呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲形態(tài)學(xué)、標簽基因選擇及其遺傳進化分析

李中波 李暉 羅世民

摘要：為比較呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲形態(tài)學(xué)及選擇合適基因標簽，以期探究它們間的遺傳進化關(guān)系。借助光學(xué)顯微鏡觀察2種泰勒蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu);利用PCR技術(shù)分別擴增了呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲的cox1、18S rRNA及28S rRNA等3個標簽基因的部分序列，分別比對它們相應(yīng)基因的同源性，分析呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲基因差異，并利用其cox1、18S rRNA和28S rRNA基因序列分別構(gòu)建了它們的遺傳進化樹。研究結(jié)果表明，呂氏泰勒蟲多呈圓點形、卵圓形和短桿狀，而尤氏泰勒蟲多呈逗點狀、十字架狀及三葉草形;呂氏泰勒蟲cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列的長度分別為1 122、1 303、1 995 bp;尤氏泰勒蟲cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列的長度分別為1 123、1 303 、1 990 bp;兩者cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列比對，其相似度分別為80.32%、95.87%及88.64%;所構(gòu)建的3個遺傳進化樹均顯示呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲未處于進化樹一分支。提示呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲盡管形態(tài)極為相似，但它們間存在較遠的親緣關(guān)系，且cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列適用于泰勒蟲種屬的鑒別。

關(guān)鍵詞：呂氏泰勒蟲;尤氏泰勒蟲;形態(tài)學(xué);標簽基因;選擇;遺傳進化

中圖分類號：S852.72 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）09-0173-06

羊泰勒蟲病是由隸屬于泰勒科、泰勒屬的泰勒原蟲經(jīng)蜱傳播，寄生于山羊、綿羊的紅細胞、淋巴細胞及巨噬細胞內(nèi)，引起的一類以高熱、消瘦、貧血、黃疸及血紅蛋白尿特征性臨床癥狀的血液原蟲病[1-3]。該類疾病分布廣泛，自1914年首次于埃及發(fā)現(xiàn)后，已陸續(xù)報道于世界上多個國家和地區(qū)[4]。目前，該病在我國的青海省、甘肅省、遼寧省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、山西省、寧夏回族自治區(qū)、新疆維吾爾自治區(qū)、湖北省、河南省、云南省、貴州省等?。▍^(qū)）均有報道[5-7]。迄今為止，國內(nèi)外共發(fā)現(xiàn)6種泰勒蟲可感染羊群[8]，它們分別為萊氏泰勒蟲（Theileria lestoquardi）、尤氏泰勒蟲（T. uilenbergi）、呂氏泰勒蟲（T. luwenshun）、綿羊泰勒蟲（T. ovis）、隱藏泰勒蟲（T. recondita）及分離泰勒蟲（T. separata）[9-10]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲及萊氏泰勒蟲的致病力較其他蟲株強[11]，其中，呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲已成為我國優(yōu)勢蟲種[12]，且呂氏泰勒蟲流行最為廣泛[8]。如鐘維等對四川阿壩州牦牛及藏綿羊感染呂氏泰勒蟲的情況進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其感染率高達75%[13]。由此可見，泰勒蟲病已嚴重危害動物健康[14]，極大阻礙了世界畜牧業(yè)發(fā)展。

