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    成都市人源沙門菌基因組特征分析

    2022-06-08 03:42:46武雅婷趙婉妤崔學(xué)文
    中國人獸共患病學(xué)報 2022年5期
    關(guān)鍵詞:沙門血清型毒力

    肖 穎,武雅婷,趙婉妤,2,崔學(xué)文,黎 明,許 欣

    沙門菌(Salmonella)是革蘭陰性人獸共患病原菌,與人類食源性疾病密切相關(guān)。近年來,由沙門菌引起的食源性疾病暴發(fā)事件與日俱增。2010-2018年,四川省食源性疾病暴發(fā)事件中,44.01%由沙門菌感染引起,其中成都市的發(fā)病人數(shù)居四川省首位[1]。了解成都市沙門菌的基因組特征對于監(jiān)測與防控沙門菌引發(fā)的食源性疾病具有重要意義,但目前未見成都市人源沙門菌全基因組分析及報道。

    沙門菌的血清型種類復(fù)雜,截止目前,世界范圍內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了2 659種不同的沙門菌血清型[2]。然而傳統(tǒng)的血清學(xué)分型方法工作量大、耗時長,全基因組測序(whole genome sequencing,WGS)作為一種快速且分辨率更高的方法,可通過測序數(shù)據(jù)預(yù)測血清型、分析耐藥基因與毒力因子等,國外已有學(xué)者將其運用在沙門菌的監(jiān)測與疫情調(diào)查中[3-5]。研究表明[6],WGS與常規(guī)血清學(xué)分型方法的符合率為97.6%,具有廣闊的應(yīng)用前景。

    因此,本研究對成都市35株人源沙門菌分離株進行全基因組測序,預(yù)測其血清型、耐藥基因及可移動遺傳元件(mobile genetic elements,MGE),注釋并分析其毒力因子及分布,以探究成都市人源沙門菌耐藥與毒力分子特征,為深入研究沙門菌致病機理、監(jiān)測與預(yù)防沙門菌感染提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 菌株來源 35株臨床沙門菌,分離自2020年5-6月的腹瀉患者糞便,菌株來自成都市青羊區(qū)(14株)、郫都區(qū)(7株)、成華區(qū)(4株)、金牛區(qū)(3株)、武侯區(qū)(2株)、天府新區(qū)(2株)、新都區(qū)(2株)、錦江區(qū)(1株)8個行政區(qū),菌株分離與收集由成都市疾病預(yù)防控制中心完成。利用VITEK 2 COMPACT 全自動微生物分析鑒定儀(法國BioMerienx公司)對菌株進行沙門菌鑒定。

    1.2 全基因組測序 收集到的沙門菌分離株送往中國科學(xué)院微生物研究所進行全基因組測序,流程如下:提取菌株DNA,使用Nanodrop檢測DNA基因組濃度與質(zhì)量,進行文庫構(gòu)建;使用IlluminaXten測序系統(tǒng)進行雙端150 bp測序;利用Fastqc、Trimmomatic對下機原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量檢測、統(tǒng)計;使用SPAdes的Unicycler短序列組裝軟件進行組裝,并根據(jù)reads中paired-end、overlap關(guān)系對組裝結(jié)果進行局部優(yōu)化;使用GapClose 1.1.2軟件對組裝結(jié)果進行修補,除去冗余序列獲得最終組裝結(jié)果。

    1.3 血清學(xué)預(yù)測與MLST分型 基于ZOOM TECH 微生物數(shù)據(jù)分析平臺(http://39.107.235.93:8080/#/login),使用SeqSero根據(jù)特定抗原的多態(tài)性完成血清型預(yù)測,使用PubMLST對分離株進行MLST分型。

    1.4 基因預(yù)測、注釋與分析

    1.4.1 基因組組分分析 使用 GeneMarkS 分析工具(http://topaz.gatech.edu/GeneMark/genemarks.cgi)預(yù)測沙門菌分離株編碼基因。

