大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記跟蹤及自體移植對骨折愈合的影響

雷栓虎 郭麗 管曉鸝 張霞 岳海源 周斌 劉京升 汪玉良

1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是干細(xì)胞家族的重要成員，主要存在于生物體的骨髓中。BMSCs 分化能力較強(qiáng)[1］，不僅可分化為造血細(xì)胞，還可分化為成骨細(xì)胞[2］、神經(jīng)細(xì)胞[3］等。BMSCs 取材方便，容易培養(yǎng)純化，可以作為良好的種子細(xì)胞[4］，通過細(xì)胞移植在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域發(fā)揮重要作用[5，6］，已有報(bào)道將BMSCs 用于治療多種疾病，例如骨發(fā)育不全癥、黏多糖癥等[7，8］。

骨折不愈合或延遲愈合在臨床中很常見，嚴(yán)重影響了患者的康復(fù)和生活。BMSCs 已經(jīng)證實(shí)在體內(nèi)外誘導(dǎo)培養(yǎng)下可以分化為成骨細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將自體染色標(biāo)記的BMSCs 移植于骨折部位，觀察其對骨痂形成的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雌性SD 大鼠，體重160～230g，6～8 周齡，SPF 級，購自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（動物質(zhì)量合格證號：SCXK 甘2013-0002），動物保護(hù)協(xié)議經(jīng)《蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物使用倫理委員會》批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 5-溴脫氧尿嘧啶核（BrdU）（Sigma 公司）、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma 公司）、IX70 倒置相差顯微鏡（Olympus 公司）、0.9 mm 的克氏針和微量注射器（上海醫(yī)用公司）、游標(biāo)卡尺（Mitutoyo corporation）、X 光機(jī)（型號：SIEⅧNS mX）、ABl04 一N 型電子秤（梅特勒公司），精確度0.01mg。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 BMSCs 的原代分離與培養(yǎng)[9，10］。取SD 大鼠一只，頸椎脫臼法處死，將大鼠移入超凈工作臺內(nèi)，無菌條件下取出雙側(cè)股骨和脛骨，用DMEM/F12 培養(yǎng)液沖洗股骨、脛骨骨髓，配制細(xì)胞懸液。按照細(xì)胞培養(yǎng)方法依次接種、培養(yǎng)、傳代。

1.3.2 BMSCs 的形態(tài)學(xué)觀察。鏡下觀察BMSCs 生長、增殖情況并記錄。

1.3.3 BMSCs 表面標(biāo)志檢測。0.25%的胰蛋白酶和1mm MEDTA 在37℃中孵育第三代BMSCs 3 到4min，然后按照1×105個/mL 的濃度接種。PBS 洗滌細(xì)胞后加入鼠單克隆抗體（抗CD34、抗CD44、抗CD45）在4℃的暗室中孵育30 min，PBS 洗滌2 次，離心棄上清液，加入PBS 重懸，用流式細(xì)胞儀檢測目標(biāo)細(xì)胞。

1.3.4 BrdU 的體外標(biāo)記與檢測。取第三代BMSCs，以1×105個/mL 的濃度接種于96 孔板中，在細(xì)胞生長融合前48h，以濃度為10μmol/L 的BrdU 標(biāo)記BMSCs，孵育至細(xì)胞融合，免疫組化染色。

1.3.5 DAPI 的體外標(biāo)記與檢測。取第三代BMSCs，以1×105個/mL 的濃度接種于96 孔板中，在細(xì)胞生長融合前30min，以濃度為20μg/mL 的DAPI 標(biāo)記BMSCs，孵育至細(xì)胞融合，測定DAPI。

1.3.6 MTT 法檢測細(xì)胞增殖力。加入20μL（5mg/mL）的MTT，在37℃下孵育4 小時后加入150μL 二甲基亞砜，輕輕晃動溶解細(xì)胞代謝產(chǎn)物，調(diào)零后檢測490 吸光度值。

1.3.7 動物模型的建立。SD 大鼠麻醉后仰臥位固定，左脛骨消毒，切開皮膚，在脛骨中斷逐層分離暴露，擺鋸橫行截?cái)嗝劰侵卸?，采用克氏針?biāo)鑳?nèi)固定骨折斷端，造模成功后逐層縫合關(guān)閉切口，術(shù)后石膏輔助固定。