物種精準鑒定不僅是開展寄生蟲研究的前提和基礎(chǔ)[15]，同時，也是有效監(jiān)測、控制和防治寄生蟲病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。然而，傳統(tǒng)物種鑒定及分類主要依據(jù)物種自身的形態(tài)特征劃分，高度依賴樣本的完整性和鑒定者的經(jīng)驗[16]，其鑒定和分類結(jié)果受人為主觀因素影響極大，難免會出現(xiàn)一定程度偏差，甚至完全錯誤，造成形態(tài)不完整或極為相似的物種及處于不同發(fā)育階段的同一物種鑒定有誤的情況，給防治帶來極大的挑戰(zhàn)，故選擇合適的基因標簽在寄生蟲的種類鑒定及分類鑒定等方面至關(guān)重要。呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲均為我國的優(yōu)勢蟲種，其形態(tài)結(jié)構(gòu)及其所引發(fā)的臨床癥狀也極為相似，很難利用傳統(tǒng)的物種鑒定、分類方法將它們區(qū)別開來。核糖體與線粒體的基因因具有進化速度快，缺乏基因重組及母系遺傳等特征，已廣泛應(yīng)用于種群結(jié)構(gòu)、分子標記、生物進化、種系發(fā)生及物種鑒定等方面的研究[17-18]。例如，王天葆等[19]、王坤輪等[20]就分別利用核糖體18S rRNA基因去鑒定云南省和陜西麟游縣羊源性泰勒蟲的種類及其遺傳進化關(guān)系。為此，本研究于2020年6—9月在懷化職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物科技系寄生蟲實驗室對分離于湖南省湘西自治州呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲標簽基因的差異及其遺傳進化關(guān)系進行分析，其結(jié)果不僅可為今后對泰勒蟲的種類鑒定、分類和分子流行病學(xué)調(diào)查提供有用信息和技術(shù)指導(dǎo)，還可為以后泰勒蟲病的診斷、控制及防治提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究所用呂氏泰勒蟲（T. luwenshun）（n=13）、尤氏泰勒蟲（T. uilenbergi）（n=12）均采自于湘西地區(qū)不同病羊的血液中。采集后，進行編號、記錄位置，立即置于冰盒內(nèi)。

1.2 主要試劑

動物血液、組織DNA提取試劑盒，購于北京天根有限公司;Taq保真酶，購于寶生物工程（大連）有限公司;蛋白酶K和2000 DNA Marker，均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;電泳緩沖液，購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 蟲株的鑒定

采用膠頭滴管分別從2份陽性血液中吸取 1 mL 血液，分別滴1滴血液于2片潔凈的載玻片上，均勻涂抹、風(fēng)干;姬姆薩染色，先甲液固定 10 min，后乙液染色30 min;蒸餾水去除染色顆粒，待自然風(fēng)干后，再置于40倍鏡下觀察。

1.4 DNA提取

首先，從含有呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲病羊的血液中，吸取0.15 mL血液，分別置于2個潔凈的離心管內(nèi)，混合均勻、編號。再根據(jù)血液、組織DNA提取試劑盒的使用說明書，分別提取含有呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲山羊血液的基因組 DNA。將提取好的DNA樣品，分別置于-20? ℃保存、備用。

1.5 標記基因序列的擴增及測序

根據(jù)NCBI所公布呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲的cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列，設(shè)計3對特異性引物（表1），發(fā)至生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。71B92BC9-5A5F-449D-8132-6887D5119BAA

對呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲的cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列進行PCR擴增。PCR擴增體系（總體積均為50 μL）：Taq 酶（MIX）均25 μL，DNA模板均1 μL，上下游引物各均1 μL，dH 2O均22 μL。PCR擴增程序95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，54 ℃（cox1）、58 ℃（18S rRNA）、56 ℃（28S rRNA）退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán);最后72 ℃均再延伸5 min。待PCR反應(yīng)完成后，分別從每個反應(yīng)體系吸取5 μL PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖上進行凝膠電泳檢測，觀察結(jié)果并拍照。將所有PCR產(chǎn)物發(fā)送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序，獲得呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲的cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列。將所得序列經(jīng)BLAST分析比對，確認它們均為目的基因序列。再運用Clustal X[21]軟件對所獲基因序列進行拼接和組裝。

1.6 基因序列差異與遺傳進化分析

基于呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲的cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列，運用軟件DNAMAN對它們標記基因序列間的差異進行分析;運用軟件Clustal X、PhyML3.0[22]及MEGA5.0[23]對呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲的遺傳進化關(guān)系進行分析;運用軟件FigTree v1.3.1[24]描繪出所構(gòu)建的遺傳進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲株形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

由圖1可知，病羊紅細胞中存有呈圓點形、卵圓形及短桿狀的多形態(tài)蟲體，參照相關(guān)文獻，發(fā)現(xiàn)該份山羊紅細胞內(nèi)所含的蟲體與王天堡等所描述呂氏泰勒蟲的形態(tài)[19]極為相似，從而初步鑒定該蟲株為呂氏泰勒蟲。

