑曲霉

    譚海霞 李麗艷 王連龍 彭紅麗 杜迎輝 孫杉杉

    摘要:對(duì)前期從鹽堿土壤中篩選到的1株溶磷菌株YJC19進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,探討分析菌株的耐鹽特性及不同培養(yǎng)條件對(duì)其溶磷能力的影響,以期為其在鹽堿地改良中的應(yīng)用提供理論參考,為進(jìn)一步開發(fā)耐鹽溶磷微生物菌肥提供種質(zhì)資源。通過(guò)形態(tài)觀察和系統(tǒng)發(fā)育樹分析對(duì)溶磷菌株進(jìn)行鑒定,通過(guò)不同鹽濃度PDA培養(yǎng)基對(duì)菌株生長(zhǎng)影響判斷其耐鹽特性,采用鉬銻抗比色法測(cè)定菌株YJC19在不同磷源[Ca 3(PO 4) 2、AlPO 4、FePO 4]、鹽濃度(0、2.5%、5.5%、7.5%)、初始pH值(5.5、6.5、7.5、8.5)液體培養(yǎng)條件下的溶磷量。結(jié)果表明,菌株YJC19鑒定為黑曲霉(Aspergillus niger),可耐受鹽濃度高達(dá)15.0%,在鹽濃度為0~7.5%培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。菌株YJC19具有較強(qiáng)的溶磷能力,對(duì)磷酸鈣的溶解能力遠(yuǎn)大于磷酸鋁和磷酸鐵,溶磷量為1 741.59 mg/L;隨著鹽濃度的提高,菌株YJC19溶磷能力降低,2.5%鹽濃度處理組的溶磷量與無(wú)鹽對(duì)照組差異不顯著。菌株YJC19在pH值5.5~8.5范圍內(nèi)均可正常生長(zhǎng),初始pH值為6.5時(shí)其溶磷量最高。不同環(huán)境條件的無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)中,溶磷量與pH值均呈顯著負(fù)相關(guān),初步判斷菌株YJC19溶磷機(jī)制為酸溶磷。菌株YJC19是1株耐鹽堿性較強(qiáng)的高效溶磷真菌,為其應(yīng)用于鹽堿土改良提供了保證,可為北方鹽堿土壤修復(fù)改良提供優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源,具有良好的開發(fā)與應(yīng)用潛力。

    關(guān)鍵詞:黑曲霉;耐鹽溶磷菌;溶磷能力;培養(yǎng)條件;相關(guān)性分析

    中圖分類號(hào):X171.4 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2022)09-0235-05

    在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,磷肥施入土壤,約有80%的磷被土壤中鋁、鐵、鈣等陽(yáng)離子吸附固定,導(dǎo)致土壤中有效磷含量較低,磷已成為影響植物產(chǎn)量的養(yǎng)分限制因素之一[1]。化肥過(guò)量施用不利于農(nóng)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展,研究表明,溶磷微生物可以活化土壤中的不溶性磷,進(jìn)而促進(jìn)植物生長(zhǎng),利用微生物提高土壤中磷的利用率已成為目前研究的熱點(diǎn)[2-3]。目前已報(bào)道的多數(shù)溶磷菌都不耐鹽堿,在高鹽堿環(huán)境中溶磷能力有限,不適合在鹽堿地施用。鹽堿地的改良修復(fù)是亟需解決的問題,利用微生物改良鹽堿土壤既節(jié)本增效,又可促進(jìn)農(nóng)業(yè)環(huán)境生態(tài)健康發(fā)展。本試驗(yàn)從河北濱海鹽生植物根際土壤中篩選獲得了1株高效溶磷耐鹽真菌,對(duì)其耐鹽能力及在不同培養(yǎng)環(huán)境溶磷特性進(jìn)行初步分析,以期豐富鹽堿地改良菌種資源庫(kù),為在鹽堿地實(shí)際應(yīng)用中提高鹽漬土不溶性磷的利用效率提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試菌株

    試驗(yàn)于2021年3—5月在河北省農(nóng)業(yè)生態(tài)安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。試驗(yàn)菌株:解磷真菌YJC19(由領(lǐng)先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司微生物實(shí)驗(yàn)室從曹妃甸鹽地堿蓬根際土壤中篩選分離得到)。

    1.2 培養(yǎng)基

    含鹽PDA培養(yǎng)基:以馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基[4]為基礎(chǔ),分別添加0、2.5%、5.5%、7.5%、10.0%、15.0% NaCl。

    含鹽無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基:在解磷液體培養(yǎng)基[5]的基礎(chǔ)上添加2.5%、5.5%、7.5% NaCl。

