熒光成像術(shù)中導(dǎo)航研究進(jìn)展

張彩 葉兆祥*

癌癥嚴(yán)重威脅人類生命，是亟需攻克的全球性健康難題，癌癥病人的發(fā)病率和死亡率逐年上升。預(yù)計(jì)到2030 年，全球癌癥的發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)將分別達(dá)到2 170 萬(wàn)例和1 300 萬(wàn)例[1]。近年來(lái)，靶向治療提高了癌癥病人的生存率，但手術(shù)切除仍是大多數(shù)原發(fā)癌首選的治療手段[2-3]。完全切除原發(fā)腫瘤與降低病灶復(fù)發(fā)率及提高病人的5 年生存率密切相關(guān)。盡管術(shù)前影像診斷技術(shù)已經(jīng)非常完善，但術(shù)中判斷腫瘤病灶范圍仍然依賴于外科醫(yī)生的視覺(jué)定位和觸診。此外，腫瘤與正常組織對(duì)比度較低，導(dǎo)致手術(shù)切緣的腫瘤陽(yáng)性率增加, 小腫瘤被遺漏概率上升，而手術(shù)切緣腫瘤陽(yáng)性的病人仍需進(jìn)一步治療，這將加重病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。影像引導(dǎo)術(shù)中導(dǎo)航有助于外科醫(yī)生做出判斷，降低手術(shù)切緣陽(yáng)性率，已成為檢測(cè)術(shù)中腫瘤范圍的有效解決方法[5]。熒光成像術(shù)中導(dǎo)航基于對(duì)比劑在特定組織的富集，可精準(zhǔn)顯示術(shù)中血管、淋巴結(jié)、腫瘤組織等信息。光學(xué)分子影像技術(shù)可特異性可視化腫瘤組織中過(guò)度表達(dá)的特異性分子靶標(biāo)，從而達(dá)到高信噪比腫瘤成像的效果，進(jìn)一步降低手術(shù)切緣陽(yáng)性率。本文就熒光術(shù)中導(dǎo)航發(fā)展現(xiàn)狀、臨床應(yīng)用的熒光探針、分子熒光探針的制備和應(yīng)用以及該技術(shù)目前的局限性和未來(lái)展望進(jìn)行綜述。

1 熒光成像術(shù)中導(dǎo)航

CT、MRI、單光子發(fā)射體層成像（SPECT）和正電子發(fā)射體層成像（PET）等技術(shù)為癌癥診斷、分期和手術(shù)方案的制定提供了有效的指導(dǎo)信息。隨著醫(yī)學(xué)影像技術(shù)的發(fā)展，術(shù)中MRI 及CT 導(dǎo)航技術(shù)已應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤手術(shù)，但這些成像設(shè)備龐大、成本昂貴、操作復(fù)雜及輻射劑量大，故而限制了其在臨床上的推廣；另外，由于這些成像手段主要提供病灶形態(tài)學(xué)診斷，因此無(wú)法從分子、細(xì)胞層面對(duì)早期癌癥病灶進(jìn)行精準(zhǔn)診斷[6-7]?；诎邢驘晒鈱?duì)比劑的熒光成像術(shù)中導(dǎo)航通過(guò)分子探針特異性靶向癌灶組織，可顯著提高病灶的信噪比，有望實(shí)現(xiàn)分子、細(xì)胞層面的癌灶邊界界定，可精準(zhǔn)指導(dǎo)術(shù)中病灶切除[8]。

熒光成像具有高靈敏度、無(wú)電離輻射、高空間分辨力的特點(diǎn)，適于實(shí)時(shí)指導(dǎo)手術(shù)切除。熒光成像系統(tǒng)可捕捉熒光對(duì)比劑在光源激發(fā)后發(fā)出的信號(hào)，而所有成像系統(tǒng)都可以集成到一個(gè)專用設(shè)備中，如集成到腹腔鏡或手術(shù)機(jī)器人設(shè)備中，提供無(wú)接觸、實(shí)時(shí)成像。術(shù)中熒光成像不僅可以更加精確地定位腫瘤的位置，顯示其大小，而且為外科醫(yī)生提供了清晰可見(jiàn)的淋巴結(jié)定位，已在頭頸部黑色素瘤病人淋巴結(jié)定位中取得了令人滿意的效果[9]。此外，該技術(shù)也已用于胃癌病人的根治手術(shù)，術(shù)中在瘤周注射熒光對(duì)比劑，應(yīng)用術(shù)中熒光成像可幫助識(shí)別淋巴結(jié)，有助于進(jìn)行全面的淋巴結(jié)清掃[10]。