    1.4.2 耐藥基因預(yù)測、注釋與MGE分析 基于CARD(Comprehensive Antibiotic Research Database)數(shù)據(jù)庫對沙門菌分離株耐藥基因進行預(yù)測及注釋。利用Center for Genomic Epidemiology平臺的Mobile Element Finder分析工具(https://cge.cbs.dtu.dk/services/MobileElementFinder)預(yù)測菌株的可移動遺傳元件,包括質(zhì)粒與插入片段。

    1.4.3 毒力因子預(yù)測、注釋與分析 基于VFDB(Virulence Factor Database)數(shù)據(jù)庫對沙門菌分離株毒力因子進行預(yù)測及注釋。使用R 4.1.0軟件構(gòu)建毒力因子數(shù)目分析熱圖,對每個基因組的毒力因子數(shù)目進行Scale參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。

    2 結(jié) 果

    2.1 血清學(xué)預(yù)測與MLST分型 35株人源沙門菌分離株共預(yù)測出5種血清型(表1),其中I 4,[5],12:i:-血清型沙門菌最多(15株,42.9%),其次為鼠傷寒血清型(Typhimurium)沙門菌(12株,34.3%)。

    表1 35株沙門菌分離株血清型預(yù)測結(jié)果Tab.1 Serotype prediction results for 35 Salmonella isolates

    MLST分析共鑒定出5種ST型。如圖1所示,血清型預(yù)測與ST型結(jié)果對應(yīng)良好,I 4,[5],12:i:-血清型預(yù)測菌株除2株未在數(shù)據(jù)庫中查得所對應(yīng)的ST型,其余13株均為ST34型,鼠傷寒血清型(Typhimurium)預(yù)測菌株均為ST19型,腸炎血清型(Enteritidis)預(yù)測菌株為ST11型,德比血清型(Derby)預(yù)測菌株為ST40型,火雞血清型(Meleagridis)預(yù)測菌株為ST463型。

    “-”表示未在數(shù)據(jù)庫中查得所對應(yīng)的ST型。圖1 35株沙門菌分離株血清型預(yù)測與MLST分型結(jié)果對比Fig.1 Comparison between serotype prediction and MLST typing of 35 Salmonella isolates

    2.2 基因組組分分析 35株沙門菌分離株基于測序數(shù)據(jù)的基因組組分結(jié)果見表2,基因組范圍為4.7~5.2 Mb;GC含量為52%左右;編碼基因數(shù)量4 600~5 200 個,平均長度約 900 bp,總長度約占基因組的 88%。I 4,[5],12:i:-血清型沙門菌的基因組大小和編碼基因數(shù)目高于其他血清型菌株。

    表2 35株沙門菌分離株基因組組分預(yù)測Tab.2 Genome component prediction for 35 Salmonella isolates

    2.3 耐藥基因與MGE分析 35株沙門菌分離株基于CARD數(shù)據(jù)庫共預(yù)測到10類42種不同的耐藥基因(圖2),以氨基糖苷類耐藥基因(42.68%,102/239)最多,其中aac(6′)-Iaa攜帶率為100%(35/35)。不同血清型沙門菌的耐藥基因攜帶情況存在差異。I 4,[5],12:i:-沙門菌攜帶耐藥基因數(shù)目更多,且硫胺類sul2、四環(huán)素類tet(B)攜帶率為100%(15/15)。

    35株沙門菌分離株質(zhì)粒攜帶率為97.14%(34/35),單個菌株最多同時攜帶5個質(zhì)粒。共預(yù)測出17種不同的質(zhì)粒,包括IncQ1(40.00%,14/35)、IncFII(S)與IncFIB(S)(37.14%,13/35)、Col440I(22.86%,8/35)等。其中IncQ1質(zhì)粒只在I 4,[5],12:i:-沙門菌中攜帶,腸炎沙門菌和部分鼠傷寒(8株)均同時攜帶IncFII(S)和IncFIB(S)質(zhì)粒。MGE分析結(jié)果如表3,部分質(zhì)粒與耐藥基因關(guān)系密切,且存在插入序列。I 4,[5],12:i:-沙門菌攜帶更多的質(zhì)粒與插入序列,其攜帶的IncQ1質(zhì)粒(93.33%,14/15)與多種耐藥基因相關(guān)。