1.3.8 實(shí)驗(yàn)分組與BMSCs 標(biāo)記移植。24 只SD 大鼠隨機(jī)分為三組（n=8），A 組為單純左脛骨骨折組，B 組為左脛骨骨折+DMEM 組，C 組為左脛骨骨折+BMSCs 移植組。術(shù)前兩周C 組取自體BMSCs，待模型建立兩天后，將BrdU 標(biāo)記好的BMSCs 配成細(xì)胞懸液，密度為1×107/mL，在骨折斷端周圍2mm 處注入50μL 細(xì)胞懸液。同時B 組局部注射等量DMEM。術(shù)后分別于1、2、3、4 周于左脛骨骨折部位取材，石蠟包埋后切片，行免疫組化檢測。

1.3.9 脛骨DR。分別于術(shù)后1、2、3、4 周拍攝左側(cè)脛骨正、側(cè)位片，游標(biāo)卡尺（精確度0.01mm）測量骨痂寬度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以±s 表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs 的分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增 實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞期初呈懸浮狀態(tài)，圓形，較為混雜，24h 后細(xì)胞開始貼壁，48h 換液后細(xì)胞形態(tài)呈多樣化，1 周后可見BMSCs 開始形成細(xì)胞克隆，呈梭形的鋪路石樣外觀。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80%左右時，進(jìn)行細(xì)胞傳代，傳至第三代時，細(xì)胞形態(tài)均勻、統(tǒng)一，呈長梭形。見圖1。

圖1 第三代BMSCs 形態(tài)學(xué)觀察（倒置相差顯微鏡×200）

2.2 流式細(xì)胞儀檢測BMSCs 免疫表型 培養(yǎng)至第三代的BMSCs 免疫表型分別為CD44 81.27%（圖2A）、CD34 2.32%（圖2B）、CD45 0.35%（圖2C）。結(jié)合BMSCs的生物學(xué)特性及免疫表型的表達(dá)結(jié)果，證明實(shí)驗(yàn)中成功分離出了高純度的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[11，12］。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測BMSCs 免疫表型

2.3 BrdU 染色標(biāo)記BMSCs 取生長狀態(tài)良好的第三代BMSCs，在細(xì)胞生長融合前48 h，以濃度為10μmol/L的BrdU 染色細(xì)胞。結(jié)果可見超過95%的BMSCs 陽性表達(dá)（圖3）。相差顯微鏡下觀察BMSCs，細(xì)胞生長良好。

圖3 BrdU 染色標(biāo)記BMSCs（倒置相差顯微鏡×200）

2.4 DAPI 染色標(biāo)記BMSCs 取生長狀態(tài)良好的第三代BMSCs，在細(xì)胞生長融合前30min，以濃度為20μg/mL的DAPI 染色細(xì)胞，結(jié)果可見超過98%的BMSCs 陽性表達(dá)（圖4）。相差顯微鏡下觀察BMSCs，見細(xì)胞生長良好。

圖4 DAPI 染色標(biāo)記BMSCs（倒置相差顯微鏡×200）

2.5 脛骨DR 骨痂測量 術(shù)后第1、2 周時A、B、C 三組骨折斷端骨痂較少，骨折線清晰可見（圖5），三組實(shí)驗(yàn)動物骨痂寬度無明顯差異（P＞0．05）；在術(shù)后第3、4周時，A、B、C 三組骨折線逐漸模糊，斷端有較多骨痂包繞，但C 組骨折斷端骨痂明顯多于A、B 兩組，骨小梁豐富，骨折趨于愈合，骨痂寬度較A、B 兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖6。

圖5 術(shù)后第三周三組DR 攝片

圖6 脛骨DR 骨痂測量

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是干細(xì)胞家族的重要成員之一，分離、純化的BMSCs 對生物組織工程及再生醫(yī)學(xué)具有重要意義。目前，BMSCs 分離、純化方法主要有密度梯度離心法[13］、貼壁細(xì)胞分離法[14］、流式細(xì)胞儀和免疫磁珠分離法（MACS）[15］。后兩種方法代價(jià)昂貴、操作復(fù)雜，難以廣泛開展，pittenger 報(bào)道的密度梯度離心法耗時較多，細(xì)胞損傷和污染發(fā)生率較高[16］，因而也較少使用。貼壁細(xì)胞分離法是根據(jù)干細(xì)胞黏附、貼壁的特性來剔除其他懸浮生長的雜細(xì)胞，該方法簡單、有效，多次傳代后可獲得純度較高的BMSCs。本次實(shí)驗(yàn)中，我們選用該方法來分離和純化BMSCs，效果良好。