2 熒光對(duì)比劑的特點(diǎn)及臨床應(yīng)用

熒光對(duì)比劑基于被動(dòng)靶向或主動(dòng)靶向原理富集到腫瘤部位后，可使靶腫瘤組織高靈敏和高對(duì)比顯示，便于術(shù)中觀察，從而提高手術(shù)安全性，縮短手術(shù)時(shí)間，降低二次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)[11]。應(yīng)用于臨床的熒光對(duì)比劑需滿足摩爾消光系數(shù)大、生物相容性好、分子質(zhì)量小、與正常組織的非特異性吸附小、成本低、易制備的特點(diǎn)。常用的熒光對(duì)比劑有異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）、5-氨基乙酰丙酸、亞甲藍(lán)及近紅外熒光染料[如吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）、IRDye800CW、IRDye700DX][12]。FITC 是一種熒光素衍生物，已經(jīng)被美國(guó)食品與藥物監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于人體，是臨床最早使用的熒光染料之一[13]。然而，F(xiàn)ITC 和血紅蛋白的吸收峰相似，受生物組織自發(fā)熒光背景干擾大，導(dǎo)致FITC 熒光成像的對(duì)比度、敏感度降低。同時(shí)，F(xiàn)ITC 易光漂白，這也導(dǎo)致其不能用于長(zhǎng)時(shí)間成像，不適合于實(shí)時(shí)成像介導(dǎo)手術(shù)導(dǎo)航。5-氨基乙酰丙酸是生成血紅素的前體物質(zhì)，在藍(lán)光照射下代謝產(chǎn)物可發(fā)出熒光，在臨床試驗(yàn)中取得了良好的結(jié)果，有效降低了試驗(yàn)中手術(shù)切緣陽(yáng)性率，顯著延長(zhǎng)了病人的無(wú)進(jìn)展生存期，在2017 年獲得FDA 的批準(zhǔn)[14]。亞甲藍(lán)主要用于輸尿管、甲狀腺結(jié)節(jié)和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤顯像。

發(fā)射波長(zhǎng)＜600 nm 的熒光成像可受到生物組織散射和血紅蛋白吸收的限制，而波長(zhǎng)＞1 300 nm 的熒光成像會(huì)受到水吸收干擾[15-16]。因此，發(fā)射波長(zhǎng)在近紅外區(qū)域的熒光對(duì)比劑備受關(guān)注，其具備更深的組織穿透力，且光散射更少，受自發(fā)熒光干擾小[17]。近紅外激光的獨(dú)特性質(zhì)使其適用于高信噪比腫瘤成像和實(shí)時(shí)術(shù)中導(dǎo)航。近紅外熒光染料中，ICG 具有相對(duì)較低的組織吸收和較高的量子產(chǎn)率，是目前臨床手術(shù)導(dǎo)航應(yīng)用最廣泛的近紅外熒光對(duì)比劑，主要用于血流評(píng)估、前哨淋巴結(jié)定位和肝臟腫瘤成像[18]。ICG 是一種水溶性的、帶負(fù)電的、兩親性三碳菁類染料，分子質(zhì)量約776 u，其最大激發(fā)波長(zhǎng)為780 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為820 nm，有利于生物醫(yī)學(xué)成像[19]。更重要的是，ICG 可在血液循環(huán)中迅速與白蛋白結(jié)合形成5~10 nm 大小的復(fù)合物，通過(guò)腫瘤組織特有的增強(qiáng)滲透與保留效應(yīng)在腫瘤組織中富集。