    表3 35株沙門菌分離株耐藥基因及相關(guān)可移動遺傳元件的攜帶情況Tab.3 Drug resistance genes and mobile genetic elements carried by 35 Salmonella isolates

    2.4 毒力因子分析 基于VFDB數(shù)據(jù)庫對35株沙門菌分離株的毒力因子注釋(Identity≥80),共檢出120種3 998個毒力基因,菌株毒力因子數(shù)目為103~123個(表4)。分泌系統(tǒng)相關(guān)的毒力因子數(shù)目最多,為76~79個。不同血清型的菌株之間毒力因子數(shù)目不同,I 4,[5],12:i:-、鼠傷寒和腸炎沙門菌的毒力因子數(shù)目大于其他血清型沙門菌。Spv、Pef、Rck毒力因子均只在13株沙門菌中存在,即全部的腸炎沙門菌和8株鼠傷寒沙門菌,且僅該8株鼠傷寒沙門菌保留GrvA毒力因子。僅德比和火雞沙門菌缺失SodCI毒力因子。Fim、Agf、Csg、Mgt、Inv、misL、avrA、Org、Ssa、ompA、mig-14、Ste、Sop等毒力因子在所有菌株中數(shù)目相等。

    表4 35株沙門菌分離株基因組VFDB毒力因子注釋個數(shù)Tab.4 Genome annotation numbers of virulence factors in VFDB for 35 Salmonella isolates

    毒力因子分布熱圖(圖3)所示,35株沙門菌基于毒力因子分布分成3簇,其中德比沙門菌單獨成簇,腸炎沙門菌和部分鼠傷寒沙門菌(8株)共同成簇,剩余鼠傷寒沙門菌(4株)與火雞、I 4,[5],12:i:-沙門菌共同成簇。鼠傷寒沙門菌均具有更高的鞭毛毒力因子,且呈現(xiàn)出兩種毒力因子分布,其中,部分鼠傷寒沙門菌(8株)呈現(xiàn)出更高的毒力質(zhì)粒、質(zhì)粒編碼菌毛、血清抗性3種毒力因子分布。腸炎沙門菌的毒力質(zhì)粒、質(zhì)粒編碼菌毛、血清抗性毒力因子分布與部分鼠傷寒沙門菌(8株)類似,但鞭毛毒力因子分布更少。德比沙門菌纖維粘附素相關(guān)毒力因子Lpf(Long polar fimbriae)分布低于其他血清型?;痣u、I 4,[5],12:i:-沙門菌毒力因子分布較為相似。

    圖3 35株沙門菌分離株毒力因子分布熱圖Fig.3 Virulence factor annotation heatmap for 35 Salmonella isolates

    3 討 論

    I 4,[5],12:i:-沙門菌是過去20年里世界范圍內(nèi)迅速出現(xiàn)的新亞型,被認(rèn)為是鼠傷寒沙門菌第Ⅱ相鞭毛蛋白不表達(dá)的變種[7]。國內(nèi)已有多地報道[8-10]I 4,[5],12:i:-為臨床沙門菌分離株的優(yōu)勢血清型,且在多種動物中發(fā)現(xiàn)該血清型沙門菌的流行率逐年增高[11-12],提示I 4,[5],12:i:-已逐漸成為人與動物沙門菌感染的主要血清型之一。本研究I 4,[5],12:i:-沙門菌主要為ST34型,這與國內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果一致[3,13]。

