不同藥劑對寧夏葡萄霜霉病田間藥效及對葡萄果面微生物群落的影響

楊波 姜彩鴿 宋雙 張華普 張怡

摘要：為篩選對寧夏葡萄霜霉病防治有效、環(huán)境友好型的藥劑以及明確施藥后葡萄果面微生物群落的結構，采用田間藥效試驗和Illumina高通量測序的方法，比較7種藥劑對葡萄霜霉病的田間防效及施藥后葡萄果面真菌和細菌群落組成、結構以及多樣性。結果表明，7種藥劑中47%春雷王銅對葡萄霜霉病的防治效果最好，在調查的3個時間段中，防效均在82.17%～91.56%之間，其次防效較好的是生物源農藥0.3%苦參堿，防效均在80%以上。不同藥劑處理后葡萄果面微生物的優(yōu)勢屬種主要有枝孢屬、鏈格孢屬、線黑粉酵母屬、馬賽菌屬和鞘氨醇單胞菌屬等，但各處理間微生物的豐富度、多樣性、均勻度、結構相似性存在明顯差異，微生物物種多樣性較高、分布均勻的組分別為EU組和PO組，而微生物豐度較高的組分別為PO組和BS組;基于加權UniFrac距離矩陣的主坐標分析（PCoA）發(fā)現PO組、PF組和MA組之間真菌群落結構組成相似，而細菌群落組成結構相似的組分別為KC組、EU組和CK組。通過對不同藥劑的田間防效及施藥后葡萄果面微生物群落結構和多樣性的初步研究，對微生物群落結構、種類和多樣性有了一定的了解，為防治寧夏葡萄霜霉病提供了理論依據，及揭示施藥后葡萄果面微生物多樣性，提高葡萄酒品質提供了理論支持。

關鍵詞：葡萄;葡萄霜霉病;藥劑篩選;微生物多樣性;主坐標分析

中圖分類號：S436.631.1+9 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）09-0103-08

葡萄霜霉病 （grape downy mildew）是由葡萄生單軸霜霉（Plasmopara viticola）引起的一種世界性專性寄生病害，各葡萄產區(qū)均有發(fā)生，嚴重危害葡萄產量和品質[1-2]，制約著葡萄產業(yè)高質量、可持續(xù)發(fā)展。寧夏回族自治區(qū)（簡稱寧夏）因獨特的地理位置及適宜葡萄生長的氣候特點，被公認為是我國釀酒葡萄的最佳產地[3]。隨著寧夏葡萄酒產業(yè)的欣欣發(fā)展，葡萄種植面積也在逐年增加，葡萄霜霉病作為寧夏葡萄產區(qū)最主要的病害，嚴重影響著葡萄種植業(yè)和葡萄酒釀造業(yè)[4]。目前，在葡萄霜霉病的防治中，藥劑防治是最直接有效的防治方法，但隨著化學藥劑“3R”問題的日趨嚴重，化學藥劑對環(huán)境破壞等問題凸顯，化學農藥造成的食品安全事件、農藥殘留超標事件時有發(fā)生，已經不能適應現代葡萄產業(yè)的發(fā)展、不能保證葡萄生產的正常進行，新型高效環(huán)保的殺菌劑及合理安全的用藥技術在葡萄生產中迫切需求。

葡萄霜霉病的生物防治近些年成為研究的熱點之一，已開發(fā)與篩選出一些對葡萄霜霉病有效的生物藥劑[5]。芽孢桿菌（Bacillus spp.）是國內外開發(fā)微生物源農藥的重要資源，因其低毒、低污染的特點，在生物防治中得到廣泛研究和應用[6-7]，是目前較為理想的微生物農藥，研究較多的是枯草芽孢桿菌。陳浩等研究發(fā)現枯草芽孢桿菌B-FS01在室內和田間，對葡萄霜霉病均具有優(yōu)良的防效[8]。岳憲化等報道，哈茨木霉菌可濕性粉劑對葡萄霜霉病具有較好的防效[9]。臧超群等分離的細菌菌株SY286對葡萄霜霉病有較好的防治效果，有望在葡萄霜霉病的生物防治中發(fā)揮更大作用[10]。但對寧夏葡萄產業(yè)來說，防治霜霉病的藥劑仍相對單一，且化學藥劑居多，生物藥劑防治葡萄霜霉病研究明顯不足，是制約該地區(qū)葡萄產業(yè)綠色、健康、高質量、可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。