目前，ICG 已被用于多種腫瘤的術(shù)中導(dǎo)航切除，包括乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌等[5]。ICG 熒光融合影像技術(shù)可實(shí)時(shí)對(duì)腫瘤邊緣顯像，且有助于發(fā)現(xiàn)術(shù)前影像檢查未能發(fā)現(xiàn)的微小病灶。但由于其受穿透深度的限制，當(dāng)病灶深度超過(guò)1.3 cm 時(shí)難以檢測(cè)到熒光從而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。因此，綜合利用術(shù)前影像及術(shù)中熒光成像技術(shù)，可更全面地評(píng)估病灶情況。Kawakita 等[20]采用ICG 作為熒光探針，對(duì)肝癌肺轉(zhuǎn)移病人進(jìn)行了熒光成像術(shù)中導(dǎo)航病灶切除，在手術(shù)過(guò)程中通過(guò)觀察ICG 熒光來(lái)確定轉(zhuǎn)移灶的位置和邊緣；同時(shí)對(duì)切除的組織標(biāo)本進(jìn)行熒光成像來(lái)評(píng)估手術(shù)切緣是否陽(yáng)性。該研究結(jié)果表明ICG 熒光成像有助于識(shí)別腫瘤轉(zhuǎn)移灶，能夠輔助制定更高效的手術(shù)方案。Pan 等[21]應(yīng)用ICG 作為近紅外熒光對(duì)比劑，評(píng)估了近紅外熒光成像在口腔鱗癌術(shù)中檢測(cè)手術(shù)切緣的效果，研究首先進(jìn)行了細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)探索熒光成像識(shí)別手術(shù)陽(yáng)性切緣的可能性，然后納入了20 例口腔鱗癌病人，在手術(shù)過(guò)程中采集近紅外熒光圖像和定量熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)手術(shù)切緣，結(jié)果顯示，原發(fā)腫瘤切除后有4 例（4/20）切緣出現(xiàn)異常熒光信號(hào)，其中2 例經(jīng)病理證實(shí)為殘留腫瘤組織，結(jié)果表明近紅外熒光成像在口腔鱗癌根治術(shù)中有重要的輔助價(jià)值。

相比傳統(tǒng)的近紅外熒光探針（發(fā)射波長(zhǎng)：700~900 nm），近紅外二區(qū)（near infrared-Ⅱ，NIR-Ⅱ；發(fā)射波長(zhǎng)：1 000~1 700 nm）熒光探針的分辨率更高，更適用于活體成像。但是，包括半導(dǎo)體無(wú)機(jī)納米材料和小分子有機(jī)染料等現(xiàn)有的NIR-Ⅱ熒光對(duì)比劑，在臨床轉(zhuǎn)化方面都面臨著重大挑戰(zhàn)。然而，近紅外Ⅰ區(qū)（NIR-Ⅰ）染料（如ICG、IR-800CW 和IR-12N3）的光譜顯示了長(zhǎng)達(dá)1 500 nm 以上的發(fā)射波長(zhǎng)，可直接用于NIR-Ⅱ成像。因此，除了正在臨床試驗(yàn)中的NIR-Ⅱ熒光探針之外，重新利用NIR-Ⅰ染料，為NIR-Ⅱ成像的臨床轉(zhuǎn)化開(kāi)辟了一條捷徑[22]。Hu 等[23]首次應(yīng)用ICG 作為熒光對(duì)比劑，對(duì)肝癌病人進(jìn)行了NIR-Ⅱ熒光成像術(shù)中導(dǎo)航研究，取得了優(yōu)異的成果。該研究開(kāi)發(fā)了一種新型光學(xué)成像設(shè)備，能夠?qū)⒖梢?jiàn)光成像系統(tǒng)與NIR-Ⅱ和NIR-Ⅰ熒光集成在一起，使用ICG 作為熒光探針，對(duì)23 例肝癌病人進(jìn)行了熒光成像引導(dǎo)的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性肝癌手術(shù)切除。與NIR-Ⅰ成像相比，術(shù)中NIR-Ⅱ成像可提供更高的腫瘤檢測(cè)敏感度，使腫瘤與正常肝組織的對(duì)比明顯增強(qiáng)，腫瘤檢出率更高。因此，結(jié)合近紅外熒光和適合的熒光探針可能會(huì)帶來(lái)更好的熒光成像術(shù)中導(dǎo)航效果。