    本研究I 4,[5],12:i:-沙門菌耐藥基因以氨基糖苷類aac(6′)-Iaa、硫胺類sul2、四環(huán)素類tet(B)為主,這與目前國內(nèi)研究結(jié)果一致[13]。本研究幾乎全部I 4,[5],12:i:-沙門菌攜帶lncQ1質(zhì)粒,已有研究發(fā)現(xiàn)[14]lncQ1質(zhì)粒是sul2、aph(6)-Id耐藥基因的載體,可在不同來源的多種細(xì)菌中穩(wěn)定維持和轉(zhuǎn)移,這提示I 4,[5],12:i:-血清型可能存在該質(zhì)?;蚪閷?dǎo)的獲得性耐藥。此外,本研究MGE分析發(fā)現(xiàn)aadA1、cmlA1等耐藥基因與lncQ1質(zhì)粒相關(guān),且存在插入片段,其具體關(guān)系目前尚未得到充分研究與闡述,有待于進一步探明。

    Spv毒力質(zhì)粒(SalmonellaPlasmid Virulence)是沙門菌重要的毒力因子,其基因包括spvR、spvA、spvB、spvC和spvD[15],其中,spvB、spvC和spvR是沙門菌的毒力表型所必需的[16]。spvB具有細(xì)胞毒性作用,與沙門菌感染期間的宿主細(xì)胞晚期凋亡有關(guān)[17];spvC具有蘇氨酸裂解酶活性,可以抑制宿主細(xì)胞的MAP激酶信號[18-19];spvR對促進下游spvA、spvB、spvC和spvD基因的轉(zhuǎn)錄具有核心作用[16,20]。本研究中,spvB、spvC、spvR均只在腸炎血清型菌株和部分鼠傷寒血清型菌株中發(fā)現(xiàn)(37.1%,13/35)。這與目前研究結(jié)論一致[19,21],即只有腸炎和鼠傷寒沙門菌攜帶Spv毒力質(zhì)粒。研究表明Spv操縱子通常位于IncFII質(zhì)?;騃ncFII-InFIB雜交質(zhì)粒上[22],本研究同樣發(fā)現(xiàn)僅預(yù)測出Spv毒力基因的沙門菌攜帶IncFII(S)和IncFIB(S)質(zhì)粒。此外,本研究發(fā)現(xiàn),pefA、pefB、pefC、pefD、rck毒力因子也只在上述腸炎和鼠傷寒沙門菌中保留。Pef為質(zhì)粒編碼菌毛(Plasmid-encoded fimbriae)相關(guān)基因,可調(diào)節(jié)沙門菌對腸上皮細(xì)胞的粘附[23];Rck為血清抗性相關(guān)基因,與沙門菌抵抗補體殺傷作用有關(guān)[24]。一項體外實驗顯示沙門菌毒力與Spv、Pef、Rck毒力基因的攜帶呈正相關(guān)[21]。Spv與Pef、Rck毒力因子可能存在協(xié)同致病機制,值得在轉(zhuǎn)錄組和蛋白組進一步研究。

    SodCI毒力因子是Cu-Zn 超氧化物歧化酶,被認(rèn)為有助于沙門菌在巨噬細(xì)胞中的生存[25],且是鼠傷寒沙門菌發(fā)揮毒力所必需的[26]。本研究中,SodCI毒力因子在鼠傷寒、腸炎、I 4,[5],12:i:-沙門菌中保留,德比和火雞沙門菌缺失,這與Kuijpers等[21]的結(jié)果一致,SodCI毒力因子可能與這些沙門菌的較強致病力有關(guān)。

    本研究系首次采用WGS技術(shù)對成都市人源沙門菌進行分型、耐藥基因與毒力因子注釋及分析,描述其基因組特征,豐富了該地沙門菌監(jiān)測數(shù)據(jù)庫,在基因水平為研究沙門菌耐藥、毒力機制提供了資料,其致病機理還需在基因組、轉(zhuǎn)錄組與蛋白組不斷探究及驗證。

    利益沖突:無

    引用本文格式:肖穎,武雅婷,趙婉妤,等. 成都市人源沙門菌基因組特征分析[J].中國人獸共患病學(xué)報,2022,38(5):433-440,446. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.059

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