由圖2可知，病羊紅細胞中存有呈逗點狀、十字架狀及三葉草形的多形態(tài)蟲體，參照相關(guān)文獻，發(fā)現(xiàn)該份山羊紅細胞內(nèi)所含的蟲體與李有全等所描述尤氏泰勒蟲的形態(tài)[25]極為相似，從而初步鑒定該蟲株為尤氏泰勒蟲。

2.2 呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲cox1的擴增結(jié)果

呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲cox1基因序列的擴增結(jié)果見圖3。由圖3可知，2個PCR產(chǎn)物均為陽性，每個泳道僅含1個條帶，無明顯雜帶，且大小與預(yù)期一致，大小均約為1 200 bp。每個樣品重復(fù)3次測序，待測序完成，將所獲全部序列進行校準、對齊。最終獲得呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲cox1基因序列的長度分別為1 122、1 123 bp。將處理后的序列提交到NCBI，分別獲得其基因登錄號：MW879215、MW879216。

2.3 呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲18S rRNA的擴增結(jié)果

呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲18S rRNA基因序列的擴增結(jié)果見圖4。由圖4可知，2個PCR產(chǎn)物均為陽性，每個泳道僅含1個條帶，無明顯雜帶，且大小與預(yù)期的相一致，大小均約為1 400 bp。每個樣品重復(fù)3次測序，待測序完成，將所獲全部序列進行校準、對齊。最終獲得呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲18S rRNA基因序列的長度均為1 303 bp。將處理后的序列提交至NCBI，分別獲得其基因登錄號：MW881298、MW881299。

2.4 呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲28S rRNA的擴增結(jié)果

呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲28S rRNA基因序列的擴增結(jié)果見圖5。由圖5可知，2個PCR產(chǎn)物均為陽性，每個泳道僅含1個條帶，無明顯雜帶，且大小與預(yù)期的相一致，大小均約為2 000 bp。每個樣品重復(fù)3次測序，待測序完成，將所獲全部序列進行校準、對齊。最終獲得呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲28S rRNA基因序列的長度分別為1 995、1 990 bp。將處理后的序列提交至NCBI，分別獲得其基因登錄號：MW881300、MW882064。

2.5 2種泰勒蟲cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列分析

所獲呂氏泰勒蟲cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列與GenBank中呂氏泰勒蟲相對應(yīng)序列的相似度分別為100.0%、99.8%和100.0%;尤氏泰勒蟲cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列與GenBank中尤氏泰勒蟲相對應(yīng)序列的相似度分別為100%、100%和100%。2種泰勒蟲cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列的4種堿基（A、T、G、C）的含量見表2。進一步比較呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲的cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列，發(fā)現(xiàn)其相似度分別為80.32%、95.87%及88.64%。

2.6 遺傳進化分析

基于cox1基因序列，本研究以所獲的呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲及從NCBI下載的東方泰勒蟲（T. orientalis）（AB499090）、馬泰勒蟲（T. equi）（MF510491）及小泰勒蟲（T. parva）（AB499089）為內(nèi)群，以雙芽巴貝斯蟲（Babesia bigemina）（AB499085）為外群，構(gòu)建其遺傳進化樹。由圖6可知，呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲未位于進化樹的一分支上。

基于18S rRNA基因序列，本研究以所獲的呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲及從NCBI下載的綿羊泰勒蟲（T. ovis）（AY260172）、分離泰勒蟲（T. separata）（AY260175）、環(huán)型泰勒蟲（T. annulata）（KF429795）、瑟氏泰勒蟲（T. sergenti）（AY661515）、水牛泰勒蟲（T. buffeli）（DQ104611）、中華泰勒蟲（T. sinensis）（EU274472）、東方泰勒蟲（T. orientalis）（LC576821）、狍泰勒蟲（T. capreoli）（AY726011）、馬泰勒蟲（T. equi）（MT903276）及小泰勒蟲（T. parva）（HQ895985）為內(nèi)群，以雙芽巴貝斯蟲（Babesia bigemina）（KM046917）為外群，構(gòu)建其遺傳進化樹。由圖7可知，呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲分別位于進化樹的不同分支上。71B92BC9-5A5F-449D-8132-6887D5119BAA