3 靶向熒光成像探針的制備及應(yīng)用

靶向分子成像探針可特異性靶向于腫瘤組織中的受體或分子，除了可視化常規(guī)解剖結(jié)構(gòu)以外，還可提供病灶分子信息，并有望通過(guò)提高早期癌癥診斷、腫瘤分期、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和指導(dǎo)治療的診斷性能來(lái)推進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展。熒光分子成像技術(shù)可實(shí)時(shí)、多通道地提供病灶組織中豐富的分子信息。

大多靶向熒光對(duì)比劑是由熒光染料和治療性單克隆抗體制備而成。此外，蛋白質(zhì)工程和藥物設(shè)計(jì)的進(jìn)步也促進(jìn)了靶向熒光對(duì)比劑的開(kāi)發(fā)。目前用于制備光學(xué)分子成像探針的靶向配體包括多肽、抗體、適配體、可特異性響應(yīng)于腫瘤組織的分子等，靶向配體從大分子到納米顆粒不等[24-25]。其中，適合于臨床轉(zhuǎn)化的靶向探針必須具備良好的生物相容性、特異性，可在腫瘤組織中長(zhǎng)時(shí)間滯留且從正常組織中快速清除，從而產(chǎn)生高信噪比成像效果。一般來(lái)說(shuō)，較小的分子具有良好的藥代動(dòng)力學(xué)特征，可更快地從體內(nèi)代謝；此外，探針的長(zhǎng)期穩(wěn)定性、活體內(nèi)完整性、易于制備和安全性也是探針評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。該成像系統(tǒng)應(yīng)該具備便攜、絕緣性、易于定位以及能夠在幾厘米的視野范圍內(nèi)提供微米分辨率的特點(diǎn)。

許多靶向熒光探針已經(jīng)開(kāi)發(fā)并正在進(jìn)行臨床評(píng)估。例如，葉酸受體α 靶向熒光探針葉酸-FITC13，c-MET 靶向光學(xué)探針GE-13714 和表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）靶向探針西妥昔單抗CW15[5,23]。此外，IRDye800CW是一種成像性能優(yōu)越的近紅外熒光染料，西妥昔單抗-IRDye800CW 靶向探針可靶向EGFR，能顯著提高癌癥病灶與正常組織的對(duì)比度。最近，西妥昔單抗-IRDye 800CW 和貝伐單抗-IRDye800CW（靶向VEGF）也已進(jìn)入靶向熒光成像術(shù)中導(dǎo)航的臨床試驗(yàn)[1]。值得注意的是，由于西妥昔單抗和IRDye800CW的結(jié)合，使其循環(huán)半衰期顯著縮短，快速清除單克隆抗體-染料結(jié)合物有助于降低背景信號(hào)，從而進(jìn)一步提高腫瘤組織成像的信噪比[26]。西妥昔單抗-IRDye800CW 熒光探針已被應(yīng)用于頭頸鱗狀細(xì)胞癌、膠質(zhì)瘤、胰腺癌的靶向熒光成像術(shù)中導(dǎo)航[27-29]；貝伐單抗-IRDye800CW 熒光探針被用于結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移瘤、乳腺癌、軟組織肉瘤等靶向熒光成像術(shù)中導(dǎo)航[30-31]；帕尼單抗-IRDye800CW 靶向熒光探針已被用于膠質(zhì)瘤、胰腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、胰腺導(dǎo)管腺癌的熒光成像術(shù)中導(dǎo)航[32-33]以及口腔鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移性和前哨淋巴結(jié)定位[34]。Zhou 等[32]應(yīng)用帕尼單抗-IRDye800CW 進(jìn)行了高級(jí)別膠質(zhì)瘤術(shù)中熒光成像導(dǎo)航，并開(kāi)展了臨床一期實(shí)驗(yàn)，首先評(píng)估了抗EGFR 抗體帕尼單抗-IRDye800CW在亞治療劑量下的安全性和可行性，然后對(duì)11 例高級(jí)別膠質(zhì)瘤病人注射低劑量（50 mg）或高劑量（100 mg）的帕尼妥單抗-IRDye800CW，并在術(shù)中進(jìn)行近紅外熒光成像，通過(guò)比較腫瘤和正常組織的平均熒光強(qiáng)度來(lái)確定最佳成像劑量；體外成像發(fā)現(xiàn)，可在體外檢測(cè)到5 mg 的腫瘤碎片，檢測(cè)閾值呈劑量依賴性。在組織切片中，帕尼單抗-IRDye800CW 檢測(cè)腫瘤組織的敏感度為95%，特異度達(dá)96%。帕尼單抗-IRDye800CW 在高級(jí)別膠質(zhì)瘤病灶部位富集，與EGFR 過(guò)度表達(dá)和血腦屏障受損相關(guān)，而正常腦組織只顯示出微弱的熒光。術(shù)中熒光改善了腫瘤組織的光學(xué)對(duì)比度，對(duì)比度、噪聲比分別為9.5±2.1 和3.6±1.1。這項(xiàng)基于不同劑量帕尼單抗-IRDye800CW的人體研究表明，帕尼單抗-IRDye800CW 用于高級(jí)別膠質(zhì)瘤病人熒光術(shù)中導(dǎo)航是安全可行的，且可增強(qiáng)腫瘤核心以及浸潤(rùn)性腫瘤邊緣的可視化。近年，基于IRDye800CW 的靶向?qū)Ρ葎┮驯粦?yīng)用于多項(xiàng)臨床試驗(yàn)（表1）[17]，證明了熒光成像術(shù)中導(dǎo)航的重要醫(yī)學(xué)價(jià)值。