    1.3 溶磷菌的鑒定

    1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 參照文獻(xiàn)[6-7],對(duì)溶磷菌株 YJC19的菌落和分生孢子進(jìn)行觀察及鑒定。

    1.3.2 菌株分子鑒定 參考文獻(xiàn)[8]對(duì)溶磷菌株 YJC19進(jìn)行基因組DNA提取并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。將測(cè)序得到的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列在 NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中使用BLAST比對(duì)后,使用MEGA 6.0軟件Clus-tral W 進(jìn)行聚類分析,以 Neighbour-Joining 法構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)合形態(tài)鑒定,確定各菌株的親緣關(guān)系及分類地位。

    1.4 溶磷菌株YJC19耐鹽能力探究

    參考文獻(xiàn)[9]測(cè)定菌株YJC19的耐鹽能力,用接種環(huán)挑取菌株YJC19的菌絲1環(huán)于含鹽PDA固體培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)7 d,觀察菌株生長(zhǎng)情況。

    1.5 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株YJC19溶磷能力的影響

    分別改變?cè)袩o(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基中磷源[Ca 3(PO 4) 2、AlPO 4、FePO 4]、鹽濃度(2.5%、5.5%、7.5%)、初始pH值(5.5、6.5、7.5、8.5)等,在 100 mL 無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中接種108 CFU/mL菌株YJC19孢子懸液1 mL,28 ℃、180 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng) 5 d[10],每隔24 h取2 mL發(fā)酵液,測(cè)定上清液中有效磷的含量和pH值,以不接菌種處理為對(duì)照。

    1.6 數(shù)據(jù)分析

    采用Excel 2010、SPSS 25、Origin 8.0和MEGA 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 溶磷菌株YJC19分類學(xué)鑒定

    2.1.1 形態(tài)學(xué)特征 菌株YJC19的菌落顏色先呈黃白后變黑。分生孢子梗長(zhǎng)度不同,分生孢子頭呈放射狀,黑褐色,分生孢子呈褐色,球形。將純化的菌株YJC19接種到無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基中,觀察菌株的溶磷效果,如圖1所示,培養(yǎng)5 d后,菌株YJC19周圍的Ca 3(PO 4) 2已經(jīng)明顯被溶解并形成了透明的溶磷圈。

    2.1.2 菌株分子鑒定 利用ITS通用引物ITS1和ITS4有效擴(kuò)增出603 bp的片段。測(cè)序結(jié)果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov上進(jìn)行比較。利用BLAST軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,利用Neighbour-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖2可以看出,菌株YJC19與已報(bào)道的黑曲霉(Aspergillus niger)在分類學(xué)生態(tài)學(xué)中親緣關(guān)系最密切,同源性較高。結(jié)合形態(tài)分析鑒定菌株YJC19為黑曲霉(A. niger) YJC19。

    2.2 溶磷菌株YJC19的耐鹽能力

    培養(yǎng)7 d后,與對(duì)照組(無(wú)鹽培養(yǎng)基)相比,鹽含量為15.0%的培養(yǎng)基中,菌株YJC19有被抑制的趨勢(shì),長(zhǎng)勢(shì)較弱;鹽含量為10.0%時(shí),菌株可生長(zhǎng)。可見,菌株YJC19可耐受高達(dá)15.0%的NaCl(表1)。目前研究的耐鹽解磷菌主要為江紅梅等篩選得到的草酸青霉M2,最高可耐受7%的鹽濃度[4];范延輝等篩選的草酸青霉PSF2最高可耐受鹽濃度閾值為12.5%[11];而本研究中菌株YJC19可耐受高達(dá)15.0%的鹽濃度。菌株YJC19生長(zhǎng)能力隨鹽脅迫的增加而降低,其原因可能是高鹽濃度下細(xì)胞內(nèi)Na+濃度較低,以此來(lái)免受毒害[12],大量的能量用來(lái)調(diào)整自身的代謝途徑以及適應(yīng)環(huán)境,用于生長(zhǎng)繁殖的能量相對(duì)減少,所以自身生長(zhǎng)受到影響。