寧夏葡萄產業(yè)多為釀酒葡萄，種植面積達到3.28萬hm2，是全國最大的釀酒葡萄集中連片種植區(qū)，年產葡萄酒1.3億瓶，出口20多個國家和地區(qū)，綜合產值達到了261億元。據報道，釀酒葡萄漿果表面微生物包括絲狀真菌、酵母菌、細菌，優(yōu)勢菌群酵母菌、乳酸菌和醋酸菌是葡萄酒風味物質形成的關鍵菌群[11-12]。但由于種植模式、葡萄品種、殺菌劑、溫濕度等的顯著差異，導致微生物（尤其土著菌群）種類和數量有明顯差異[13]。近年來，國外相關學者在天然土著菌群對葡萄酒風味品質影響方面做了大量的研究工作，相關研究成果充分表征了土著菌群在釀酒過程中起到的關鍵作用及對香氣物質富集與酒品整體風味呈現的影響力[14]。殺菌劑作為影響葡萄果面微生物群落的關鍵因子，Cˇade等研究表明，殺菌劑的使用使釀酒葡萄在成熟過程中土著菌群種類和群體數量大幅減少，不使用殺菌劑的釀酒葡萄表面優(yōu)勢菌群為假絲酵母屬（Candida）、德巴利（氏）酵母（Debaryomyces）、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniasporauvarum）[15]。因此，掌握和了解施用生物殺菌劑后葡萄果面微生物的多樣性，對葡萄霜霉病的防治以及葡萄酒的品質都具有重要意義。

本研究通過田間藥效試驗，比較7種生物源殺菌劑對葡萄霜霉病的田間防治效果，以期為寧夏地區(qū)防治葡萄霜霉病篩選出防效較好的生物殺菌劑，解決化學藥劑污染等問題。以及分析施用不同生物菌劑后葡萄果面真菌、細菌的群落組成、結構以及多樣性，旨在為研究使用不同殺菌劑防治葡萄霜霉病對釀酒品質的影響提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗共選擇6種植物源、微生物源農藥及1種環(huán)境友好型高效肥料為試驗研究對象，藥劑分別為1 000億個孢子/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，山東省乳山韓威生物科技有限公司生產;5%多抗霉素水劑，山東省乳山韓威生物科技有限公司生產;0.3%苦參堿水劑，北京三浦百草綠色植物制劑有限公司生產;47%春雷王銅可濕性粉劑，山東省乳山韓威生物科技有限公司生產;0.3%丁子香酚可溶液劑，南通神雨綠色藥業(yè)有限公司生產;3億CFU/g哈茨木霉可濕性粉劑，美國拜沃生物技術有限公司生產;亞磷酸鉀，寧夏榮和綠色科技有限公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間藥效試驗 試驗于2020年7月進行，試驗地點位于寧夏回族自治區(qū)寧夏農墾玉泉營農場葡萄園內，該地為霜霉病常年發(fā)病區(qū)，風沙土壤，在病害發(fā)病前期進行藥劑防治試驗。

1.2.2 試驗設計及調查方法 試驗設8個處理，分別為1 000億個孢子/g枯草芽孢桿菌（BS）、5%多抗霉素（PD）、0.3%苦參堿（MA）、47%春雷王銅（KC）、0.3%丁子香酚（EU）、3億CFU/g哈茨木霉（TR）、亞磷酸鉀（PF）處理，以清水作對照（CK）。每個處理30棵葡萄樹，每10棵樹為1個小區(qū)，每個處理重復3次，共24個小區(qū)，隨機區(qū)組排列。