表1 基于IRDye800CW 的靶向?qū)Ρ葎┯糜跓晒獬上裥g(shù)中導(dǎo)航臨床試驗(yàn)匯總

4 小結(jié)與展望

隨著分子成像技術(shù)的不斷改進(jìn)，熒光成像術(shù)中導(dǎo)航將朝著“精準(zhǔn)外科治療”的概念發(fā)展，術(shù)中導(dǎo)航可能會(huì)針對(duì)每例病人特定的疾病過(guò)程進(jìn)行個(gè)體化設(shè)計(jì)。盡管要實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)還需要做出更大的努力，但靶向熒光成像探針的數(shù)量、種類以及探針的性能和安全性都正在迅速提升，這為將來(lái)精準(zhǔn)醫(yī)療提供了更多的可能性。熒光成像術(shù)中導(dǎo)航仍面臨亟需解決的瓶頸問(wèn)題：首先，如何進(jìn)一步提高分子探針的靶向性及熒光的組織穿透能力，如何提供多維解剖結(jié)構(gòu)信息等。未來(lái)科研工作者需要發(fā)掘和探索更多腫瘤生物標(biāo)志物及其對(duì)應(yīng)的靶向分子，進(jìn)一步提高分子成像的特異性。其次，NIR-Ⅱ成像有更強(qiáng)的組織穿透能力，因此還需進(jìn)一步拓展完善用于術(shù)中導(dǎo)航的NIR-Ⅱ熒光染料。再次，成像手段需向多模態(tài)成像模式發(fā)展，以期在術(shù)中同時(shí)展示病灶三維解剖位置、周圍組織關(guān)系及分子信息，為術(shù)中導(dǎo)航提供更豐富的病灶信息。

綜上，熒光成像技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快速實(shí)時(shí)、安全無(wú)輻射，容易集成到不同的外科手術(shù)和介入治療中，具有良好的臨床推廣應(yīng)用前景，已經(jīng)顯示了輔助外科手術(shù)的潛力和改善臨床手術(shù)效果的可行性。雖然熒光成像術(shù)中導(dǎo)航技術(shù)取得了令人滿意的初步結(jié)果，但仍需要明確的療效研究、更多有潛力的新型靶向?qū)Ρ葎┮约跋冗M(jìn)的圖像處理軟件的研發(fā)來(lái)推動(dòng)該領(lǐng)域的快速進(jìn)步和臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。