    2.3 不同培養(yǎng)條件對(duì)其溶磷效果的影響

    2.3.1 不同磷源對(duì)菌株YJC19溶磷能力的影響 由圖3可知,菌株YJC19對(duì)3種磷酸鹽的溶解能力總體表現(xiàn)為Ca 3(PO 4) 2>FePO 4>AlPO 4。培養(yǎng) 144 h,3種磷化合物培養(yǎng)液中有效磷含量均呈先升后降再趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。以Ca 3(PO 4)為磷源時(shí),培養(yǎng)液中有效磷含量在48~72 h內(nèi)快速增加,96 h時(shí)達(dá)到峰值(1 741.59 mg/L),此后平緩減少,同一培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)它的有效磷含量顯著高于其他2種磷源。磷源為AlPO 4時(shí),在72 h時(shí)有效磷含量最高(403.33 mg/L);磷源為FePO 4時(shí),在96 h時(shí)有效磷含量最高(693.75 mg/L)。

    2.3.2 不同NaCl濃度對(duì)菌株YJC19溶磷能力的影響 在不同鹽濃度的無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中,菌株YJC19對(duì)磷酸三鈣的溶解能力存在顯著差異(P<0.05),總體表現(xiàn)為隨著鹽濃度的提高,菌株YJC19的溶磷能力降低。鹽濃度為2.5%時(shí),菌株YJC19溶磷能力僅次于對(duì)照組;鹽濃度為7.5%時(shí),溶磷能力最差。144 h培養(yǎng)期間,菌株YJC19對(duì)磷酸鈣的溶磷量變化如圖4所示,不同鹽濃度對(duì)菌株YJC19溶磷能力的影響基本表現(xiàn)一致,溶磷量達(dá)到峰值的培養(yǎng)時(shí)間不同,鹽濃度為2.5%和5.0%時(shí)溶磷量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸提高而后下降。鹽濃度為2.5%時(shí),前120 h溶磷量逐漸增加,120 h時(shí)達(dá)到峰值(1 719.48 mg/L);鹽濃度為5.0%時(shí),96 h溶磷量達(dá)到峰值(790.83 mg/L);鹽濃度為7.5%時(shí),溶磷量變化曲線呈“S”形,72 h時(shí)溶磷量達(dá)到峰值(497.08 mg/L),隨后溶磷量略有降低再升高后趨于平穩(wěn)趨勢(shì)。

    2.3.3 不同初始pH值對(duì)菌株YJC19溶磷能力的影響 如圖5顯示,菌株YJC19在pH值5.5~8.5范圍內(nèi)均可正常生長(zhǎng),但溶磷特性不同,處理組間差異極顯著(P<0.01)。各處理組溶磷量出現(xiàn)峰值的時(shí)間不同,溶磷量峰值排序?yàn)?.5>7.5> 5.5>8.5。初始pH值為6.5時(shí),溶磷量峰值達(dá)到 1 741.71 mg/L,分別比pH值為5.5、7.5、8.5處理組增加29.45%、9.38%、46.26%,表明培養(yǎng)菌株YJC19的培養(yǎng)基最適初始pH值為6.5。

    2.4 菌株YJC19溶磷能力與pH值的關(guān)系

    將菌株YJC19接種到不同環(huán)境條件的無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中,總體來(lái)看,培養(yǎng)液的 pH值在培養(yǎng)144 h內(nèi)均逐漸降低,在48~72 h迅速降低,均在120 h后逐漸平緩(圖6)。不同磷源[Ca 3(PO 4) 2、AlPO 4、FePO 4)培養(yǎng)液在144 h內(nèi)溶液pH值從7.0分別下降到2.33、3.96、3.02;不同鹽濃度(2.5%、5.5%、7.5%)培養(yǎng)液在144 h內(nèi)溶液pH值從7.0分別下降到2.65、3.56、3.98;不同初始pH值(5.5、6.5、7.5、8.5)培養(yǎng)液在144 h內(nèi)溶液pH值分別下降到2.21、2.48、2.75、3.61。培養(yǎng)液pH值變化范圍在2.0~8.5之間,在此范圍內(nèi)菌株均能正常生長(zhǎng),這表明菌株YJC19具有廣泛的酸堿適應(yīng)性。

    對(duì)溶磷量與pH值數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,不同環(huán)境的無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)液中溶磷量與pH值兩者均呈負(fù)相關(guān)(圖7)。菌株YJC19在難溶磷源[Ca 3(PO 4) 2、AlPO 4、FePO 4]培養(yǎng)液中的溶磷量與pH值的相關(guān)系數(shù)分別為-0.886 (P<0.05)、-0.815 (P<0.05)、-0.903 (P<0.05);不同鹽濃度(2.5%、5.5%、7.5%)培養(yǎng)液中的溶磷量與pH值的相關(guān)系數(shù)分別為-0.976 (P<0.01)、-0.952 (P<0.01)、-0.829 (P<0.05);不同初始pH值(5.5、6.5、7.5、8.5)培養(yǎng)液中的溶磷量與pH值的相關(guān)系數(shù)分別為-0.894 (P<0.05)、-0.812 (P<0.05)、-0.818 (P<0.05)、-0.978 (P<0.01)。這可能是因?yàn)閅JC19菌體適應(yīng)環(huán)境后,不斷產(chǎn)生釋放酸性代謝產(chǎn)物,隨著溶磷量的增加,培養(yǎng)液pH值下降,這表明將菌株YJC19作為微生物菌劑應(yīng)用于鹽堿土中,不僅能增加鹽堿土中可溶磷的含量,也可以改善鹽堿土的酸堿環(huán)境。