于葡萄霜霉病發(fā)病前第1次施藥，施藥方式為噴霧，用電動噴霧器分別將7種藥劑及清水均勻噴施到葡萄葉片的正反面，以藥液不下淌為止，施藥前進行葡萄霜霉病病害等級調查，后期再噴施2次，每隔7 d噴1次，共噴3次。第3次藥后14、21、28 d進行調查，每株樹調查10張葉片，采用9 級分級法調查發(fā)病情況，葡萄霜霉病葉片分級標準：0 級，無病斑;1級，病斑面積占整個葉片面積的5%及以下;3級，病斑面積占整個葉片面積的6%～25%;5級，病斑面積占整個葉片面積的26%～50%;7級，病斑面積占整個葉片面積的51%～75%;9級，病斑面積占整個葉片面積的76%及以上。計算病情指數，求出防效，并對各小區(qū)的防效進行方差分析，用最小顯著極差法（LSR法）進行多重比較。公式[16]如下。

病情指數=∑（各級發(fā)病葉片數×相應發(fā)病級數）/（調查總葉片數×9）×100;

防治效果=[1-（噴藥前空白區(qū)病情指數×噴藥后處理區(qū)病情指數）/（噴藥后空白區(qū)病情指數×噴藥前處理區(qū)病情指數）]× 100%。

1.2.3 樣品采集及處理 葡萄果實采收前采集各處理小區(qū)葡萄2～3串，進行保鮮處理后送至天津諾禾致源生物信息科技有限公司進行16S 擴增子測序，送樣編號如表1所示。

1.2.4 基因組DNA的提取 采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取總基因組DNA。DNA在1%瓊脂糖凝膠上檢測其濃度和純度。根據濃度，使用無菌水將DNA稀釋至 1 ng/μL。

1.2.5 細菌16Sr RNA、真菌內源轉錄間隔區(qū)（ITS）區(qū)域的擴增測序 取適量的樣本 DNA 于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至 1 ng/μL，以稀釋后的基因組DNA為模板，根據測序區(qū)域18S V3-V4 選擇特異引物 341F （5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′）與806R （5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′），真菌ITS1區(qū)域采用真菌特異引物ITS 1F（5′-CTTGGTCATTTAGACGAAGTAA-3′）和ITS 2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）進行PCR 擴增 。PCR擴增程序：98 ℃預變性1 min;98 ℃變性30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，反應30個循環(huán);72 ℃延伸 5 min。-20 ℃保存。

PCR產物使用 2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測后使用 GeneJET 試劑盒純化回收目標條帶。使用TruSeqDNA PCR免費樣品制備試劑盒生成測序文庫。使用TruSeq TM DNA Sample Prep Kit（Illumina，CA，USA）構建PE文庫，使用Illumina Nova Seq進行上機測序，測序長度為250 bp。測序工作由天津諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.2.6 測序數據處理 根據雙末端測序序列（PE reads）之間的重疊（Overlap）關系，將測序得到的雙端序列數據拼接成一條序列（Tags），同時對reads的質量和拼接的效果進行質控過濾。利用軟件Flash v1.2.7通過 Overlap對每個樣品的reads進行拼接，得到的拼接序列即原始 Tags數據（Raw Tags）;使用 Trimmomatic v0.33軟件，對拼接得到的 Raw Tags進行過濾，得到高質量的Tags數據 （Clean Tags）;使用UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，最終得到有效數據（Effective Tags）。