基于28S rRNA基因序列，本研究以所獲的呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲及從NCBI下載的綿羊泰勒蟲（T. ovis）（JN696672）、環(huán)型泰勒蟲（T. annulata）（JN696676）、瑟氏泰勒蟲（T. sergenti）（JN696679）、水牛泰勒蟲（T. buffeli）（HM538241）、中華泰勒蟲（T. sinensis）（JN696681）、東方泰勒蟲（T. orientalis）（XR_696410）、馬泰勒蟲（T. equi）（MF510487）及小泰勒蟲（T. parva）（AF218825）為內(nèi)群，以雙芽巴貝斯蟲（Babesia bigemina）（JN391440）為外群，構(gòu)建其遺傳進化樹，由圖8可知，呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲分別位于進化樹的2個不同分支上。

3 討論

呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲為我國泰勒蟲株的優(yōu)勢蟲株[12]。如王坤輪等[20]、孟林明等[26]分別就陜西麟游縣、甘肅武威市山羊感染呂氏泰勒蟲的情況進行了流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其感染率分別為61.2%和64%;可見其分布廣泛，毒力之強，已嚴重威脅動物健康，極大阻礙了世界畜牧業(yè)的發(fā)展。目前，檢測泰勒蟲病的經(jīng)典手段依然是形態(tài)學(xué)方法，其檢測結(jié)果準確與否直接取決于檢測者的經(jīng)驗和水平[27]。然而，呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲同屬于泰勒屬但不同物種的血液原蟲，其形態(tài)結(jié)構(gòu)極為相似，很難用形態(tài)學(xué)方法快速、準確地將其區(qū)別開來，故快速、精準地鑒定對泰勒蟲病的防治至關(guān)重要。因此，比對呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲分子標記的差異及遺傳進化關(guān)系對醫(yī)學(xué)、公共衛(wèi)生事業(yè)及畜牧業(yè)具有十分重要的意義，其結(jié)果不僅有助于泰勒蟲的種類鑒定、分類、種群結(jié)構(gòu)、基因變異及遺傳進化等方面研究，還有利于泰勒蟲病的流行病學(xué)調(diào)查、診斷、控制及相關(guān)藥物的研發(fā)。

基于cox1基因序列，發(fā)現(xiàn)呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲的相似度為80.32%;基于18S rRNA基因序列，發(fā)現(xiàn)呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲的相似度為95.87%;基于28S rRNA基因序列，發(fā)現(xiàn)呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲的相似度為88.64%。顯然，呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲的3個標記基因序列的相似度較低，相同基因序列間存在較大差異，這表明cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列能夠準確鑒定呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲，暗示這3個標記基因適用于泰勒屬原蟲之間的種屬鑒定?；赾ox1基因序列呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲的相似度顯著低于18S rRNA和28S rRNA基因序列。這主要由于cox1、18S rRNA及28S rRNA基因分別為線粒體和核糖體基因，其具有進化速度快、種內(nèi)變異小而種間變異大等特點[28-29]，尤其cox1基因演化速率是其他基因的 3 倍，能夠很好地區(qū)分物種[30]。此外，呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲的cox1基因序列AT含量顯著高于GC含量，明顯呈AT偏斜，其主要原因為cox1基因是一線粒體基因，而后生動物線粒體基因組及其基因均呈AT偏斜，與之前其研究結(jié)果[24]相一致。

在基于cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列所構(gòu)建的遺傳進化樹中，發(fā)現(xiàn)呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲均未處于進化樹的一個分支上，表明呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲間的親緣關(guān)系較遠。

結(jié)合呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲cox1、18S rRNA、28S rRNA基因序列的相似度，及遺傳進化分析結(jié)果，推斷呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲間存在較遠的親緣關(guān)系，且cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列適用于泰勒蟲種屬的鑒別。

4 結(jié)論

盡管呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲的形態(tài)相似，很難用形態(tài)學(xué)方法將其區(qū)分，但兩者cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列的相似度較低，能夠準確地將其區(qū)分。因此，推斷呂氏泰勒蟲與尤氏泰勒蟲間存在較遠的親緣關(guān)系，且cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列適用于泰勒屬原蟲間的種屬鑒定。

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