BMSCs 的鑒定方法主要是通過檢測細(xì)胞免疫表型并結(jié)合其生物形態(tài)的特征來確定。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們檢測到目標(biāo)細(xì)胞CD44 表達(dá)陽性，而CD45 和CD34陰性，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)呈均勻的長梭形，因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明我們成功的分離、培養(yǎng)出了BMSCs[17］。

BrdU 是一種嘧啶類似物，其檢測準(zhǔn)確性高，標(biāo)記率高，安全簡便，BrdU 和靶細(xì)胞DNA 結(jié)合后經(jīng)過免疫組化染色可呈現(xiàn)綠色熒光。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們選用標(biāo)記時間為48 小時，終濃度為10μmol/L 的BrdU 染色靶細(xì)胞，其有效標(biāo)記率大于95%，同時MTT 檢測實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長狀態(tài)良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用BrdU 檢測跟蹤移植后細(xì)胞動態(tài)變化是一種很好的方法[18］。

DAPI 與目標(biāo)細(xì)胞的雙鏈DNA 結(jié)合后能產(chǎn)生比其自身強(qiáng)20 多倍的熒光，DAPI 也可以和RNA 結(jié)合，但產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度較弱。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們選用標(biāo)記時間為30 分鐘，終濃度為20μg/mL 的DAPI 染色靶細(xì)胞，其有效標(biāo)記率大于98%，同時MTT 檢測實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長狀態(tài)良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DAPI 是一種簡單、方便的細(xì)胞標(biāo)記方法，其標(biāo)記效率高，而且無細(xì)胞毒性[18］。

骨折的愈合是一個非常復(fù)雜的過程，臨床實(shí)際工作中，骨折不愈合或延遲愈合很常見，這嚴(yán)重影響了患者的康復(fù)鍛煉和早日回歸社會。BMSCs 已經(jīng)證實(shí)在體內(nèi)外誘導(dǎo)培養(yǎng)可以分化為成骨細(xì)胞。那么，將BMSCs移植在骨折處是否會促進(jìn)骨折的愈合。因此，本實(shí)驗(yàn)將自體染色標(biāo)記的BMSCs 移植于骨折部位，觀察其對骨痂形成的影響。

骨折的愈合不僅需要良好的固定、制動，同時與周圍神經(jīng)也有密切的關(guān)系[19，20］，周圍神經(jīng)通過釋放某些神經(jīng)介質(zhì)調(diào)節(jié)骨折的愈合過程。此外，骨折斷端的血運(yùn)條件對其愈合也很關(guān)鍵，有研究發(fā)現(xiàn)[21］神經(jīng)肽物質(zhì)CGRP 具有調(diào)節(jié)血管舒張，增加骨折斷端血運(yùn)，加速骨折愈合的作用。

BMSCs 可以分化為多種細(xì)胞[22］，既往許多自體骨髓移植動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：骨髓移植能促進(jìn)骨愈合[23］。本實(shí)驗(yàn)通過使用大鼠BMSCs 自體移植，探索其對骨折愈合的影響。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后第1、2 周時（血腫炎癥機(jī)化期），實(shí)驗(yàn)動物骨折斷端骨痂包繞較少，骨折線清晰可見，三組實(shí)驗(yàn)動物骨痂寬度無明顯差異，在術(shù)后第3、4 周時（骨痂形成塑形期），A、B、C 三組實(shí)驗(yàn)動物骨折線逐漸模糊，斷端開始逐漸有較多骨痂包繞，但C 組骨折斷端骨痂明顯多于A、B 兩組，骨小梁豐富，骨折趨于愈合，骨痂寬度較A、B 兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）自體移植對骨折愈合有積極促進(jìn)作用，其機(jī)制可能是BMSCs 在骨折處聚集，同時受到體內(nèi)環(huán)境及各種因子誘導(dǎo)，改變了成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞之間的動態(tài)平衡，從而影響了骨折愈合的進(jìn)程。但是，骨折愈合受諸多因素的影響，是一個極其復(fù)雜的過程，其具體修復(fù)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。