1.2.7 多樣性和群落結構分析 默認以 97%的一致性對Clean Reads進行操作分類單元（OTUs）聚類，然后通過與數據庫 Silva132（細菌）和UNITE（真菌）分類學數據庫對OTU進行分類學注釋。分析微生物群落結構差異并繪制差異 OTU韋恩圖、非加權組平均法（UPGMA）聚類樹及屬水平上物種相對豐度柱形圖。α多樣性指數采用Qiime軟件進行計算，包括OTU指數、 Chao1 指數、Shannon指數、Simpson指數和ACE指數。Chao1指數和ACE指數側重于體現群落的豐富度，而Shannon指和Simpson指數數則綜合考慮群落的豐富度和均勻度。多樣品比較分析主坐標分析（PCoA）圖以及聚類分析的群落組成熱圖采用R軟件（v2.15.3）進行繪制，PCoA基于由樣本組成計算得到的距離矩陣進行特征向量降維排序，從均一化的 OTU矩陣中計算加權和未加權的UniFrac距離矩陣，其中加權考慮物種的豐度，未加權則沒有對物種豐度進行加權處理。

2 結果與分析

2.1 田間藥效試驗結果

由表2可以看出，不同藥劑對葡萄霜霉病的田間防效存在明顯差異。在3次藥后14 d時，各處理防效之間均無明顯差異，但47%春雷王銅的防效最高，為82.17%，其次是防效為81.32%的0.3%苦參堿，而3億CFU/g哈茨木霉的防效最低，為58.39%;從藥后21 d來看，各處理間存在顯著的差異性，47%春雷王銅的防效最高，為91.56%，明顯高于其余6種藥劑的防效，0.3%苦參堿的防效次之，為87.60%，3億CFU/g哈茨木霉的防效最低，僅為39.06%，防治效果明顯低于其他幾種藥劑;從藥后28 d的防治效果看，47%春雷王銅的防治效果仍然是最高的，為89.33%，0.3%苦參堿次之，防效為83.83%，高于其他5種藥劑的防效，3億CFU/g哈茨木霉的防效依然是7種藥劑中防效最低的，為63.33%，顯著低于其他6種藥劑的防效。

綜合比較7種藥劑對葡萄霜霉病的防治效果可以看出，47%春雷王銅和0.3%苦參堿對葡萄霜霉病具有良好的防治效果，在調查的3個時間段中，防治效果在81.32%～91.56%之間，可在實際生產中合理使用上述殺菌劑防治葡萄霜霉病。

2.2 不同藥劑處理對果面微生物群落的影響

2.2.1 不同藥劑處理對葡萄果面微生物群落結構

組成分析 為分析不同生物藥劑處理下果面微生物的群落結構，研究不同處理間的相似性，本研究通過對樣本以Binary Jaccard 距離矩陣進行UPGMA等級聚類，構建了8個樣本的聚類樹，并且根據聚類得到的OTU分析不同樣本間共有及特有的OTU，繪制成韋恩圖，如圖1和圖2所示。根據圖1-A可以看出，真菌中共有OTU為56個，8種藥劑處理下的果面真菌的OTU存在明顯差異，其中PF組特有42個差異OTU，BS組特有40個差異OTU，MA組的特有OTU最少，為13個;從圖2-A可以看出，細菌中共有OTU為140個，不同處理果面細菌共有OTU明顯多于真菌，其中PO組特有69個差異OTU，是8個處理中差異OTU最多的，BS組特有66個差異OTU，差異OTU最少的組為CK，有33個。