    3 結(jié)論與討論

    研究表明,溶磷真菌比溶磷細(xì)菌具有更高的溶磷能力[13],從高鹽環(huán)境中篩選分離得到的溶磷真菌主要局限于青霉屬(Penicillium)[14]、曲霉屬(Aspergillus)[15-16]等。本研究所用的菌株是1株從鹽地堿蓬根際土中分離得到的溶磷真菌,鑒定為黑曲霉(A. niger),命名為YJC19。

    研究表明,隨著外界環(huán)境或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化,溶磷菌的生長(zhǎng)代謝會(huì)發(fā)生變化,導(dǎo)致菌株溶磷能力有明顯差異[14,17]。在不同環(huán)境下菌株YJC19均具有溶磷能力,但溶磷效果有顯著差異,它對(duì)磷酸鈣(1 741.59 mg/L)的溶解能力顯著高于磷酸鐵(693.75 mg/L)和磷酸鋁(403.33 mg/L),這與相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)論[18-20]一致。但與劉文干等的結(jié)論[21]不一致,其從紅壤中篩選的黑曲霉菌株B1-A對(duì)磷酸鹽溶磷能力排序?yàn)锳lPO 4>Ca 3(PO 4) 2>FePO 4,這可能是由于北方鹽堿土壤中難溶磷的主要形態(tài)為磷酸鈣,強(qiáng)酸性紅壤中以磷酸鋁鐵形態(tài)存在,微生物對(duì)土壤環(huán)境表現(xiàn)出高度的生理響應(yīng)特性,進(jìn)而不同菌株的溶磷機(jī)制不同,因此篩選土著溶磷菌具有重要意義。經(jīng)過(guò)對(duì)菌株YJC19在不同NaCl濃度下的耐鹽性和溶磷能力分析得知,菌株YJC19在 0~7.5% NaCl濃度范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好,溶磷量隨著NaCl濃度的增加而減少。2.5%鹽濃度處理組與無(wú)鹽對(duì)照組無(wú)顯著性差異,說(shuō)明該菌有較強(qiáng)的耐鹽性,為其在鹽堿化土壤中的生長(zhǎng)定殖提供了基本保障,提高鹽堿地磷素利用率潛力巨大,但鹽堿化程度高的土壤中該菌的溶磷能力降低。

    pH值會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)和代謝。微生物溶解磷的方式多種多樣,一般認(rèn)為有機(jī)酸分泌是微生物溶解磷的主要途徑[1]。王呈玉等研究發(fā)現(xiàn),黑曲霉菌株An510的溶磷能力可能來(lái)自于有機(jī)酸的產(chǎn)生,發(fā)酵液中有機(jī)酸的含量和種類隨培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基質(zhì)的不同而變化[8]。劉曉芳等研究發(fā)現(xiàn),黑曲霉菌株ML4發(fā)酵液中含有多種有機(jī)酸[22]。本試驗(yàn)中菌株YJC19在初始pH值為5.5~8.5的培養(yǎng)液中均可正常生長(zhǎng),培養(yǎng)液中可溶磷含量基本表現(xiàn)為先升后降再趨于穩(wěn)定的趨勢(shì),pH 值在培養(yǎng) 7 d內(nèi)呈下降趨勢(shì),不同環(huán)境的無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)中溶磷量與pH值均呈顯著負(fù)相關(guān),因此推測(cè)菌株YJC19的溶磷能力主要源自其分泌的有機(jī)酸物質(zhì),也可能與菌株代謝有關(guān),其溶磷機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

    鹽堿地改良是急需解決的問題,微生物改良鹽堿地是一種環(huán)保、經(jīng)濟(jì)、高效的生物措施。本研究中的溶磷黑曲霉菌株YJC19兼具較強(qiáng)的耐鹽性和溶磷能力,最高溶磷量可達(dá)1 741.59 mg/L,為其應(yīng)用于鹽堿土壤改良提供了保證,具有良好的開發(fā)與應(yīng)用潛力。

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