選取不同藥劑處理下各樣品組在屬分類水平上相對豐富度排名前10的物種繪制物種相對豐度柱形圖，以便查看各樣品組中相對豐度較高的優(yōu)勢物種及其所占比例（圖3）。從圖3-A排名前10（Top10）的真菌屬中可以看出，BS樣品組優(yōu)勢菌屬有枝孢屬（Cladosporium）、鏈格孢屬（Alternaria）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）、擲孢酵母屬（Sporobolomyces）等;PO和MA樣品組優(yōu)勢菌屬有枝孢屬（Cladosporium）、鏈格孢屬（Alternaria）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）、短柄霉屬（Aureobasidium）等;KC樣品組優(yōu)勢菌屬有枝孢屬（Cladosporium）、鏈格孢屬（Alternaria）、莖點霉屬（Phoma）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）等;EU樣品組優(yōu)勢菌屬有枝孢屬（Cladosporium）、鏈格孢屬（Alternaria）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）、（Vishniacozyma）等;TR樣品組優(yōu)勢菌屬有枝孢屬（Cladosporium）、鏈格孢屬（Alternaria）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）、短柄霉屬（Aureobasidium）等;PF樣品組優(yōu)勢菌屬有枝孢屬（Cladosporium）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）、鏈格孢屬（Alternaria）、孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）等;CK樣品組優(yōu)勢菌屬有枝孢屬（Cladosporium）、鏈格孢屬（Alternaria）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）、短柄霉屬（Aureobasidium）等。綜合各處理樣品組可以看出，葡萄果面真菌中枝孢屬（Cladosporium）、鏈格孢屬（Alternaria）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）為優(yōu)勢物種且相對豐度較高。

從圖3-B排名前10的細菌屬中可以看出，BS樣品組優(yōu)勢菌屬有馬賽菌屬（Massilia）、鏈球菌屬（Streptococcus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）等;PO樣品組優(yōu)勢菌屬有馬賽菌屬（Massilia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）等;MA樣品組優(yōu)勢菌屬有馬賽菌屬（Massilia）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、弧形菌屬（Vibrio）等;KC樣品組優(yōu)勢菌屬有鏈球菌屬（Streptococcus）、弧形菌屬（Vibrio）、短桿菌屬（Curtobacterium）等;EU樣品組優(yōu)勢菌屬有弧形菌屬（Vibrio）、鏈球菌屬（Streptococcus）、馬賽菌屬（Massilia）等;TR樣品組優(yōu)勢菌屬有馬賽菌屬（Massilia）、鏈球菌屬（Streptococcus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）等;PF樣品組優(yōu)勢菌屬有鏈球菌屬（Streptococcus）、弧形菌屬（Vibrio）、馬賽菌屬（Massilia）等;CK樣品組優(yōu)勢菌屬有馬賽菌屬（Massilia）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、鏈球菌屬（Streptococcus）等。綜合各處理樣品組可以看出，葡萄果面細菌中除了2個未鑒定出的屬外，在其余8個屬中，馬賽菌屬（Massilia）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）為優(yōu)勢物種且相對豐度較高。

2.2.2 不同藥劑處理對葡萄果面微生物多樣性分析 α多樣性主要關注局域均勻生境下的物種數量，因此也被稱為生境內的多樣性。而OTU數量、Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數和ACE指數均是Alpha多樣性指數，以表征樣品中物種分布的豐富度、多樣性和均勻度，并且可以直觀展示測序深度和數據量情況。從表3可以看出，不同處理中真菌群落和細菌群落的OTU數量存在明顯差異，而各處理中細菌群落的OTU數量明顯高于真菌的OTU數量。Chao1指數和ACE指數越大，表明群落的豐富度越高，Shannon指數和Simpson指數越高，表明群落的多樣性越高，物種分布越均勻。從真菌群落看，樣品EU組的Shannon指數和Simpson指數均最高，分別為2.86和0.81，說明樣品EU組果面真菌多樣性較高，物種分布較均勻;Chao1指數和ACE指數最大的為樣品PO組，分別為162.86和172.88，其次是樣品BS組的153.34和139.97，說明樣品PO組和BS組真菌群落的豐度較高。從細菌群落看，樣品PO組的Shannon指數和Simpson指數均最高，分別為2.26和0.59，其次是樣品MA組，分別為1.88和0.57，說明樣品PO組和MA組果面細菌多樣性較高，物種分布均勻;樣品BS組的Chao1指數和ACE指數均最大，分別為461.29和478.19，其次是樣品PO組的454.48和464.09，說明這2個樣品組果面中細菌群落的豐度較高。本試驗中，樣本測序深度值均在95%以上，說明測序覆蓋率較高，測序深度良好，測序結果合理可靠。

2.2.3 不同藥劑處理對葡萄果面微生物群落結構相似性分析 基于加權UniFrac 距離的 PCoA 分析了不同藥劑處理后微生物群落結構相似性。真菌群落結構分析結果（圖4-A）顯示，PC1 和 PC2 解釋率分別為 61.84% 和9.39%，BS、CK、EU分布于第一、第二、第四象限，三者距離較遠，而PO、PF、MA在中心位置，說明 BS、EU和CK之間真菌群落結構組成差異較大，而PO、PF、MA之間真菌群落結構組成相似。細菌群落結構分析結果（圖4-B）顯示，PC1 和 PC2 解釋率分別為54.72%和17.66%，BS和TR均分布于第一象限，說明BS和TR之間細菌群落組成結構相似，KC、EU和CK則分布于第四象限，說明這3組之間細菌群落組成結構相似，而PO分布于第二象限，MA分布于第三象限，與其他幾組距離較遠，結構差異較大。

3 結論與討論

葡萄霜霉病主要危害葡萄葉片，但對新梢、葉柄、花序、穗軸、果柄和果實等幼嫩組織也會造成危害[17]。葡萄種植業(yè)中霜霉病的防治主要采用化學防治措施，常用的化學藥劑包括氨苯甲基酰胺類[18]、氨基甲酸酯類、嗎啉類[19]、甲氧基丙烯酸酯類等藥劑[20-21]，但由于近些年化學藥劑的單一、盲目使用，導致葡萄霜霉病病菌對大多數的藥劑都出現了不同程度的抗藥性，防治效果顯著降低，而化學藥劑的過量、頻繁使用，又導致了葡萄農藥殘留、環(huán)境污染等一系列安全和環(huán)保問題。近些年，隨著人們生活水平的不斷提高，對健康綠色食品的要求也越來越高，加之國家大力支持和鼓勵植物病害的防治要朝綠色環(huán)保方向發(fā)展，因此，篩選對環(huán)境友好、安全、高效的生物殺菌劑對防治葡萄霜霉病，提高葡萄品質具有重要的意義。

因生物防治具有高效、環(huán)保、安全、無副作用等優(yōu)點，是植物病害防治的發(fā)展趨勢。植物內生真菌、細菌、芽孢桿菌、木霉菌都是生物防治的研究熱點，吉沐祥等研究發(fā)現黃麻鏈霉菌NF0919 菌株和枯草芽孢桿菌 DJ-6 WP 對葡萄霜霉病具有一定防效，認為這2株菌株具備一定的生防潛力與開發(fā)的價值[22];康興嬌等研究發(fā)現甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌T3對葡萄霜霉病病菌具有強烈的抑制作用，并具有較好的防治效果[23];曹輝等在葡萄霜霉病生物防治試驗中發(fā)現，哈茨木霉菌可濕性粉劑對葡萄霜霉病的防效較好，且適宜使用濃度為300倍液[24]。本研究中也對3億CFU/g哈茨木霉可濕性粉劑的田間防效進行了研究，但其防治效果較差。包巖在4種藥劑對葡萄霜霉病的防治效果試驗中認為，0.3%丁子香酚可溶性液劑對葡萄霜霉病具有顯著的防效，防效達到83.8%[25]，而本研究中0.3%丁子香酚可溶性液劑對葡萄霜霉病的防效最高為72.36%，防效一般，導致防治效果存在差異可能是由于不同的地理環(huán)境、氣候等因素造成的;曹依靜等在研究1%苦參堿水乳劑防治葡萄霜霉病試驗中表明，該生物藥劑可有效防治葡萄霜霉病的發(fā)生，防效達90%以上，防效明顯高于常規(guī)殺菌劑 70%丙森鋅和80%代森錳鋅[26]，本研究結果與之一致，在本研究中0.3%苦參堿水劑對葡萄霜霉病的防效僅次于47%春雷王銅。春雷王銅屬于復合型低毒殺菌劑，具有保護和治療雙重作用，被廣泛用于防治各種由真菌、細菌引起的病害，如核桃細菌性黑斑病[27]、黃瓜靶斑病[28]、生姜青枯病[29]等，針對不同作物不同病害其防治效果也存在顯著差異，本研究中47%春雷王銅防治葡萄霜霉病防效最好，防效在82.17%～91.56%之間，明顯優(yōu)于其他生物藥劑，說明47%春雷王銅可作為防治寧夏葡萄霜霉病的低毒、環(huán)保型藥劑使用。

微生物群落對葡萄酒的風味及品質都有很大影響，其中酵母菌又是葡萄酒釀造的關鍵因素，直接決定了葡萄酒的風味及感官品質。而殺菌劑的使用又能夠改變葡萄果面微生物群落結構，只有了解不同殺菌劑使用后葡萄果面微生物群落結構，才能保證葡萄酒的口感以及風味。近些年，對葡萄根際土壤、葉片、漿果表面等的微生物群落結構研究的較多，馬勉娣等在對釀酒葡萄“赤霞珠”葉內生真菌多樣性研究中發(fā)現，鏈格孢屬和黑孢屬為優(yōu)勢屬，認為釀酒葡萄赤霞珠葉片內生真菌菌群豐富，存在一定的宿主專一性，但多樣性偏低[30]。王志恒等在研究寧夏賀蘭山東麓釀酒酵母分離篩選及菌株鑒定試驗中，共鑒定出克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、大隱球酵母（Cryptococcus magnus）共5種酵母菌[31]。魏玉潔等在應用高通量測序技術研究新疆產區(qū)葡萄果實、葉片及果園土壤微生物多樣性中檢測到了酵母屬（Saccharomyces）真菌，認為該菌可以將葡萄漿果中的糖轉化成乙醇、CO 2及其他代謝產物[32]，在葡萄汁發(fā)酵過程中生成并釋放多種香氣物質，同時還對葡萄果實表面的細菌有一定的生物抑制作用[33]，而相比于真菌，除少數乳酸菌外，大多數細菌微生物對葡萄酒來說都是有害菌，會不同程度對葡萄酒的品質造成影響，如變形菌門（Proteobacteria）的醋酸菌在釀酒中屬于典型的有害菌[34]。因此，在釀造過程的各個階段都應該盡可能避免或減少細菌侵染。有關使用殺菌劑后對葡萄果面微生物群落結構影響的報道較少，國外Noguerol-Pato等選用了10種不同殺菌劑處理過的釀酒葡萄，對酵母菌群落進行了比較分析，發(fā)現普通表面酵母群落生物量均低于用殺菌劑處理的葡萄，而且研究發(fā)現殺菌劑還降低了酵母菌的發(fā)酵能力、乙醇生產量和香氣物質含量[35]。本研究中對使用7種殺菌劑后的果面微生物群落結構進行了研究發(fā)現，葡萄果面真菌中枝孢屬（Cladosporium）、鏈格孢屬（Alternaria）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）為優(yōu)勢物種且相對豐度較高;葡萄果面細菌中馬賽菌屬（Massilia）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）為優(yōu)勢物種且相對豐度較高。

本研究對7種低毒、生物型農藥進行了田間藥效試驗，發(fā)現47%春雷王銅和0.3%苦參堿對葡萄霜霉病具有良好的防治效果，在調查的3個時間段中，防治效果在81.32%～91.56%之間，可在實際生產中合理使用上述殺菌劑防治葡萄霜霉病。并通過對施藥后葡萄果面微生物群落結構及多樣性進行了初步研究，對其真菌和細菌的群落結構、種類和多樣性都有了一定的了解，為安全、高效、環(huán)境友好地防治葡萄霜霉病提供了理論依據，及為揭示施藥后葡萄果面微生物多樣性，提高葡萄酒品質提供了理論支持。

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